高效液相色谱分析法 HPLC

1、Temporal course淋洗液淋洗液慢慢中等中等快快石油醚 (mobile phase)CaCO3颗粒(stationary phase)2. Classification of Chromatographic methods特点：分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快应用：高沸点、大分子量、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析适于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质的分析在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析右图是各种HPLC方法的应用范围及对象分子量分子量HP

2、LC仪器包括：仪器包括： 高压输液装置高压输液装置 (Delivery system) 进样系统进样系统 (Injection system) 分离系统分离系统 (Separation system) 检测系统检测系统 (Detection system) (梯度淋洗、自动进样和数据处理装置梯度淋洗、自动进样和数据处理装置)Waters HPLCl贮液罐l一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相l流动相输出端配0.45 m膜过滤器，防止颗粒物进入泵内l流动相脱气l作用：l防止在洗脱过程中，当流动相由色谱柱流入检测器时因压力降低而产生气泡l消除溶解在流

3、动相中的氧的影响l氧会造成荧光猝灭l还会使样品组分氧化l或使固定相分解而导致柱分离性能改变l脱气方法：l真空泵抽滤脱气：单一溶剂l低溶性惰性气体导入替换:氦气 l超声脱气l在线真空脱气 （On-line degasser）l实现流动相在进入高压泵前的连续在线脱气和过滤(1) 高压输液泵高压输液泵l压力：压力：150350105 Pal作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统 l对输液泵的基本要求对输液泵的基本要求 l能在高压下连续工作l流量准确可调 0.1-10mL/minl输出流量稳定l耐腐蚀（耐酸不锈钢、PEEK聚醚醚酮）l泵的死体积小

4、（小于0.5mL ）u消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化的影响u可减小溶剂可压缩性的影响 进样要求：将样品定量的、瞬间注入到色谱柱头填料中心，形成集中的一个点（柱塞式进样） 进样装置:1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样 装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀 由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好3) 自动进样器装入样品装入样品出口出口进样进样采样环采样环泵入溶剂泵入溶剂进色谱柱进色谱柱l对色谱柱的要求：l内壁光滑的直型不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小l柱长多为1030cm，内径为45mml尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大l发展

5、趋势是减小填料粒度以提高柱效l柱外效应引起的峰形扩展不可忽视uDdCDdCDdCuDCdHmpsmmpmsfsmdp2222涡流扩散项He纵向扩散项Hd固定相传质阻力项Hs流动相迁移传质阻力项Hm流动相滞流传质阻力项Hsm a. 紫外检测器紫外检测器 检测原理：和UV-Vis方法一样 应用最广：HPLC分析中，约80%的物质可以在254 或280 nm处产生紫外吸收 采用微量吸收池，通常其光程为2-10 mm, 体积约为1-10 L 特点：特点：灵敏度高 线形范围大 波长可选，易于操作对流动相的流速和温度变化不敏感 可用于梯度洗脱 石英窗石英窗接色谱柱接色谱柱UV光电倍增管光电倍增管废液废液l

6、 紫外检测器的重要进展紫外检测器的重要进展l 光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，可分别同时检测特定波长(180-600 nm)l10 ms内完成一次检测l计算机快速处理l三维立体谱图快速扫描快速扫描光电二极管阵列（光电二极管阵列（PDAPDA）检测所获得的三维色谱）检测所获得的三维色谱- -光谱图光谱图波长波长可的松可的松氟美松氟美松皮质酮皮质酮l原理：通过连续测定参比池和测量池中溶液的折射率之差，来测定样品的浓度特点：偏转式、反射式和干涉型三种偏转式：反射式折光指数检测器l原理：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射

7、出较激发光波长要长的荧光 l特点：l应用：d d）电导检测器）电导检测器原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量电导检测器的构成： 由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几部分组成，电导池是其核心。电导检测器主要用于离子色谱的检测溶液溶液至检测池电极 检测池接参比电极和对电极接色谱柱Teflon塑料块1 cm工作电极(Pt, Au, 碳糊)f）安培检测器）安培检测器l 由恒电位仪和一薄层反应池（体积为15L）组成l 原理：利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成

8、正比l采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性l最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测有电活性的物质固定相固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等 结构类型：全多孔型和薄壳型 粒度：510 m流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸应用应用: 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾 应用：环境中有机氯农药残留量分析应用：环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：5

9、0cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。 固定相与流动相均为液体（互不相溶） 基本原理基本原理：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数具有不同的分配系数 流动相流动相：为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好说二者的极性相差越大越好固定相：固定相：机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定

10、相不足：HCl3SiROSiSiCl3ROHSi 硅烷RSiRMgCl 或 RLiClSi2SOClOHSi 酰氯化ROSi2SOClOHROHSi 硅酯 化化化学键合固定相化学键合固定相通过化学反应将不同的有机官能团键合在载体表面Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定Octadecylsilane(ODS):十八烷基硅烷化键合相l化学键合固定相的特点：化学

11、键合固定相的特点：l分离机理：双重分离机制，键合基团的覆盖率决定分离机理分离机理：双重分离机制，键合基团的覆盖率决定分离机理 稠环芳烃多为致癌物质 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器 固定相：固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂阴离子交换树脂或阳离子交换树脂 流动相：流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子交换树脂阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液作固定相，采用碱性水溶液 基本原理：基于

12、离子交换树脂上的可交换离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间发生可逆交换，利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来分离 阳离子交换：RSO3H + M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH + X- = RNR4 X + OH-u应用：离子交离子交换换分离机理分离机理 Temporal course 微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂离子交换剂硅胶层涂覆覆1）多孔型多孔型（包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型）：）： 聚苯乙烯聚苯乙烯+二乙烯苯交联二

13、乙烯苯交联交换基团多交换基团多交换容量大，稳定。但易交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢2）表面多孔型：表面多孔型： 薄膜型薄膜型=惰性核惰性核+树脂薄层树脂薄层(1-2 m) 多孔型多孔型=惰性核惰性核+硅胶微球硅胶微球+树脂薄层树脂薄层 克服了多孔型离子交换树脂的不足，但克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷交换容量低，柱子易超负荷1. 离子交换色谱离子交换色谱固定相固定相3）离子交换键合相：离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面载体可以是薄壳玻珠，也可以

14、是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子能稳定、耐压、高柱效的柱子2. 流动相：流动相： 离子交换色谱流动相为离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液盐类缓冲溶液(有一定有一定pH和离子强度和离子强度) ，通过改，通过改变以下条件来控制分配比变以下条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品的分离。，改变交换剂的选择性，进而影响样品的分离。pH值：值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。 常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。常

15、用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度离子强度I：对保留值的影响比对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对R+或或R-的竞争能力，使组分的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留

16、值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子配离子L：当大量当大量L、组分、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：随流动相进入柱后，发生配位剂交换： RM-L+X RM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类该法用于分离各种氨基酸或碱类Column ： IonPac AG12A / AS12AEluent ： 2.7mM Na2CO3 0.3mM NaHCO3Flow rate： 1.2mL/minDetection： Conductivity (ASRS Recycle mode)0246810121416Retention

17、 time(min)08SF-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-Column: IonPac CS12A, CG12AEluent : 20 mM Methanesulfonic acidFlow rate:1.0 mL/minDetection:Conductivity （CSRS Recycle mode) 0 02 24 46 68 8101012121414Retention time (min)Retention time (min)0 01 12 23 34 4NaNa+ +NHNH4 4+ +K K+ +MgMg2+2+CaCa2+2+Sl 1975 1975 由

18、由H. SmallH. Small 等首次提出等首次提出, , 用于测定氯离子和硫酸根用于测定氯离子和硫酸根l分离原理：与离子交换色谱原理一样分离原理：与离子交换色谱原理一样l与离子交换色谱的区别：与离子交换色谱的区别：l离子色谱具有以下优点离子色谱具有以下优点抑制型：抑制柱型、连续抑制型抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.010.05毫摩尔/克干树脂非抑制型非抑制型: : 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱废液废液

19、Back Ground： Na2CO3 / NaHCO3(700S)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4Retention timeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4Back Ground： Na2CO3 / NaHCO3(700S)Retention timeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4Retention timeBack Ground： H2CO3 (15S)Conductivity抑制器的作用抑制器的作用:提高待测离子的电导率提高待测离子的电导率Na+, Cl- H+,Cl-降低背景降低背景电导

20、电导 (淋洗液淋洗液)Na+,HCO3- H2CO3Na+,OH- H2OCation Anion Total conductivity （ （ ） ） （ （ ） ） （unit：S/m equivalent）OHNaROHNaHR2XHNaRXNaHR 抑制柱上的交换反应微膜抑制器结构微膜抑制器结构电极电极 离子交换膜离子交换膜离子交换膜离子交换膜流流动动相屏相屏再生液屏再生液屏再生液屏再生液屏柱流出物柱流出物至检测池至检测池废液废液 再生液再生液 抑制器的工作原理抑制器的工作原理 ( (阴离子阴离子) )Y+Na+X X- -: : 样品中的阴离子Y Y+ +: : 样品中的阳离子H2O

21、H2OOH Na+Y+H2O Na+Y+ X- Na+ CO32-(样品, 淋洗液)H+ H+ + CO32-H+ + X- 至检测器H2CO3H+X-H2OH2 + OH H2ONa+OH , H2H2O , O2 废液废液电电极极 （）（）电电极极 （）（）纯水或来自检测器的流体 H+H+H+H+阳离子交换膜阳离子交换膜 抑制器的工作原理抑制器的工作原理 ( (阳离子阳离子) )H2OH2OH2OH2 + OH H2O废液 / 气体废液H2O SO42-Y+ X- H+ MSA-(样样品品e, 淋洗液）淋洗液）OH OH MSA-SO42-X-OH MSA-SO42-X-H+ MSA- ,

22、 O2H2O, H2H+ + OH-Y+ + OH- H+ 至检测器H2OY+OH-X X- -: : 样品中的阴离子Y Y+ +: : 样品中的阳离子电电极极 （）（）电电极极 （）（）阴离子交换膜阴离子交换膜纯水或来自检测器的液体 新型连续自动再生柱抑制器新型连续自动再生柱抑制器例例: : 阴离子分析阴离子分析 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm), 流动相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr 七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm1Column:Column:IonPacIo

23、nPac AG14, AS14AG14, AS14EluentEluent: :3.53.5 mM mM Sodium carbonate Sodium carbonate1.01.0 mM mM Sodium bicarbonate Sodium bicarbonateFlow Rate:Flow Rate:1.21.2 mL mL/min/minInjInj. Volume:. Volume: 10 10 L LDetection:Detection:Suppressed conductivity, ASRSSuppressed conductivity, ASRS , ,AutoSupp

24、ressionAutoSuppression recycle mode recycle modeSample:Sample:Drinking water from Milpitas, CADrinking water from Milpitas, CAPeaks:Peaks:1. 1. FluorideFluoride0.030.03 mg/Lmg/L2. 2. BicarbonateBicarbonate 3. 3. ChlorideChloride3.123.124. 4. NitrateNitrate0.150.155. 5. PhosphatePhosphate0.040.046. 6

25、. SulfateSulfate4.454.45Analysis of Municipal Drinking WaterAnalysis of Municipal Drinking Water3 3-1 -1 S S3 31 1 2 24 45 56 60.50.50 02 24 46 68 8101012121414 S SMinutesMinutes-0.5-0.51 1 2 24 45 53 36 610.005.0010.0015.00 -0 5 uSGradient Separation of Organic Acids in Orange Juice(1:100 dilution)

26、Minutes5S012345678910111213141516 18051015Peaks:1. Quinate1.0mg/L2. Lactate0.43. Acetate0.14. Glycolate0.15. Formate0.256. d-Galacturonate0.37. Chloride0.68. Nitrate0.259. Glutarate1.010. Succinate0.211. Malate10.012. Sulfate0.813. Oxalate2.014. Phosphate2.015. Citrate8.016. Isocitrate1.517. cis-Aco

27、nitate0.518. trans-Aconitate0.5Column:IonPac AS11Eluent 1:D.I. WaterEluent 2:1.0 mM Sodium hydroxideEluent 3:100 mM Sodium hydroxideEluent 4:100% MethanolFlow Rate:2.0 mL/min.Detection:Suppressed conductivity,Chemical suppression modeTime (min.)%E1%E2%E3%E4 07020010 57020010 原理原理：将一种（或多

28、种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配l主要用于分离分子量大的阴、阳离子Mobile phase TBAOHACNH2OSampleY+ X- 固定相固定相 TBA+OH- Y+ X- Y+ X- (TBA+X-) (TBA+X-) (TBA+X-) (TBA+X-) TBA+OH- ACN ACN ACN ACN ACN ACN ACN TBA+ OH- TBA+ OH- 疏水相疏水相 亲亲水相水相 Y+ OH- Column : IonPac NS1、 、NG1 Eluent : 2 mM TBAOH,

29、 24%48% CAN gradient in 10 min Flow rate : 1.0 mL/min Detection : Conductivity (suppressor type) （ （ASRS MPIC Mode） ） Regenerator : 10 mN H2SO4 1. Methanesulfonic acid 5.0 g/mL (ppm) 2. 1-Propanesulfonic acid 8.6 3. 1-Butanesulfonic acid 8.7 4. 1-Hexanesulfonic acid 8.8 5. 1-Heptanesulfonic acid 8.9

30、 6. 1-Octanesulfonic acid 8.9 7. 1-Decanesulfonic acid 9.10Retention time (min)12168S0.0416234578.0l 固定相：凝胶,具有一定大小孔隙分布l 原理：原理：按分子尺寸大小分离l 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 凝胶色谱柱的总体积VA为： VA Vg Vi V0Vg：填料骨架的体积Vi ：填料孔体积V0 ：填料颗粒之间的体积A:排阻极限B:渗透极限凝胶色谱法的局限性：V0Vi色谱柱：KF-80M(I.d.2cm, L 60cm)流动相：四氢呋喃 1ml/min柱前压：1.5

31、Mpa常温检测器：UVD 254 nm原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离l固定相：将具有生物活性的配位体以共固定相：将具有生物活性的配位体以共价键结合到不溶性固体基质上制得价键结合到不溶性固体基质上制得l生物活性配位体：常用的有酶（如底物生物活性配位体：常用的有酶（如底物及其类似物）、辅酶（如类固醇）、抗体及其类似物）、辅酶（如类固醇）、抗体（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等生素（核苷酸）等l基质基质l天然有机高聚物制成的凝胶，如琼脂糖、葡聚糖等l合成有机聚合物形成的凝胶，如聚丙烯酰胺及其衍生物l应用

32、：主要用于蛋白质和生物活性物质应用：主要用于蛋白质和生物活性物质的分离与制备的分离与制备 Lock and key structural complex“锁匙结构络合物”液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂l 流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况l按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分l按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性l按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗l常用溶剂常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水l采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据