共轭十八碳四烯酸的制备表征和生物活性研究

1、目目 录录一、共轭十八碳四烯酸的简介二、共轭十八碳四烯酸的制备和表征三、共轭十八碳四烯酸甲基化过程中的内异构化四、CLA、CLN和PnA对肿瘤细胞的影响 五、共轭十八碳四烯酸与BSA和小牛胸腺DNA 相互作用 一、共轭十八碳四烯酸的简介一、共轭十八碳四烯酸的简介1.1 多烯不饱和脂肪酸的简介1.2 共轭十八碳四烯酸的简介1.3 共轭十八碳四烯酸的存在和生物活性1.4 共轭十八碳四烯酸的合成方法 1.1 多烯不饱和脂肪酸的简介多烯不饱和脂肪酸的简介 多烯不饱和脂肪酸是指分子中含有两个或两个以上双键且碳原子数为1622的直链脂肪酸。常见的多烯不饱和脂肪酸有：亚油酸、亚麻酸(LN)、共轭亚油酸(CL

2、A)、共轭亚麻酸(CLN)、共轭十八碳四烯酸（PnA）、花生四烯酸(AA)以及二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸(DHA)等。 多烯不饱和脂肪酸是构成体内脂肪的一种脂肪酸，是人体必需的脂肪酸。研究发现，存在特殊共轭结构的脂肪酸，如共轭亚油酸、共轭亚麻酸等都具有抗癌、抗动脉硬化、降血压、降血脂、减肥等非常有益的功效。同时还发现活性和其结构存在相关性，即共轭程度越高，活性越强。PnA分子具有四共轭结构，和共轭亚油酸、共轭亚麻酸在结构上具有高度的相似性，因此近年来PnA也引起了化学家、生物医学专家等的极大兴趣。 1.2 1.2 共轭十八碳四烯酸的简介共轭十八碳四烯酸的简介 共轭十八碳四烯酸(Pa

3、rinaric acid,简称为PnA)是指分子中含有十八个碳原子，四个共轭双键的直链脂肪酸。四个共轭双键所处的位置及几何构型的多样性使得共轭十八碳四烯酸具有非常复杂的同分异构体。主要的异构体包括以下四种：9(c),11(t),13(t),15(c)-十八碳四烯酸(又称-PnA或cis-PnA)，9(t),11(t),13(t),15(t)-十八碳四烯酸(又称-PnA或trans-PnA), 9(c),11(t),13(t),15(t)-十八碳四烯酸,9(t),11(t),13(t),15(c)-十八碳四烯酸,(c代表顺式；t代表反式)。几种parinaric acid的分子式如下图所示 9(

4、c),11(t),13(t),15(c)-18:4 9(c),11(t),13(t),15(t)- 18:4 9(t),11(t),13(t),15(c)- 18:4H O O CH O O CH O O CH O O C 9(t),11(t),13(t),15(t)- 18:41.3 1.3 共轭的十八碳四烯酸存在和生物活性共轭的十八碳四烯酸存在和生物活性 天然PnA存在于凤仙花、等鞭金藻等植物中。 许多研究已表明十八碳多烯酸具有多种有益的生理活性，但是目前关于PnA生物活性的研究才刚刚兴起。目前发现PnA具有抗肿瘤、治疗皮肤病、抗动脉粥样硬化等非常有益的生理活性。1.4 1.4 共轭十八碳

5、四烯酸的合成方法共轭十八碳四烯酸的合成方法 常见的共轭十八碳四烯酸的合成方法主要包括生物法 和化学法两大类 。生物合成法：COOHO2H2O2COOH化学合成法：OHO1RBrBr+RBrBrRBr2;3;4RBrRROHO2b2c2a2d+5二、共轭十八碳四烯酸的制备和表征 2.1 天然产物提取法 2.2 表征凤仙花籽的磨碎氯仿浸泡旋转蒸发除去氯仿皂化（5%的 KOH/CH3OH溶液）酸化（2M盐酸）静置分离得到FA低温结晶白色晶体 低温结晶法是根据不同脂肪酸双键数目差别越大，其在有机溶剂中的溶解度差别就越大而且这种差别在低温下会更加明显的特点进行脂肪酸纯化的一种方法。因此可将混合脂肪酸溶于

6、适当的溶剂，进行低温冷藏过滤即可除去大量的饱和脂肪酸以及低不饱和脂肪酸。2.2 表 征图2-1 凤仙花籽油的气相色谱图图2-2 cis-PnA的紫外光谱图图2-3 trans-PnA的紫外光谱图图2-5 trans-PnA甲基酯的 Ag+-HPLC 图2-4 cis-PnA甲基酯的Ag+-HPLC 本研究结果表明，低温结晶法操作简便，成本低，提纯产物纯度高。在4低温下经三次结晶可以大幅度提高凤仙花籽油中的PnA纯度，其纯度达到了95以上。更为重要的是，通过简便的异构化方法，我们得到了异构体的纯品。此外，我们采用气相色谱、紫外光谱、 Ag+-HPLC色谱技术对制备出的两种异构体进行了 表征。 在

7、PnA的Ag+-HPLC分析中我们发现，在甲基化过程中PnA出现了严重的内异构化，这种内异构化现象使无法认识到真实的PnA组成情况。由于不同PnA异构体的化学性质、生物活性等存在较大差别，因此除非能避免甲基化过程的内异构化，否则就不能准确、深入的开展其稳定性、活性机理等方面的后续研究。本实验利用Ag+-HPLC分析异构体组成，以便优化甲基化条件，使得内异构化程度最小。 3.1 trans-PnA在1.5M硫酸/甲醇溶液中的内异构化3.2 凤仙花籽油中五种异构体的Ag+-HPLC表征3.3 凤仙花籽油中十二种异构体确定3.4 异构化时间和温度对凤仙花籽油内异构化的影响3.1 trans-PnA3

8、.1 trans-PnA在在1.5M1.5M硫酸硫酸/ /甲醇溶液中的内异构化甲醇溶液中的内异构化图3-1 trans-PnA甲基化后的Ag+-HPLC图谱分析，(a)在25下反应10min, (b)在80下反应60min图3-2 凤仙花籽油在25下反应10min的Ag+-HPLC图谱 3.2 3.2 凤仙花籽油中五种异构体的凤仙花籽油中五种异构体的Ag+-HPLCAg+-HPLC表征表征图3-3 在25下反应10min trans-PnA和cis-PnA两种内标的Ag+-HPLC图谱 浸渍层析柱属于一种极性硅胶柱，能够基于极性的不同分离有机化合物。有机物的极性越弱，其保留时间越短，越早被洗脱

9、。共轭十八碳四烯酸异构体中，,t,t,t t极性最弱，然后依次为 c,t,t,t；c,t,t,c；c,t,c,c；c,c,c,c。同时由于以前的研究表明凤仙花籽油中只含有9, 11, 13, 15位置异构体，图中的峰1和峰3分别为trans-PnA(t9,t11,t13,t15-18:4)和cis-PnA(c9,t11,t13,c15-18:4)，因此我们可以断定峰2，4，5分别为c9,t11,t13,t15-18:4; c9,t11,c13,c15-18:4 和c9,c11,c13,c15-18:4。3.3 3.3 凤仙花籽油中十二种异构体确定凤仙花籽油中十二种异构体确定 Ag+-HPLC可

10、以将几何构型相同而位置构型不同的异构体分开，它的分离的原理是双键距离-COOCH3越远，异构体越先流出。 按照这个规律，共轭十八碳四烯酸异构体分别是， 在A组中，异构体1，2，3分别为t11,t13,t15,t17-18:4 ； t10,t12,t14,t16-18:4 ；t9,t11,t13,t15-18:4 ； 在B组中，异构体4，5，6分别为c11,t13,t15,t17-18:4； c10,t12,t14,t16-18:4；c9,t11,t13,t15-18:4； 在C组中，7，8分别c10,t12,t14,c16-18:4; c9,t11,t13,c15-18:4； 在D组中, 9,

11、10分别为c9,t11,c13,c15-18:4； c8,t10,c12,c14-18:4； 在E组中,11,12分别为,c11,c13,c15-18:4 ； c8,c10,c12,c14-18:4 。3.4 3.4 异构化时间和温度对凤仙花籽油异构化时间和温度对凤仙花籽油 内异构化的影响内异构化的影响MethylationIsomeric composition of parinari glaberrimum seeds oil TempTimeI1I2I3I4I5I 6I7I8I 9I10I11I1225 10 min0.000.007.050.000.0014.330.0074.853.

12、010.000.760.0020 min0.960.006.930.361.2215.200.9770.703.000.000.670.0040 min1.130.007.750.431.4315.850.9769.162.770.000.510.0060 min1.280.676.830.351.5115.140.8870.682.170.040.460.0040 10 min1.340.009.020.501.6314.810.8768.942.490.000.400.0020 min2.500.0013.520.752.7617.121.1159.612.280.070.270.0040

13、 min4.240.0021.971.434.3219.131.3144.842.350.180.230.0060 min5.990.0029.572.115.5619.791.5232.482.220.490.260.0060 10 min6.9114.1716.713.286.1020.612.3924.613.460.720.690.3620 min10.2318.5421.315.856.7920.361.9010.382.930.920.480.3040 min12.8718.1122.1610.226.4418.395.253.651.291.110.350.1660 min13.

14、7121.3320.9713.676.6612.835.682.551.191.020.250.1580 10 min9.4521.5817.9419.0611.718.227.151.501.401.260.470.2620 min10.3025.4016.5418.1610.858.375.391.711.461.180.460.1840 min12.9820.7621.7812.496.5313.875.653.001.391.230.200.1260 min11.7626.9419.9112.575.6913.105.412.041.120.870.310.27这12种，即5组异构体，

15、发生了位置异构：在A组中(t,t,t,t，)异构体3被异构化为了1和2，即由9,11,13,15-18:4 异构化为10,12,14,16-18:4 和11,13,15,17-18:4 两种位置异构体。在组B、C、D、E中也发生了类似的位置异构体的转变从图中可以看出，甲基化反应的温度越高，时间越长，t,t,t,t-的含量也越大。在组B中c,t,t,t-异构体情况类似，与A组不同的是，当温度为80 ，反应时间达到40分钟和60分钟时，c,t,t,t-异构体的含量降低，也就是说80 ，40分钟是c,t,t,t-异构体含量发生变化的拐点，这个拐点表明在这个反应条件下c,t,t,t-异构体转变为了t,

16、t,t,t-异构体。在组C，组D和组E中， 随着温度的升高，对应的各个异构体的含量都下降了。因此我们可以断定，在甲基化过程中c,t,t,c-, c,t,c,c-, 和 c,c,c,c- 都被异构化为了 t,t,t,t 和c,t,t,t。也就是说，在甲基化过程中顺式构象转变为了反式构象。 本研究揭示了异构化过程中的两个规律，一个是，异构化是和反应的温度，时间有关的过程，温度越高，时间越长，异构化越严重。 另外一个是，不同异构体之间的相互转化与它们的位置，顺反构型有关的。从表中得出下面的结论： 9,11,13,15-18:4异构化为 10,12,14,16-18:4, 11,13,15,17-18

17、:4 或者8,10,12,14-18:4位置异构体，得出的另外一个结论： c,t,t,c-, c,t,c,c-, 和c,c,c,c-异构化为 t,t,t,t 和 c,t,t,t。 4.1 CLA对肿瘤细胞 BEL-7402 的抑制作用4.2 CLN 对肿瘤细胞BEL-7402的抑制作用4.3 PnA对肿瘤细胞BEL-7402的抑制作用 MTT又叫噻唑蓝，是一种黄颜色的染料， MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长

18、处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。 4.1 CLA4.1 CLA对肿瘤细胞对肿瘤细胞 BEL-7402 BEL-7402 的抑制作用的抑制作用组别药物浓度（M）A（吸光度值）抑制率（%）对照组0.05850CLA 组110501005000.046670.038170.041170.044830.0185020.2334.7629.6323.3668.384.2 CLN 4.2 CLN 对肿瘤细胞对肿瘤细胞BEL-7402BEL-7402的抑制作用的抑制作用组别药物浓度（M）A（吸光度值）抑制率（%）对照组0.05850CLN 组110501005000.048670.047170.05

19、5170.053670.0163316.8119.375.6988.26272.084.3 PnA4.3 PnA对肿瘤细胞对肿瘤细胞BEL-7402BEL-7402的抑制作用的抑制作用组别药物浓度（M）A（吸光度值）抑制率（%）对照组0.05850PnA组110501005000.048690.043970.029840.020410.00942311.7413.4235.2331.7476.51 脂肪酸的浓度越大，吸光度越小，对肿瘤细胞生 长的抑制作用也越大。 2. 三种脂肪酸对肿瘤细胞生长的抑制作用为CLACLNPnA。即：共轭双键的数目越多，对肿瘤细胞生长的抑制作用越大。 5.1 与与B

20、SA作用作用 5.2 与与CTDNA相互作用相互作用5.1 5.1 与与BSABSA作用作用(1) 荧光光谱荧光光谱 30032034036038040042044046002004006008001000anIntensity(a.u.)W avelength(nm )(2) 猝灭机理的推断猝灭机理的推断荧光猝灭机理包括动态淬灭和静态淬灭两种。以上这些不同的淬灭机理我们可以通过对SternVolmer淬灭方程， 即即 F0/F = 1 + Kq 0Q = 1 + KsvQ 的回归分析来加以判定。0510152025303540451.01.52.02.53.03.5370C270C200CF

21、0/FQ/(10-5mol.L-1)在不同温度下在不同温度下PnAMe对对BSA荧光荧光淬灭的灭的Stern-Volmer图图结论：PnAMe和BSA的淬灭反应为动态猝灭机理。(3) 作用力类型的确定作用力类型的确定 药物和生物大分子之间的相互作用力包括氢键、静电作用、范德华力、疏水力四种。根据反应前后热力学焓变H 和熵变S的大小，可以判断药物与生物大分子之问的主要作用力类型：H0、S0为疏水作用力；H0、S0为静电引力。 T/kKsv/(103L.mol-1)rSDH/(KJ.mol-1)G/(KJ.mol-1)S/(J.mol-1.K-1)2933003103.5014.8085.4230

22、.99350.99560.99630.01240.01430.010518.865-20.00-20.93-22.26132.65 PnAMe与与BSA结合的结合的Stem-Volmer淬灭常数及相关的热力学常数灭常数及相关的热力学常数 结论： PnAMe与BSA的结合的主要作用力为疏水作用力。(4) 表观结合常数及结合位点数表观结合常数及结合位点数复合物的表观结合常数与结合位点数可由下式求出：lg(F0-F)F = lgKb + n lgQ 0.40.60.81.01.21.41.61.8-1.6-1.4-1.2-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.4Lg(F0-F)/FLgQ结论：结合位点数n为1，表观结合常数为1.84210-2L.mol-1 (5) 同步荧光光谱同步荧光光谱260280300320340360020406080100120140 FWavelength(nm)61BSA的同步荧光光谱的同步荧光光谱(T=310K，=15nm) 2402602803003203403600200400600800 61FWavelength(nm)BSA的同