紫外分光光度法

1、 紫外分光光度法 检测山楂总黄酮方法的建立 作者：张 雪 , 丁长河 期刊：食品工业科技2007年第7期 汇报人：宋慧军2摘要摘要 有关总黄酮的测定方法有有关总黄酮的测定方法有: 戴维斯法、薄层层析- 比色法、微分脉冲极谱法、硝酸铝显色法、紫外分光光度法等。 缺陷：缺陷： 鲜山楂果胶含量达 3.0%以上, 但上述方法均忽略了山楂果胶对总黄酮含量的影响。 本实验内容及目的本实验内容及目的 ：本实验针对上述检测方法存在的问题, 根据现有条件对硝酸铝显色- 分光光度法进行改进, 以芦丁为标准品,利用果胶酶将山楂果肉中的果胶分解后, 再进行黄酮的含量分析, 减少果胶对检测黄酮的影响, 建立起建立起更加

2、精确的紫外分更加精确的紫外分光光度法山楂总黄酮分析系统光光度法山楂总黄酮分析系统, 旨在为山楂总黄酮的定量及生物功能评价提供检测旨在为山楂总黄酮的定量及生物功能评价提供检测方法方法31 材料与方法材料与方法 1.1 材料与仪器材料与仪器芦丁对照品 ( Quercetin 3 - D- rutinoside) 中国药品生物制品检定所; 山楂鲜果 北京市密云县产,色泽鲜红, 无病虫害; 果胶酶 活力: 20000u/g, 天津市利华酶制剂厂; 1N NaOH 溶液, 5%NaNO2 溶液, 10%Al(NO3)3 溶液。 YP1200 电子天平, 手持糖度计, 电热恒温水浴锅 , 722S 分 光

3、 光 度 计 , TGL- 16C 离 心 机 , PHS- 25 酸度 计 , 裹 包 式 榨 汁 机 , 自 动 电 位 滴 定 计 , Biorad SmartspecTM3000 Spectrophotometer 紫外分光光度计( 美国伯乐公司) , FA1004 万分之一分析天平 ( 上海精密仪器厂) , GL- 20B 冷冻离心机( 上海安亭科学仪 器厂) 。41.2 实验方法实验方法 1.2.1 实验原理 ： 黄酮化合物的母核(图 A)由 C6- C3- C6 即 A- C- B 三个环组成, A 环和 B 环具有芳香化合物的性质, C 环具有黄酮化合物的独特性质。 母核中某些

4、位置如母核中某些位置如 C3 和和 C5 上含有羟基时能与铝、铅等金属离子形成稳定的络合物上含有羟基时能与铝、铅等金属离子形成稳定的络合物, 这些络合物在光谱上产生这些络合物在光谱上产生明显变化。明显变化。 黄酮与金属离子的这种作用不仅可以用于鉴别这类成分中羟基的位置, 还可以作为进行定量分析的基础进行定量分析的基础。 本实验就是采用这种原理本实验就是采用这种原理, 通过通过 Al3+与黄酮形成鲜黄色的络合物与黄酮形成鲜黄色的络合物( 图图 B, 图图 C) 在最在最大吸收波长处有一吸收峰然后比色测定而进行定量的。大吸收波长处有一吸收峰然后比色测定而进行定量的。51.2.2 标准溶液配制标准溶

5、液配制精密称取芦丁对照品 10.03mg,加 60%甲醇适量, 置水浴中加热溶解, 放冷, 以60%甲醇定容于 100mL 容量瓶中, 摇匀备用, 配成芦丁含量为 0.103mg/mL 的工作液, 备用。1.2.3 标准曲线建立标准曲线建立1.2.3.1 最佳检测波长选择最佳检测波长选择 取芦丁标准溶液于 400600nm 范围内进行扫描, 确定黄酮的最大吸收波长。结果为510nm（文献当中没有给图）1.2.3.2 标准曲线建立标准曲线建立 精确吸取浓度为 0.103mg/mL的 芦 丁 标 液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL, 置 于25mL 容量瓶中, 准确加入 5

6、% NaNO2 溶液 1mL 摇匀, 放置 5min, 再准确加入 10% Al( NO3) 3 溶液 1mL摇匀, 放置 6min, 然后加入 4mL 1N NaOH 溶液, 最后用 30%乙醇稀释到刻度, 于温水浴中加热 10min 取出, 用 1cm 玻璃比色皿在 510nm 处测定吸光度 A,同时以未加标准芦丁的溶液作空白参比。 以吸光度对标样含量毫克数作图以吸光度对标样含量毫克数作图。经线性回归表明, 芦丁在 00.618mg范围内呈良好的线性关系, 达到显著水平。 典型的标准曲线如图 所示。 回归方程为 Y=1.2389X+0.0039(r=0.9998, =0.01)。6 1.2

7、.4 样品测定样品测定 1.2.4.1 样样 品品 液液 制制 备备 方方 法法 称 取 山 楂 鲜 果 约 50g 八份, 拣选、清洗后加蒸馏水 125mL, 浸泡 0.5h 后加热软化至 90, 用组织捣碎机打碎成匀浆, 冷却恒温至45后, 其中四份直接榨汁, 然后离心、过滤后定容至150mL 备用; 取另外四份加 0.07%的果胶酶, 45恒温酶解 4h, 将已经过酶解处理的样品 90、15min 加热灭酶, 然后榨汁, 离心、过滤后定容至150mL 待用。比较酶处理与非酶处理的结果。比较酶处理与非酶处理的结果。 1.2.4.2 样品液测定方法样品液测定方法 精确吸取样液 5mL 两份于

8、2 支 25mL 容量瓶中, 加 5% NaNO2 溶液 1mL 摇匀,放置 5min, 再准确加入 10% Al (NO3)3 溶液 1mL 摇匀, 放置 6min, 然后加入 4mL 1N NaOH 溶液, 最后用30%乙醇稀释到刻度, 于温水浴中加热 10min,取出,同时作试剂空白, 以试剂空白为对照, 于芦丁最大吸光值处测定吸光度 A, 查标准曲线, 即得所取样液中黄酮含量。 1.2.4.3 样品中黄酮含量计算方法样品中黄酮含量计算方法 样品中黄酮含量( 以芦丁计) ( %) =CV1/WV2; 式中: C- 样液含黄酮量( mg) , V1- 定容体积( mL) , V2- 显色反

9、应测定取用样液体积( mL) , W- 称样量( g) 结果：山楂原料中总黄酮含量为结果：山楂原料中总黄酮含量为 0.92%。7 每一组酶处理的山楂总黄酮含量都要比非酶处理的高出高出 2% 3%, 表明酶处理后再进行榨汁, 山楂总黄酮含量有明显的提高, 同时也说明果胶的存在有碍于总说明果胶的存在有碍于总黄酮的充分释放。黄酮的充分释放。 Pitifer,L.A.等人8认为, 果胶酶作用于果胶含量高的水果能提高果蔬汁的营养物质的含量。 这一结论与本实验结果一致。8 2.2 显色稳定性实验显色稳定性实验 取芦丁标准溶液和酶解处理的山楂样品液, 随着放置时间的推移, 于 1.2.4 样品液测定条件下每

10、20min 测定其吸光度, 共 6 次, 分析测定总黄酮含量,并计算标准偏差、相对标准偏差, 结果见表 1。标准液与样品液中总黄酮含量的 RSD 均在均在 5%以下以下, 表明芦丁标准溶液与山楂样液 2h 显色很稳定。9 2.3 精密度和准确度验证 精 密 吸 取 芦 丁 标 准 溶 液 和 酶 处 理 的 山 楂 样 品液, 重复测定 6 次, 分析总黄酮含量, 六次测定结果平 均 值 分 别 为 : 0.011% 、0.3% , 相 对 标 准 偏 差 为 :2.16%、3.2%, 标准溶液与样液黄酮含量的标准溶液与样液黄酮含量的 RSD 均在均在5%以下以下, 表明本实验具有良好表明本实验具有良好的重现性的重现性, 条件合理。条件合理。 2.4 加样回收率实验 称取以上样品各数份, 分别添加适量标准, 按前述操作进行处理, 测定, 以加样测得量减去原样含量, 除以加样量, 计算回收率, 结果见表 2。精密度( 重复测定样品的 RSD) 5%, 平均回收率 98.4%, 达到了准确测定山楂中黄酮含量的要求。103 小结小结 本实验根据现有条件