分子讨论：遗传病的基因诊断郭蓉

1、遗传病的基因诊断中南大学预防1502班郭蓉例：镰状红细胞贫血症2 用分子生物学的理论和技术，用分子生物学的理论和技术， 通过检测基因及其表达产物的存在状通过检测基因及其表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。态，对人体疾病作出诊断的方法。对对人人Genetic Diagnosis / Molecular Diagnosis基因诊断基因诊断的概念的概念3基因诊断的特点基因诊断的特点高特异性：诊断目标高特异性：诊断目标高灵敏度：分子生物学方法高灵敏度：分子生物学方法早期诊断性：分子遗传学规律早期诊断性：分子遗传学规律应用广泛性：疾病与非疾病检查应用广泛性：疾病与非疾病检查4v 基本策略 检测

2、：1）DNA探针与靶基因形成分子杂交或限制性内切酶对特定位点的识别；2）PCR及基于PCR的各种检测结果。5 Commonly used Techniques核酸分子杂交核酸分子杂交 限制性酶谱与限制性片段长度多态性限制性酶谱与限制性片段长度多态性寡核苷酸探针杂交寡核苷酸探针杂交PCR及其衍生技术及其衍生技术DNA序列测定序列测定DNA芯片芯片Western免疫印迹检测免疫印迹检测6（一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交（nucleic acid hybridization) 两条互补的两条互补的单链核酸单链核酸在一定条件（温度、在一定条件（温度、盐离子等）下，按碱基互补的原则重新配盐离子等）下

3、，按碱基互补的原则重新配对形成对形成双链双链的的过程过程 杂交双方：探针与待检核酸序列基因的特异性识别基因的特异性识别71.1.制备合适的探针是核酸杂交用于基因制备合适的探针是核酸杂交用于基因诊断的关键诊断的关键 What is a probe? 标记的标记的序列已知的序列已知的核酸片段，包括核酸片段，包括 DNA、cDNA、RNA及及oligonucleotides等等8放射性同位素：放射性同位素： 32P和和35S非放射性标记：荧光基团和非放射性标记：荧光基团和生物素生物素92. 核酸分子杂交流程核酸分子杂交流程 待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固定滤膜上核酸固定杂交杂交去除未杂交的探针

4、去除未杂交的探针检测杂交信号检测杂交信号核酸探针制备核酸探针制备探针标记探针标记加入标记探针加入标记探针10 经典经典Southern blot包括限制性内切酶包括限制性内切酶消化、酶切产物的消化、酶切产物的DNA印迹转移和探针印迹转移和探针的膜杂交三个部分。的膜杂交三个部分。11 Southern blot一般流程： 提取提取DNA 限制性内切酶消化限制性内切酶消化DNA以产生特以产生特定长度的片段定长度的片段凝胶电泳分离凝胶电泳分离变性处理变性处理DNA转印到膜上并使其牢固结合转印到膜上并使其牢固结合标记探标记探针与膜针与膜DNA杂交杂交反应反应结果检测与分析结果检测与分析12限制性酶切分

5、析限制性酶切分析(restriction enzyme mapping)（RE） 分析致病基因分析致病基因DNA中因点突变导致限制性中因点突变导致限制性内切酶识别切割位点消失或新生的变化情况。内切酶识别切割位点消失或新生的变化情况。 多与多与PCR结合使用（结合使用（PCR-RE），），属于直属于直接诊断途径接诊断途径。 13酶切图谱：某DNA分子（DNA大分子或基因组DNA等）以一或数种限制性核酸内切酶消化切割所产生的一组DNA片段，根据其电泳速率差异获得的凝胶电泳分离结果。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳（AGE）是用于分离具有不同大小DNA片段的最为普通的技术。琼脂糖是一种被纯化的线性半乳

6、多聚糖，可在热的溶剂中熔化并在冷却时形成凝胶。核酸分子结构的重复性使核苷酸数相同的不同核酸几乎具有等量的净电荷，所有的DNA都具有大约相同的分子电量质量比例，即核酸携带的电荷的差异几乎不造成对核酸迁移率的差异，DNA片段的分离完全基于大小上的差异。在AGE中，颗粒或片段在电流的作用下贯穿琼脂糖凝胶板（介质）来移动，后者可作为一种分子筛起作用，较小的分子介质要比较大的分子更快。显像：DNA在凝胶中可用溴化乙锭（EB）来显像。它可嵌入DNA堆积碱基之中，在UV线（紫外线）下呈现荧光，高浓度DNA在凝胶中呈一条带状。15聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (polymerase chain reactio

7、n, PCR）模板模板引物引物dNTP Mg2+ Taq DNA聚合聚合酶酶变性变性延伸延伸退火退火1617TemplatePrimersEnzymes1819 2 2 基因诊断中的基因诊断中的PCRPCR及其衍生技术及其衍生技术（1 1）直接运用）直接运用PCRPCR扩增：异常缺失与存在扩增：异常缺失与存在（2）PCR产物的限制性酶谱分析（产物的限制性酶谱分析（PCR-RE)和限制性片段长度多态性分析（和限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP) 通过通过PCRPCR将包含待测位点的将包含待测位点的DNADNA片段扩增后，片段扩增后，用识别相应位点的限制性核酸内切酶水解，根用识别相应位点的

8、限制性核酸内切酶水解，根据所产生限制性片段的数量和长度作出诊断。据所产生限制性片段的数量和长度作出诊断。20（一）血红蛋白病（一）血红蛋白病 血红蛋白分子结构或珠蛋白肽链量的异常血红蛋白分子结构或珠蛋白肽链量的异常所引起的一组遗传性疾病。所引起的一组遗传性疾病。异常血红蛋白：异常血红蛋白：珠蛋白基因突变导致珠蛋白链结构异珠蛋白基因突变导致珠蛋白链结构异常而出现临床表现。常而出现临床表现。地中海贫血：地中海贫血：珠蛋白基因的缺失或突变而导致某种蛋珠蛋白基因的缺失或突变而导致某种蛋白链合成障碍，造成合成白链合成障碍，造成合成链或链或链失去平衡而导致的链失去平衡而导致的溶血性贫血。溶血性贫血。血红蛋

9、白：四分子珠蛋白,四分子亚铁血红素镰状红细胞贫血症谷氨酸亲水，位点位于血红蛋白分子外部。缬氨酸疏水，此位点不易与水结合，水溶性降低，膜的性质改变微黏度增加，血红蛋白分子弹性降低，相互聚集沉淀，形态结构变化。链从N末端开始第六位的氨基酸残基，在正常的HbA分子中是谷氨酸，在病态的HbS分子中却被缬氨酸代替。本质（分子水平）：基因突变（碱基）诊断镰状红细胞贫血症的方法：1.RE-Southern blot 用放射性自显影技术确定在X射线片上所显示的与探针DNA杂交的条带位置（与电泳条带位置相同）采集制备血液DNA 内切酶Mst消化电泳转膜 32P标记的-珠蛋白cDNA杂交放射自显影230.2kb1

10、.15kb1.35kb正常人正常人 突变携带着突变携带着患者患者5 3 Mst（CCTGAGG-CCTGTGG)正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb基因组基因组DNA的的RE分析分析镰镰状红细胞贫血状红细胞贫血HBS-珠蛋白基因突变：珠蛋白基因突变：电泳方向2.PCR-RE设计引物PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切电泳EB染色直接观察设计引物PCR扩增珠蛋白基因第六密码子区域110bpMst 识别的核苷酸序列为CCTGAGG，是珠蛋白基因第5,6密码子序列和第七密码子序列的第一个碱基组成。正常人的扩增产物经Mst 消化可生成54bp和56bp两个片段25PCR-RE分析（MstII：CCTGAGG-CCTGTGG）正常人 患者 杂合子 电泳方向3.PCR-ASOASO为等位基因特异性寡核苷酸杂交法的简称，是基于核酸杂交的一种方法。根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备野生型和突变型基因序列互补的两种探针，分别与被检测样品中的D