第22章分子生物学常用技术

1、第二十一章常用分子生物学技术的原常用分子生物学技术的原理及应用理及应用The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application第第 一一 节节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，单链分子放在同一溶液中，或把或把DNA与与RNA放在一起，只放在一起，

2、只要在要在DNA或或RNA的单链分子之的单链分子之间有一定的间有一定的碱基配对碱基配对关系，就可关系，就可以在不同的分子之间形成以在不同的分子之间形成杂化双杂化双链链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理（一）印迹技术（一）印迹技术（二）探针技术（二）探针技术 探针探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。断是否有同源的核酸分子存在

3、。 二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体、重组质粒和噬菌体的分析。的分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 Paper TowelsSouthern BlottissueSDSProtKPhenolChloroformetha

4、nol precipitationSpin RNA印渍技术主要用于检测某一组织或细胞中已知的特印渍技术主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。达情况。Northern Blot放放射射自自显显影影照照片片目目 录录Western blotWestern Blot三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较 其他其他斑点印斑点印迹迹 (dot blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵点阵 (DNA array) DNA芯片技术芯片技术 (DNA

5、 chip)原原位位杂杂交交原位杂交技术可分析基因在染色体上的位置原位杂交技术可分析基因在染色体上的位置n原位杂交（原位杂交（in situ hybridization,ISH）是利用分子杂交技术）是利用分子杂交技术对基因在染色体上定位的一种技术。对基因在染色体上定位的一种技术。n基本程序是基本程序是细胞或组织固定细胞或组织固定预杂交预杂交杂交杂交冲洗冲洗放射自显放射自显影或标记酶显色影或标记酶显色分析结果分析结果。n原位杂交的特点是杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进原位杂交的特点是杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行。行。n荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）是一种非放射性原位杂交

6、方法，用特）是一种非放射性原位杂交方法，用特殊荧光素标记核酸（殊荧光素标记核酸（DNA）探针；）探针；n已有多重原位杂交，分辨率可达已有多重原位杂交，分辨率可达100200kb.分子杂交实验分子杂交实验目目 录录限制性内切酶谱分析法限制性内切酶谱分析法 限制性内切酶限制性内切酶 特异性特异性DNADNA探针探针 待测序列中发生突变时会导致某些限制待测序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶酶切位点发生改变，导致酶谱的改性内切酶酶切位点发生改变，导致酶谱的改变（如特异性片段的大小和多少改变），使变（如特异性片段的大小和多少改变），使得电泳迁移率改变得电泳迁移率改变Mst酶切位点酶切位点(GCTNA

7、GG)5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析RLFPRLFP分析法分析法中性突变：中性突变：人基因组中，平均每人基因组中，平均每200200对碱基可发生一次对碱基可发生一次突变，这种突变对生物体的生存既没有好处，也没有突变，这种突变对生物体的生存既没有好处，也没有害处。害处。DNADNA多态性：多态性：中性突变导致个体间核苷酸序列

8、的差异。中性突变导致个体间核苷酸序列的差异。限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性: :由于多态性发生限制性酶切位由于多态性发生限制性酶切位点上，导致导致酶切可产生长度不同的片段。点上，导致导致酶切可产生长度不同的片段。第第 二二 节节 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain Reaction1983.4 Kary Mullis1983.4 Kary Mullis在开车前去北加利福尼亚红在开车前去北加利福尼亚红树县树县Redwood countryRedwood country的一条被的一条被月光笼罩月光笼罩的山路的山路上构思了上构思了PCR PCR 随后卖给了随

9、后卖给了RocheRoche公司公司 价格：价格：10.000$10.000$ 1993 1993 Nobel prizeNobel prize n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ 二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分三、三、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）（二）基因的体外突变基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）参与基因突变分析的检测（五）参与基因突变分析的检测

10、四、四、PCR的主要用途的主要用途PCRPCR诱变诱变 在引物中在引物中引入非配对碱引入非配对碱基，通过基，通过PCRPCR引引物可以在扩增物可以在扩增产物中引入点产物中引入点突变，突变， 目的基因目的基因1目的基因目的基因2内参内参actin 1 2 3 4采用采用PCR技术也可以分析基因拷贝数技术也可以分析基因拷贝数三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术（二）原位（二）原位PCR技术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术RT-PCRRT-PCR分析基因转录水平的变化分析基因转录水平的变化 n逆转录逆转录PCR（reverse transcr

11、iption PCR，RTPCR）又称）又称RNAPCR。n 逆转录逆转录PCRReverse transcriptase-PCRAAA(A)n5-CapmRNA(dT)1218 primeranneal5-CapAAA(A)n35Reverse transcriptasedNTP5-CapAAA(A)n5cDNA:mRNA hybridRegularPCRFig RT-PCR内参n1、作定量分析时需要内参n2、常用的有actin、G3PDH等实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目 录录第第 三三 节节 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic Acid Sequence Analy

12、sis核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (sanger法法)DNA链末端合成终止法链末端合成终止法ddNTPdNTP目目 录录三、三、DNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四

13、种激光激发不同大小通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 DNA自动测序结果举例目目 录录基基 因因 文文 库库Gene Library第第 四四 节节基因组基因组DNA文库文库 (genomic DNA library)cDNA文库文库 (cDNA library) 基因文库基因文库 (gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。基因组

14、基因组DNADNA文库（文库（genomic DNA librarygenomic DNA library）将某一基因组将某一基因组DNADNA用适当的限制酶切断后，与载体用适当的限制酶切断后，与载体DNADNA重组，再全部转化宿主细胞，重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组克隆载体所携带的所有基因组DNADNA的集合的集合称为称为G G文库文库cDNAcDNA文库文库(cDNA(cDNA library) library)： 以某种细胞的全部以某种细胞的全部mRNAmRNA为模板，利用为模板，利用逆转录酶合逆转录酶合成与成与mRNAmRNA互补的互补的DNADNA（cDNAcDNA）再复制成双链再复制成双链cDNAcDNA, ,与适与适当的载体连接后当的载体连接后转化入受体菌，得到含转化入受体菌，得到含全部表达基因全部表达基因的种群，称为的种群，称为C-C-文库文库(cDNA(cDNA library) library)。C-C-文库具有组文库具有组织细胞特异性织细胞特异性。第五节 基因芯片n生物芯片是生物传感器的阵列和集成化：