湘雅分子生物学PBL

1、 蛋白质印迹法 蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳 检验检验13011301潘萌萌潘萌萌蛋白质印迹法蛋白质印迹法（western-blot)基本原理器材、试剂实验步骤基本原理 通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原。 还还原型原型细胞色素细胞色素P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450nm处有一特异吸收峰。 常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDSPAGE）法）法分离蛋白质

2、。SDS是一种阴离子去污剂，它能与绝大多数蛋白质结合，结合后蛋白质将带上等量的负电荷，同时结合后蛋白质的分子构象发生改变，此时蛋白质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。 分离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体固相载体上（如硝酸纤维素膜）。用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为牢固，不易被后续的洗膜等操作洗脱。基本原理 所用的探针探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体第一抗体（简称一抗），较难大量获得该抗体，使得对其进行标记很困难。能与一抗结合的抗体，为第第二抗体

3、二抗体（简称二抗）。二抗将一抗的FC段作为抗原，而每一物种的抗体FC段氨基酸序列都较为保守，这使得二抗能够大量生产，因而对二抗进行标记也就较为容易了。二抗与一抗能通过抗原抗体特异性结合后，以一定的方法对二抗上的标记进行，检测便可检出靶蛋白。器材、试剂器材：器材：电热水浴箱、玻璃匀浆器、冷冻离心机、滤纸、水平摇床、电转移装置、醋酸纤维素膜（NC膜）、电泳仪、试管、微量移液器、Tip头、Epp管（2ml、5 ml、1.5 ml）试剂：试剂：1.5M TrisHcl, pH8.8；1.0M TrisHcl, pH6.8；10SDS； 10TBS（Tris buffer solution）, pH7.

4、6；TBS-T，pH7.6；5电泳缓冲液，pH8.3；转移缓冲液（25mM Tris、 192 mM甘氨酸、20甲醇），pH8.3；10mM PMSF液；裂解缓冲液；PBS；10过硫酸胺（APS）；1溴酚蓝；30%丙烯酰胺；Sample Buffer（上样缓冲液）实验步骤1. 样品制备样品制备小鼠禁食过夜，断头处死，迅速剖开腹腔，取出肝、肾分别称重按1g组织中加入冰预冷的10 ml裂解液，10mM PMSF 1ml 冰上制成10的组织匀浆取1ml匀浆20000g，4、离心30分钟小心吸取上清液取少量上清液进行蛋白定量，余下的-20保存备用2.蛋白质定量（考马斯亮蓝染色法） 考马斯亮蓝考马斯亮蓝

5、G250 是一种蛋白质染料，最大吸收峰在465nm,当它与蛋白质以范德华力结合形成考马斯亮蓝G250蛋白质复合物，其最大吸收峰改变为595 nm，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。按下表操作。 绘制标准曲线，计算测定管的浓度3.制SDS-PAGE胶装配好制胶玻璃板配制12的分离胶，再加入APS和TEMED将上述溶液缓慢注入制胶玻璃片至梳齿下1cm,操作中注意防止产生气泡，聚胶30分钟后用ddH2O完全洗净封闭液按下列配方配制5的聚集胶，再加入APS和TEMED注入聚集胶前，用滤纸吸干分离胶上的水。缓慢注入聚集胶，过程中注意防止产生气泡。插入梳齿，聚胶30分钟后小心拔除

6、梳齿用ddH2O清洗梳孔，放入电泳槽备用4.样品处理 用Sample Buffer 按1：1稀释样品 95加热变性5分钟5.上样及电泳：将电泳槽内注满1电泳缓冲液，彻底除去点样孔中和胶底的气泡。两边空白的泳道点上等量的 Sample Buffer ，上样量（20l含40g蛋白）向电泳外槽内注入1电泳缓冲液，盖上盖子，电泳开始时电压为80V，染料进入分离胶后，将电压增加到120V，稳压，当染料抵达分离胶底部约80分钟，断开电源。6.转膜剪6块滤纸和一块NC膜，其大小与胶相同将滤纸预先在转移缓冲液中浸泡5分钟，除去气泡。凝胶电泳完成后取出。按照海绵海绵3块滤纸块滤纸凝胶凝胶NC膜膜另外另外3块块滤

7、纸滤纸海绵海绵的顺序依次放，应避免气泡。用塑料支架夹紧上述各层，放入转移内槽及外槽，注入冰预冷的转移缓冲液。注意NC膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。转移200mA稳流，4，1.5小时。NC膜膜7.封闭NC膜转移完成后，取出膜放在滤纸上，用铅笔标好正面，室温干燥数分钟。用western blotting封闭液封闭NC膜，室温下振荡1小时后4过夜（NC膜正面向上）8.一抗结合一抗用封闭液配制（按1：20（CYP1A1）及1:200(-actin)配制）室温振摇2小时（NC膜正面向上）以TBS-T洗膜3次，每次5-10分钟9.二抗结合二抗以TBS-T稀释（按1：600配制）室温振摇孵育1.5小时（NC膜

8、正面向上）以TBS-T洗膜3次，每次5-10分钟10.显色：辣根过氧化物酶显色 在试管中先加入1mlHRP反应缓冲液，然后依次加入试剂A500l、试剂B500l、C500l混匀即可。 配制好的溶液应避光存放，30min内使用，染色为褐色。 室温下染色时间为530min，可根据颜色变化掌握染色时间。 等目的条带显色后，用少量PBS清洗。11.照相保存，凝胶图象分析 CYP1A1的分子量为56Kda，-actin的分子量为43Kda蛋白质双向电泳实验原理蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚等电聚焦焦（Isoelectrofocusing,IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-SDS

9、-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-SDS-PAGEPAGE），按亚基分子量大小进行分离。经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。简介双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳，其特点是在凝胶中加入一种两性电解质载体，从而使凝胶在电场中形成连续的pH梯度。蛋白质是典型的两性电解质分子，它在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向电场

10、的正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。这种泳动只有在等于等电点的pH环境中才停止。如果在一种pH梯度的环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，那么在电场作用下，不管这一群混杂的蛋白质分子原始分布如何，各蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度相对应的位置进行聚集经过一定时间后，不同的蛋白质组分便分割在不同的区域之中。这个过程称作等电聚焦蛋白质聚集的部位蛋白质所带电荷为零，测定此部位的pH值，即可知该蛋白质的等电点。主要用于测定蛋白质亚基分子量，SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能段裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级

11、和三级结构。强还原剂则能使半光氨酸残基之间的二硫键段裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，分子被解聚成它们的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有电荷的差异。因此这种胶束在SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。实验器材和试剂1、凝胶原液（28.38%Acr +1.62%Bis）。2、TEMED原液。3、过硫酸铵。4、pH3.510、pH

12、46、pH68两性电解质载体。5、尿素。6、10%非离子去污剂NP-40。7、50mmol/L NaOH；。8、25mmol/LH3PO4 。9、SDS。10、60mmolTris-Cl pH6.8。11、2-巯基乙醇。12、10倍SDS-PAGE电极缓冲液（0.25mol/L Tris-HCl,1.92mol/L 甘氨酸，1%SDS）。13、0.05%溴酚蓝。14、1%琼脂。15、蛋白质抽提液（30mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/LMgCl2,6mmol/L抗坏血酸，1%PVP，5%甘油，0.02% 2-巯基乙醇）。16、丙酮。17、研钵，石英砂，烧杯，试管，玻棒

13、，量筒。18、双向电泳槽一套（包括圆盘电泳槽和垂直板状电泳槽等），电泳仪 Sephdex聚葡萄糖凝胶 THMED液四甲基乙二胺等电聚焦系统电泳槽实验方法电泳视频医学中的应用研究蛋白质组学最关键的技术之一研究蛋白质组学最关键的技术之一目前病原微生物蛋白质组学和肿瘤蛋白质组学的研究正在兴起，而双向电泳技术是研究蛋白质组学最关键的技术之一，广泛应用于生物医学领域的研究工作，如通过寻找差异蛋白质，发现疾病相关的蛋白质，寻找用于诊断的疾病相关标记分子，寻找疾病相关的蛋白质药靶，以用于药物设计，研究疾病的致病机理等。随着蛋白质组学相关技术的发展，如液相，蛋白质芯片结合技术的应用，蛋白质组学必将得到进一步的

14、发展，并在疾病的发病机制、诊断和治疗方面发挥重要的作用。蛋白质组双向电泳技术为人类疾病，特别是恶性肿瘤的早期诊断和治疗方面已显示出了广阔的前景，必将造福于人类。医学中的应用肿瘤耐药性的研究肿瘤耐药性的研究朱蓉在硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立及其耐药机制研究中采用双向电泳及质谱鉴定技术，分析差异蛋白的表达情况。并选取其中部分差异蛋白，采用westernblot技术进行验证。留取临床患者原代标本，进行westernblot检测，进一步验证双向电泳结果，并分析差异蛋白与硼替佐米耐药的相关性。通过比较分析抗肿瘤前后的双向电泳蛋白图谱，可以找到与肿瘤耐药性有关的蛋白。医学中的应用研究微生物相关蛋白研究微生物相关蛋白马翔宇在新型多价大肠杆菌噬菌体285P分离鉴定及功能基因组学研究中提到，噬苗体285P经纯化浓缩的样品进行双向电泳，结合SDSPAGE电泳、双向电泳及质谱分析技术，并和基因组学数据相互佐证，确定