理学肿瘤基因组和基因芯片

1、肿瘤的研究 美国1971年颁布国家癌症条例开始抗癌大战 使癌症成为“慢性病”Concept of Neoplasm（瘤）“ is an abnormal mass of tissue, the growth of which exceeds and is uncoordinated with that of the normal tissues, and persists in the same excessive manner after cessation of the stimuli which evoked the change”Willis, 1952Basic Biologic F

2、eatures of NeoplasmsDifferentiationAbnormal ProliferationAngiogenesisInvasionSenescenceApoptosisNeoplasms Evolve in Multiple Steps Initiation: presumably occurs through irreversible or stable damage to DNA Promotion: an process bringing about a clonal expansion of initiated cells Progression: result

3、s when genetic instability leads to further mutagenic and epigenetic changes肿瘤的发生（Initiation） Tumor initiation：Cooperative DNA lesions as common final pathway Precancerous and incipient（初始 的） lesions Molecular targets：Oncogenes, tumor suppressor genes & DNA repair genes肿瘤的促进（promotion）Expansion

4、of initiated cellsRepetitive processInitiation & Promotion 致癌剂 肿瘤促进剂 低黄曲霉素B1Aflaloxin B1，高杀草强Amitrole，砷和其化合物Arsenic & compounds，高三氧化二砷Arsenic trioxide，高三硫化砷Arsenic trisulfide，高石棉Asbestos 癌基因（如myc 、ras） 需要反复刺激Initiation & PromotionTimeNo tumorNo tumorNo tumorNo tumorTumorTumor= Promoter=

5、InitiatorGr. 1Gr. 2Gr. 3Gr. 4Gr. 5Gr. 6Initiation & PromotionTarget Genes肿瘤的发展（progression） 肿瘤组织浸润相邻组织 淋巴结转移和血道转移 远端转移Apoptosis and Tumorigenesis小 结 肿瘤发生发展的三个阶段基于基因表达谱的分子分型 为什么提倡利用分子水平进行肿瘤的分型？肿瘤的一般临床学知识 肿瘤的诊断肿瘤的临床分期（stage）肿瘤的临床分级（grade） 肿瘤的治疗放疗化疗辅助治疗靶点治疗肿瘤的临床分期(stage) TNM分期 肿瘤的大小(T, tumor size)

6、肿瘤是否发生临近的淋巴结转移(N, node) 肿瘤是否有远处转移(M, metastasis)乳腺癌 分 期 Tis Carcinoma in site T1 Tumor 2.0 cm in greatest dimension T2 Tumor 2.0 cm 5.0 cm in greatest dimension T3 Tumor 5.0 cm in greatest dimension T4 Tumor of any size with direct extension to chest wall or skin N0 No regional lymph nodes metastasi

7、s N1 Metastasis to moveable ipsilateral axillary node(s)(同侧腋下淋巴结) N2 Metastasis to ipsilateral axillary node(s) fixed to one another or other structures N3 Metastasis to ipsilateral internal mammary node(s) M0 No distant metastasis M1 Distant metastasis (includes metastasis to ipsilateral supraclavi

8、cular（锁骨） lymph node(s)Stage 0 Tis N0 M0Stage I T1 N0 M0Stage IIa T1 N1 M0 T2 N0 M0Stage IIb T2 N1 M0 T3 N0 M0Stage IIIa T1,2 N2 M0 T3 N1,2 M0Stage IIIb T4 Any N M0 Any T N3 M0Stage IV Any T Any N M1问题：这样的分期是否准确反映了病人的预后情况？肿瘤的临床分级(grade) 分级指标: 细胞的异常形态，细胞的恶性生长速度。 肿瘤细胞生长的分级: 1 到 3分别对应级别的低，中，高，在临床上常称为高分

9、化，中分化，低分化。级别越低，预后越好。级别越高，对放疗和化疗的敏感度也较强。 肿瘤细胞与来源器官中细胞的相似程度，分化良好的细胞有高度的特化特点，组织结构清晰，很容易辨认。低分化的细胞组织结构不清，很难辨认。肿瘤的病理学诊断方法 冰冻切片和石蜡切片的染色和组织化学方法：确定肿瘤细胞的分化程度；鉴别肿瘤的类型；研究肿瘤组织发生 流式细胞术定量诊断（肿瘤细胞核形态参数）：癌（瘤）细胞DNA含量的检测；良性病变多为二倍体；恶性肿瘤多为非整倍体 问题：单基因的组织化学检测是否能准确反映肿瘤类型及分化程度？肿瘤的传统检测 传统的肿瘤解剖分期(包括肿瘤大小、淋巴结转移数目，TNM)对于预测肿瘤的复发转移

10、价值不可低估，是临床上较成熟的风险评估指标。 传统的组织病理诊断：以组织形态、免疫组织化学染色；通常以单一基因的不同表现对肿瘤作出诊断。 问题：组织病理学上看起来一样的肿瘤，其自然发展史、生物学行为以及对治疗的反应和预后等都会有所不同。从活检标本上看都象是肿瘤的两个病人，他们都有肿瘤灶，你可以说它们看起一是一样的，但事实上，一位病人已在别的部位有恶性生长了。肿瘤的化疗 化疗对分裂细胞有效，但肿瘤细胞不是体内唯一具有分裂能力的细胞，所以化疗对正常分裂的细胞有一定的伤害。肿瘤的放疗 放疗对旺盛生长和分裂的细胞有效。由于肿瘤细胞比起正常细胞在基因组上不稳定，所以对放疗的敏感度高于正常细胞，同时由于正

11、常细胞具有完善的修复系统，比较耐受放疗。肿瘤的辅助治疗 根据肿瘤的特殊性质而制定的治疗方法，如激素治疗 也有把放疗，化疗结合激素治疗的方法称为辅助治疗肿瘤的靶点治疗 根据在肿瘤发生发展中具有重要意义的靶点基因而研制成的药物，如乳腺癌的治疗靶点基因HER2，肺癌的靶点基因EGFR肿瘤治疗中存在的问题 放疗，化疗，激素治疗的耐受 过度治疗？基因芯片在肿瘤研究中的应用 应用DNA微阵列技术和多基因RT-PCR定量检测方法来预测乳腺癌的复发转移风险及其对治疗的反应，取得一定突破。还存在诸如检测方法的可重复性、肿瘤标本的取材标准、统计学分析以及检测结果核查的标准化等问题。 Ntzani和Ioannide

12、s在总结1995年到2003年4月MEDLINE共84篇关于此类技术的论文后发现,只有30篇涉及临床结果,他们提出,DNA微阵列技术还需大规模前瞻性临床试验证实,同时应与现有的一些已知预测因子联合进行比较,最后作出谨慎的审核与决定。 Stanford大学的Patrick Brown认为：有用的诊断图谱肯定会出现的，“当二个生物标本的差异足以引起我们的重视时，那么肯定在它们的基因表达上也有相应的差异 一旦候选基因图谱被确定，并集中到几个关键基因上，就可利用简单的技术如PCR针对较大的人群中对有效的、重复产生的改变进行检测。如果一个基因在表达上的改变能重复出现，则这个基因就可用作基因诊断标记物 基

13、因芯片在肿瘤研究中的应用 肿瘤的生物学指标(包括组织学分级、biomarker、增殖指标等)不仅能够判断肿瘤的预后，还能够预测肿瘤对治疗的反应，并为肿瘤的个体化治疗提供依据。 价值超过了解剖分期，是目前临床研究的方向与重点之一。肿瘤的分子分型（分子诊断）1.肿瘤的分级2.肿瘤的分期，预后3.肿瘤放疗化疗或激素治疗耐受4.肿瘤靶向转移（肿瘤形成转移的能力依赖于多种基因的联合作用，肿瘤转移的每个器官都需要不同组的基因）。肿瘤的分类：用表达图谱区分出所检测的标本是正常组织还是肿瘤；若是肿瘤，又能区分出是良性还是恶性。运用基因芯片得到的Biomarker可用于肿瘤的早期诊断基因芯片在肿瘤研究中的应用白

14、血病的分类 肿瘤分类学在过去的30多年间进步不少，但是在鉴定新的肿瘤类型（class discovery）和肿瘤分类（cancer classification）还缺乏通用的方法 急性白血病的分类方法：核的形态学分析，酶学免疫组化，染色体易位分析，任何一个分析都需要非常有经验的医师进行详尽的检查以及分析，需要专业的实验室来完成，但没有一个单独的测试能够足以用于诊断 传统的分类方法的联合运用，一般而言比较准确，但仍旧会出错运用基因芯片表达谱对急性白血病分类 寻找在基因表达水平与预测ALL和AML密切相关的分子群 运用这一分子群，看如何能将已知分类的样本进行准确的分类预测，即寻找能进行分类的基因群

15、（class predictor）（training set） 用新的样本群检测class predictor的准确性(test set)Precise Classification of Cancer is the First Step in Rational TreatmentGene Expression Profiles Science 286:531 (1999)Distinguishing between acute lymphoblastic leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (AML) is crucial because th

16、eir therapies are different.RNA from 38 bone marrow samples were hybridized to Affymetrix chips containing probes for 6,817 genes.The expression profiles of 50 genes clearly differentiate between the two types of cancer.乳腺癌的预后分类与治疗 同一分期的乳腺癌病人在治疗的反应和总体的治疗结果上有很大差异 传统的用淋巴结状态和组织化学检测的方法无法准确判断肿瘤的临床表现 化疗和激

17、素治疗可以降低远处转移的风险约三分之一 7080的病人不经过化疗等手段预后仍较好Gene Expression Signatures for Breast CancerApplication: Gene ExpressionIdentifying gene expression signature that reflects biological behavior of a tumor(预后好与预后差)70-gene prognostic profile tested295 breast cancer samplesoutperformed all clinical variables for

18、 predicting patient survivalMicroarray classifiers to direct customized therapyStarting point for targeted and rational drug developmentSupervised classification on prognosis signaturesPredict clinical outcomePrognosis of additional 19 patientsResults n231 genes were significantly associated with th

19、e disease outcomen70 genes were further selected to be optimal marker genenPrediction accuracy 80% 开发公司：Agendia芯片名称：MammaPrint(R)Agendia Receives U.S. FDA Clearance For MammaPrint Breast Cancer Diagnostic TestAgendia announced that the U.S. Food and Drug Administration (FDA) has cleared the companys

20、 MammaPrint breast cancer diagnostic test. MammaPrint is a gene expression profiling service to assess the risk of recurrence in breast cancer patients. MammaPrint represents a U.S. regulatory milestone as the first In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay (IVDMIA) to acquire market clearance fr

21、om the FDA, and is the agencys first step toward standardizing these multi-gene expression tests. DNA阵列杂交结果最直接的影响是诊断；杂交结果中可以得到药物靶标基因，可为最后治疗癌症打下基础 挑战：随着实验技术及仪器的不断改进和基因组数据的急剧增长，基因芯片产生的各种基因表达数据，规模庞大，内容复杂；如何分析挖掘数据成为生物信息学中的挑战性课题。 利用芯片检测肿瘤组织中基因表达谱将成为研究肿瘤的一种标准方法。基因芯片在肿瘤研究中的应用小 结 目前肿瘤诊断和治疗中存在的问题 利用基因芯片进行分子分

22、型其他基因芯片类型在肿瘤研究中的应用miRNA芯片CGH芯片甲基化芯片等miRNA芯片microRNA microRNA(miRNA)是20 24nt的单链 RNA, 在进化上具有高度的保守性，它通过与靶mRNA 不完全互补配对，抑制蛋白翻译,调节内源基因表达，在基因调控中扮演了重要的角色。 MicroRNA 一般通过碱基配对结合到 mRNA 的 3 非翻译区（ 3 -UTR ），从而抑制mRNA的翻译发挥功能，在细胞分化，生物发育过程中起到重要的作用，并且参与疾病发生发展Differences in miRNA Mode of ActionmiRNAl microRNA在动植物中广泛并保守的

23、存在；l microRNA参与广泛的生物学过程，尤其是发育相关过程和组织特异性维持；l microRNA与target基因的交叉调控关系；l microRNA表达的基因芯片实验发现在癌症组织中miRNA广泛失调；l microRNA的表达谱可以对不同癌症甚至同种癌症的不同亚型进行分类。miRNA在癌症中的作用在癌症中的作用1. miRNA处于基因组中的脆性位点，在癌症中常常缺失或扩增2. miRNA基因所在位点在癌症中在表观遗传层面上被修饰调控3. miRNA发生相关基因如Drosha,Dicer在癌症中表达失调Remains largely a mestery!探针 寡核苷酸探针 Sange

24、r mirBase 7.0 中已知的 Human, Mouse, Rat, Drosophila , C. elegans 和zebrafish 的探针http:/www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml 前体和成熟的miRNA都可以设计探针点于芯片上 Case 1433 was initially diagnosed as ERMS based on its histology and reactivity for desmin, smooth muscle actin and CD99，this case clustered tigh

25、tly with the other ARMS included in the study. Subsequent demonstration of the fusion transcript PAX3-FKHR by reverse transcription (RT)PCR and sequencing in this sample confirms that this case is indeed an ARMScase 5918 was initially diagnosed as a GIST based on its origin in the wall of the colon

26、and reactivity for CD34. However this case clustered away from the eight other GISTs and instead clustered loosely with PRMS . Both KIT and DOG1 are highly expressed in the vast majority of GIST. Case 5918 did not have immunoreactivity for KIT or DOG1 and no mutations were found in KIT exon 11, the

27、most common mutation in GIST. Histologic review of the tumor suggested a new diagnosis of dedifferentiated liposarcoma.27 sarcomas, 5normal smooth muscle and 2 normal skeletal muscle tissuesmicroRNA expression profiles classify human cancersLeukemiaSolid TumormicroRNA表达谱的不一致性很高表达谱的不一致性很高 不同实验室得出的mic

28、roRNA表达谱结果很不一致：microRNA芯片技术的难度和不成熟性。 RNA类型：总RNA进行实验可能同时检测了成熟的miRNA与前体miRNA。如果miRNA成熟受阻，则可以解释此矛盾。这暗示，前体miRNA可能含有独立的，还未知的功能。 使用纯化的小RNA进行实验可能会引入错误：目前无法测量小RNA在总RNA中的比例情况，如果癌症与良性组织含有不同比例的小RNA，那么纯化小RNA实验的前提（同样量的miRNA被纯化得出）则会受到根本的影响。 样本量对结果的影响PC3 cells were transduced with adenovirus either encoding p53 or

29、 containing an empty vector. After 48 h, small RNA was characterized with PCR Arrays containing 376 human miRNA-specific assays. The heat map visualizes the fold-differences in miRNA expression upon p53 over-expression (red, up-regulated miRNA; green, down-regulated miRNA; black, no difference). PCR

30、 Arrays are the most reliable tools for analyzing the expression of a focused panel of genes. Each 96-well or 384-well plate includes SYBR Green-optimized primer assays for a thoroughly researched panel of relevant, pathway- or disease-focused genes. PCR Arrays can also be customized to contain a pa

31、nel of genes tailored to your specific research interests. 比较基因组杂交芯片CGH array杂合性缺失（loss of heterozygosity） 杂合性指同源染色体中不同等位基因存在于一个或多个基因位点中的现象；野生型拷贝或等位基因发生缺失就称为杂合性缺失（LOH），LOH通常是由染色体缺失或重组引起。绝大多数人类肿瘤都存在非随机性的染色体片段丢失。杂合性缺失在肿瘤细胞中是一种非常常见的DNA变异。 肿瘤中存在基因的扩增 通过比较肿瘤组织与体细胞组织中野生型和突变DNA的比值可以检测LOH以及基因的扩增；比较基因组杂交（比较基

32、因组杂交（comparative comparative genomic hybridizationgenomic hybridization，CGH CGH ） 一种分子细胞遗传学技术，能够通过一个简单的杂交反应检测出整个基因组DNA拷贝数改变。主要原理是采用经过荧光标记的肿瘤基因组DNA和正常基因组DNA为探针，与正常人中期染色体标本进行原位杂交，根据两种探针荧光信号的强度差异找出基因组中DNA的增加或缺失区域。DNA Extraction & LabelHybMetaphase Chromosome ScanImage aCGH (Array Comparative Genomi

33、c Hybridization)比较基因组杂交（简称CGH）的方法被用来监测染色体基因组的改变。CGH最突出的优点在于：通过一次实验就能完成对整个基因组中所有遗传物质增加或丢失的分析，实验所使用的DNA可以是从新鲜冻存的组织中提取的，也可以提取自福尔马林固定石蜡包埋的保存材料。CGH主要用于肿瘤细胞染色体DNA片段的缺失和增加的检测,同时对其它与染色体拷贝数变化有关的疾病也能进行分析和检测，如小儿自闭症，先天性发育迟缓等一系列遗传病症。 Array CGH就是一种新的用于检测肿瘤细胞染色体拷贝数变化的技术，该项技术能够通过一个简单的杂交反应检测出整个基因组DNA拷贝数改变。主要原理是采用经过不

34、同颜色荧光标记的肿瘤基因组DNA和正常基因组DNA与芯片上结合的覆盖全部人类基因组的寡核苷酸探针杂交，根据杂交后两种探针荧光信号的强度差异找出基因组中DNA的增加或缺失区域。 aCGH的特点: 高通量（覆盖人类全基因组的探针设计，包括针对基因外显子、内含子和基因间序列的探针，一张芯片上探针的数量接近24万个探针），高分辨率（24万个探针的平均分辩率在6.4KB,对目前较为了解的基因来说，可以检测到这些具体的基因的单个拷贝数的变化Agilent，Nimblegen分辨率为6KB）。利用基因芯片并行检测前列腺癌利用基因芯片并行检测前列腺癌染色体畸变和基因表达谱染色体畸变和基因表达谱 研究所用研究所

35、用48例前列腺癌样本和例前列腺癌样本和10例正常样本（例正常样本（9例例前列腺组织和前列腺组织和1例肾脏组织）由北京大学附属第一医例肾脏组织）由北京大学附属第一医院提供院提供表达谱分析25例前列腺癌样本和3例正常前列腺组织进行了表达谱芯片实验，以混合的人类胚胎组织为通用参照。运用平均ratio值（R 0.5 or R -0.5）和非参数t检验（p 0.1）双重标准筛选前列腺癌差异表达基因，并对差异表达基因进行EASE分析。array-CGH18例前列腺癌样本和1例肾脏组织（正常对照）进行了array-CGH实验。运用ACE算法分析实验数据，寻找前列腺癌染色体扩增和缺失。整合分析11例前列腺癌样

36、本同时进行了表达谱和CGH实验。芯片类型：博星基因芯片有限公司的8000点的基因芯片（cDNA芯片） 整合分析整合分析11例前列腺癌样本同时进行了表达谱和例前列腺癌样本同时进行了表达谱和CGH实实验。我们对这验。我们对这11个样本的每个样本计算了余个样本的每个样本计算了余弦相关系数以考察弦相关系数以考察CGH和表达谱的一致性。和表达谱的一致性。为了寻找表达受到染色体畸变影响的基因，挑为了寻找表达受到染色体畸变影响的基因，挑选处于染色体扩增区（在选处于染色体扩增区（在 10% 的的18例前列例前列腺癌）的表达上调（在腺癌）的表达上调（在25例前列腺癌）的基例前列腺癌）的基因和处于染色体缺失区（在

37、因和处于染色体缺失区（在 10% 的的18例前例前列腺癌）的表达下调（在列腺癌）的表达下调（在25例前列腺癌）的例前列腺癌）的基因。基因。对每个挑选出来的基因计算了对每个挑选出来的基因计算了Jackknife相关相关系数来评估其表达水平和系数来评估其表达水平和DNA拷贝数的关系。拷贝数的关系。 53个基因表达可能受到染色体畸变影响个基因表达可能受到染色体畸变影响 本研究发现的常见染色体畸变区域大部分在以本研究发现的常见染色体畸变区域大部分在以前的研究中报道过，但是与前人的研究结果相前的研究中报道过，但是与前人的研究结果相比也存在畸变区域和畸变频率方面的一些差异。比也存在畸变区域和畸变频率方面的

38、一些差异。究其原因，可能有如下几个方面：运用不同究其原因，可能有如下几个方面：运用不同的实验手段、不同的分析算法和不同的判断标的实验手段、不同的分析算法和不同的判断标准都有可能造成研究报道之间的差异；前列准都有可能造成研究报道之间的差异；前列腺癌存在种族差异。腺癌存在种族差异。 发现新的染色体畸变，如发现新的染色体畸变，如Xq21.33-q22.2。 染色体畸变是一个很重要的癌变机制，可能导染色体畸变是一个很重要的癌变机制，可能导致位于其上的原癌基因激活或者抑癌基因丢失。致位于其上的原癌基因激活或者抑癌基因丢失。 我们的研究发现基因表达水平和染色体拷贝数我们的研究发现基因表达水平和染色体拷贝数

39、呈弱的正相关。余弦相关是线性相关，考虑到呈弱的正相关。余弦相关是线性相关，考虑到DNA，mRNA和蛋白质之间复杂的相互作用，和蛋白质之间复杂的相互作用，我们不能够期待我们不能够期待CGH和表达谱呈现一种强的和表达谱呈现一种强的正相关。正相关。 我们推测染色体拷贝数变化不是影响基因表达我们推测染色体拷贝数变化不是影响基因表达水平的主导因素。很多其它的机制如水平的主导因素。很多其它的机制如DNA突突变、表观遗传学变化、变、表观遗传学变化、RNA干扰等都在调控干扰等都在调控基因表达上起着重要作用。基因表达上起着重要作用。小结 不同类型的芯片应用于肿瘤分子分型下一讲内容 Tiling array Ex

40、on arrayBasic Biologic Features of NeoplasmsDifferentiationAbnormal ProliferationAngiogenesisInvasionSenescenceApoptosisNeoplasms Evolve in Multiple Steps Initiation: presumably occurs through irreversible or stable damage to DNA Promotion: an process bringing about a clonal expansion of initiated c

41、ells Progression: results when genetic instability leads to further mutagenic and epigenetic changes肿瘤的传统检测 传统的肿瘤解剖分期(包括肿瘤大小、淋巴结转移数目，TNM)对于预测肿瘤的复发转移价值不可低估，是临床上较成熟的风险评估指标。 传统的组织病理诊断：以组织形态、免疫组织化学染色；通常以单一基因的不同表现对肿瘤作出诊断。 问题：组织病理学上看起来一样的肿瘤，其自然发展史、生物学行为以及对治疗的反应和预后等都会有所不同。从活检标本上看都象是肿瘤的两个病人，他们都有肿瘤灶，你可以说它们看起

42、一是一样的，但事实上，一位病人已在别的部位有恶性生长了。白血病的分类 肿瘤分类学在过去的30多年间进步不少，但是在鉴定新的肿瘤类型（class discovery）和肿瘤分类（cancer classification）还缺乏通用的方法 急性白血病的分类方法：核的形态学分析，酶学免疫组化，染色体易位分析，任何一个分析都需要非常有经验的医师进行详尽的检查以及分析，需要专业的实验室来完成，但没有一个单独的测试能够足以用于诊断 传统的分类方法的联合运用，一般而言比较准确，但仍旧会出错Prognosis of additional 19 patientsResults n231 genes were

43、significantly associated with the disease outcomen70 genes were further selected to be optimal marker genenPrediction accuracy 80% Case 1433 was initially diagnosed as ERMS based on its histology and reactivity for desmin, smooth muscle actin and CD99，this case clustered tightly with the other ARMS included in the study. Subsequent demonstration of