温医研究生分子生物学课程总结

1、这份是2014级某人整理的，基本上都是上课涉及到的内容，里面“生物大分子（DNA,RNA,蛋白质）提取分离纯化的具体方法没有，分子生物学新技术几个名解就写啦CEMS，miRNA太多（可能是热点吧），RT-PCR没有具体，基因诊断实例缺。 其他的基本上都有啦。分子生物学：从分子水平研究生物分子的结构与功能从而阐明生命现象本质和生命过程规律的一门交叉科学 ；主要研究遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复）、基因的表达（转录和翻译）与调控。遗传学角度：基因（gene）：是指携带有遗传信息的DNA或RNA序列，也称为遗传因子。分子生物学角度：基因（gene）：是合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部

2、DNA，包括编码蛋白质或RNA的核酸序列及为保证转录所必需的调控序列。结构基因 ：可被转录成mRNA，并可翻译成多肽，构成结构蛋白或催化各种生化反应的酶。调节基因 ：指某些可调节、控制结构基因表达的基因。编码区：能够编码产生蛋白质的序列，包括外显子与内含子。前导区：位于编码区上游，相当于mRNA5端非编码区。调节区：包括启动子和增强子等基因编码区的两侧，也称为侧翼序列。断裂基因（splite gene）：真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因基因组（genome）：是指一个物种的单倍

3、体的染色体所携带的全部遗传信息。C值（C value）：一种生物体单倍体基因组的DNA含量总是恒定的，它通常称为该物种DNA的C值。C值矛盾：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象（又称：C值悖论，C value paradox ） 必需基因：指关系到生物体存活的基因，可通过基因突变的方法确定致死位点的数量，以得知基因组必需基因的数量 重叠基因（overlapping gene）是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。多顺反子mRNA：DNA序列中功能相关的蛋白质的基因丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转

4、录单元，它们可被一起转录成含有多个mRNA的分子。病毒基因组的结构与功能特征？ 病毒基因组基因组很小，且大小相差较大。 病毒基因组可以由DNA组成，或由RNA组成。 多数RNA病毒的基因组是由连续的RNA链组成； 基因重叠。 基因组的大部分可编码蛋白质，只有非常小的一部份不编码蛋白质。 形成多顺反子结构（polycistronie）。 病毒基因组都是单倍体（逆转录病毒除外）。 噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的，而少数真核细胞病毒的基因是不连续的。类核（nucleoid）：是指原核生物基因组通常由一条环状的双链DNA分子组成，在细胞中与蛋白质结合成染色体的形式，在细胞内形成一个致密的区域。原核生

5、物基因组的一般特点基因组较小（106bp107bp）功能上相关的几个结构基因串联在一起组成操纵子(operon)结构。结构基因均为单拷贝基因（除18s、28s、5s rRNA及tRNA基因外）不编码的DNA序列约占全基因组的10%以内（比真核生物少得多）：基因组中几乎没有重复序列，基因间几乎没有间隔，基因内没有内含子（古细菌除外）。不编码部分通常包含调控基因表达的序列DNA分子中有各种功能区，如复制起始区OriC，复制终止区TerC，转录起始区和终止区等，这些区域往往有反向重复序列，能形成特殊的结构。多顺反子：即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。转座子：能在基因组中从一个

6、位点移至另一位点的DNA序列称为转座因子（transposable element），又称为可转座元件。插入序列(insertion sequence，IS) ：2 000bp以内，两端正向重复序列（direct repeats，DR）、反向重复序列（inverted repeats，IR），中间1kb左右的编码序列，仅编码和转座有关的转座酶。复合型转座子( composite transposon) ：2 00020 000bp之间，两端由一对IS元件组成，带有与转座作用有关的基因和其他基因。 质粒（plasmid）：是指一类染色体外具有自主复制能力的环状双链DNA分子，属染色体外基因组。共

7、价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）没有游离的末端，每条链上的核苷酸通过共价键彼此头尾相连，这种结构称为,常形成超螺旋结构。严紧控制（stringent control）型质粒：其复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝。松弛控制（relaxed control）型质粒：其复制与宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。质粒的稳定性：质粒在宿主细胞内稳定地存在而不丢失称为质粒地稳定性。质粒的不相容性：两种不同的质粒因利用同一复制和维持机制，在复制和随后向子代细胞分配的过程中会发生竞争，从而不能在同一宿主细胞内稳定存

8、在，其中一种质粒将被丢失的现象。原核生物基因组的一般特点？1.基因组较小（106bp107bp）。2.操纵子结构是原核生物基因组的功能单位。3.结构基因均为单拷贝基因（除18s、28s、5s rRNA及tRNA基因外）。4.不编码的DNA序列约占全基因组的10%以内（比真核生物少得多）：基因组中几乎没有重复序列，基因间几乎没有间隔，基因内没有内含子（古细菌除外）。5.不编码部分通常包含调控基因表达的序列6.DNA分子中有各种功能区，如复制起始区OriC，复制终止区TerC，转录起始区和终止区等，这些区域往往有反向重复序列，能形成特殊的结构。真核生物基因组的结构与功能特点1.基因组DNA与蛋白质

9、结合形成染色体，储存于细胞核内， 除配子细胞外， 体细胞内基因组是双份的（即双倍体，diploid），有两份同源的基因组。2.基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录生成一个mRNA分子，再翻译生成一条多肽链。3.存在重复序列，重复次数可达百万次以上。4.基因组中不编码的区域多于编码的区域。5.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的（断裂基因，split gene）6.基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起始点，而每个复制子的长度较小rDNA：rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因组中，这样的区域称为rDNA，如染色体的核仁组织区（nucleolus organizer

10、 region）即为rDNA区。反向重复序列 ：是指两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上的反向排列。 卫星DNA ：是另一类高度重复序列，这类重复序列的重复单位一般由2-10bp组成，成串排列。 DNA多态性：是指DNA序列发生变异从而导致的个体间核苷酸序列的差异，主要包括：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和串联重复序列多态性（tandem repeats polymorphism）SNP：是由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性，相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易

11、感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。SNP被认为是一种能稳定遗传的早期突变。 多基因家族（multi gene family）：是指由某一祖先基因经过复制和变异所产生的一组基因。 珠蛋白基因家族：家族的不同成员成簇地分布在不同染色体上，但核酸序列高度同源，编码一组功能上紧密相关的蛋白质。假基因(pseudogene)：具有与功能基因相似的序列，但由于有许多突变以致失去了原有的功能，不能转录或转录后生成无功能的蛋白质的基因，常用表示。高等动物线粒体基因组具有独特的特点？1. 母系遗传。2. 线粒体DNA损伤后不易修复，突变率较高。3. 遗传密码与通用遗传密码存在差别。遗传图谱（genetic

12、map）：又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。遗传多态性：在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1%遗传学距离：在减数分裂中，两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1cM物理图谱（physical map）：利用限制性内切酶将大分子DNA切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离碱基对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)为路标的图谱。序列图谱：是分子水平上最高层次，最为详尽的物理图谱，可得到全部的DNA序列。基因图谱（转录图谱）：在识别基因组所包含

13、的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。基因定位克隆：是指利用微卫星和SNP全基因组扫描来搜索与疾病性状紧密相关的位点，从而确定疾病相关基因的位置并进一步获得克隆。宏基因组：是指生境中全部微小生物遗传物质的总和。宏基因组学：就是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分析为研究手段,通过非培方法进行某个特殊生态环境中微生物群落的鉴定。蛋白质组学(proteomics): 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质

14、功能与细胞生命活动规律。双向凝胶电泳技术（2-DE）：2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等电聚焦电泳与第二向SDS-PAGE组成的分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称2-DE。等电聚焦电泳是基于蛋白质等电点（pI）的差异进行分离，SDS-PAGE则是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离。等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点。等电聚焦电泳: 利用具有pH梯度的支持介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。等点聚焦：就是在电泳槽中放入载体两性电

15、解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上；优点：有很高的分辨率缺点：一是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；二是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。2-DE原理第一向电泳IPG等电聚焦电泳在电场中电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的pH梯度，由于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，带正电荷的蛋白质分子向负极移动，当蛋白质分子运动到各自的pI处时，所带净电荷变为零，于是停止迁移而留在该位置上。这种不同的蛋白质分别聚集

16、在各自的pI处，形成一条狭窄稳定的区带而彼此分开的现象称为等电点聚焦。第二向电泳SDS- PAGE 在PAGE系统中加入SDS和还原剂后所组成的电泳系统。SDS是一种阴离子去垢剂，疏水端能插入蛋白质分子内，破坏蛋白质分子内的氢键及疏水作用，改变蛋白质分子的三级和四级结构；还原剂则断裂蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质分子去折叠，结构变得舒展。蛋白质分子与SDS充分结合后，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，所带负电荷大大超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子间原有电荷的差异。蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再与电荷相关，而主要取决于蛋白质的分子量大小。 酵母双杂交技术(

17、yeast two-hybrid system) 一种用于研究蛋白质相互作用的方法手段，它利用酵母细胞内的真核表达系统，将两种外源蛋白质的基因分别与酵母转录因子的两个功能结构域融合，通过质粒导入酵母细胞，以酵母细胞表型的改变作为外源蛋白是否发生相互作用的筛选标志。基因工程（gene engineering ）：又称DNA重组技术（DNA recombination），是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。分子克隆（molecular cloning ）：是指将目的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子大量拷

18、贝的技术。限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。回文结构（palindrome structure）：指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。粘性末端（sticky end）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。平末端（blunt end）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。同工异源酶（isoschizomers）：指来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。 同尾酶（isocaudarner）：指识别序列不同，但能产生相同粘性末端的酶

19、。Taq DNA聚合酶（简称Taq 酶）：是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是7080，Taq酶具有5¢3¢ 聚合酶活性和依赖于聚合作用的5¢3¢外切酶活性。逆转录酶（reverse transcriptase）：是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶。RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP），核糖核酸酶H活性（RNaseH），DNA聚合酶活性（DDDP）。末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferas

20、e，TdT，简称末端转移酶）：分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3¢末端-OH上。DNA连接酶（DNA ligase）：主要功能是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5¢磷酸基团与3¢羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）：催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5¢-磷酸基团。核酸酶S1：可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分。载体（vector）：指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达

21、的工具。载体的本质为DNA。克隆载体：能将外源DNA在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目的DNA的载体。克隆载体应具备的特征1.能自我复制并具较高的拷贝数。2.分子量一般< 10Kb。3.带有遗传筛选标记。4.有适当的限制酶酶切位点，便于外源DNA的插入和筛选。多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）：载体上具有的多个限制酶的单一酶切位点。质粒：细菌染色体以外的小分子双链环状DNA，能自我复制并表达所携带的遗传信息。质粒克隆载体的主要用途： 用于保存和扩增< 2Kb目的DNA。 构建cDNA文库。 目的DNA的测序。 作为核酸杂交时的探针来源。溶菌性噬菌体

22、：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中，和细菌染色体一起复制。粘粒载体：由质粒和噬菌体的cos位点构建而成。表达载体:是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。报告基因：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因，又称报道基因。l噬菌体载体的用途1.用作一般的克隆载体。2.用于构建基因组或cDNA文库（<22Kb）。3.用于抗体库或随机肽库的构建。4.核酸的序列分析。粘粒载体组成：1.质粒复制的起始位点(Ori)。2.携带抗药基因。 3.用于插

23、入目的基因的单一酶切位点。4.噬菌体的cos位点。真核基因在原核细胞中表达需要保证外源基因：1. 插入方向的正确性；2. 受原核启动子的控制；3. 必须能在原核细胞中有效转录和有效翻译。终止子：一个基因的3¢末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能。原核细胞表达载体的类型1.非融合型表达载体：产生外源蛋白，易被原核细胞蛋白酶降解。如pKK223-3质粒载体。2.分泌型表达载体：产生带信号肽的分泌型融合蛋白，可减少外源蛋白被降解以及使蛋白质能在细胞外正确折叠，易提取。如PINlll系列。3.融合型表达载体：产生由较短的原核细胞多肽和真核细胞蛋白质构成的融合蛋白

24、，具有抗原性，较天然的外源蛋白稳定。如pGEX系列。基因工程的基本步骤1. 目的基因的获取2. 载体的选择3. 目的基因和载体的连接4. 重组DNA导入受体细胞5. 重组体的筛选和鉴定目的基因的获取1从基因文库中获取2. 逆转录合成cDNA3人工合成DNA片段4直接从染色体DNA中分离目的基因目的基因：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表达的基因。基因组文库（genomic library，G-文库）：是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。转化（transformation）：是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。感受态细胞(competent cel

25、l)：细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞。重组体的筛选 根据载体的抗药性标志筛选 1. 根据载体抗药性标志插入失活选择2. b-半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选法）3. 根据插入的外源性基因的性状进行筛选4. 核酸杂交技术筛选蓝白斑筛选：某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ¢基因，该基因含一段编码b-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸a-肽的DNA片段，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型b-半乳糖苷酶实现基因内a-互补，形成完整的b-半乳糖苷酶，催化指示剂底物X-gal 形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。当外源基因插入lacZ¢基因中MCS，

26、lac a-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无b-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落。重组体的鉴定1. 根据重组子大小鉴定 2. 酶切鉴定3. PCR鉴定4. DNA序列分析鉴定核酸变性：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。解链曲线：如果DNA是热变性而导致增色效应，以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。融解温度（ melting temperature，Tm）：在热变性过程中，紫外吸收增加达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度。Tm的影响因素1

27、.DNA分子大小和碱基的组成2.溶液的离子强度3.pH值4.变性剂复性（renaturation）：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。退火（annealing）：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。核酸复性的影响因素1. 温度和时间2. DNA浓度3. DNA分子大小和复杂度4. 离子强度核酸分子杂交（molecular hybridization）:两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。核酸探针（nucleic acid

28、probe)：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。选择探针的基本原则1 .高度特异性2.探针的来源是否方便3.制备探针的难易程度核酸探针的类型1. 基因组DNA探针2. cDNA探针3. RNA探针4. 寡核苷酸探针cDNA(complementary DNA)：是指与mRNA互补的DNA分子。固相分子杂交：是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。正向斑点杂交：简称斑点杂交，将待检样品（DNA、RNA 或细胞）直接点到膜上，烘烤固定。反向斑点杂交：将不同

29、的探针分别点到尼龙膜等固相介质上，再将已标记的待测DNA样本与之杂交，经洗涤去除未结合的DNA样本。寡核苷酸探针设计原则 探针长度：一般要求在1050bp。 GC含量为4060。 探针分子中应避免互补序列。 避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或 -CCCC-。 借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较。 理想的探针标记物应具有以下特点： 检测物要灵敏、特异、稳定、简便。 标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂 交特异性、稳定性和Tm值。 标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。 标记物对检测方法无干扰。 分子杂交技术一般流程1. 探针制备及标记（同位素

30、或非同位素） 2. 待测核酸样品制备（分离，纯化）3. 杂交（液相，固相，原位杂交）4. 杂交后处理（去掉非特异杂交分子）5. 显示结果（显色，发光，放射自显影）6. 结果分析Northern印迹杂交与Southern印迹杂交的不同点 RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染。 所用器材最好与Southern印迹实验分开使用。 RNA变性的方法：变性剂为甲醛或聚乙二醛，不能用碱变性。 印迹前将含变性剂的凝胶用水冲洗掉， 再印迹、杂交。 如果测定RNA片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。 转印后不能用低盐缓冲液洗膜。正向

31、斑点杂交：简称斑点杂交，将待检样品（DNA、RNA 或细胞）直接点到膜上，烘烤固定。反向斑点杂交：将不同的探针分别点到尼龙膜等固相介质上，再将已标记的待测DNA样本与之杂交，经洗涤去除未结合的DNA样本。菌落杂交：将细菌从培养平板转移到硝酸纤维滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释放出DNA，将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。夹心杂交法：设计两条能与目的基因序列互补但又不重叠的探针，一个称为捕获探针，另一个称为检测探针，目的基因被夹在两个探针之间。微板酶联杂交的优点 捕获探针共价结合在微孔板上，不仅结合牢固而且结合量大，因而捕获能力很强

32、。 捕获探针竖直地而不是平躺地“包被”在微孔板表面，因而与目的片段的杂交效率很高。 检测探针5端、3端均标记生物素，等量检测探针结合亲合素-辣根过氧化物酶的量增加。原位杂交（In situ hybridization ）：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。原位杂交的应用 正常或异常染色体的基因定位。 应用核酸探针与细胞内RNA进行杂交用于检测该组织细胞中特定基因表达水平。 应用特异的病原体核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以检测有无该病原体的感染等。原位杂交基本流程1.细胞或组织切片的处理：玻片清洗、组织和细胞的固定2.增强组织的通透性和核

33、酸探针的穿透性3.预杂交4.杂交5.杂交后漂洗6.结果检测荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization, FISH）：是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。基因芯片(gene chip)：又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray），是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纤维膜等载体。杂交条件优化1、探针的选择 检测单个碱基改变选用寡核苷酸探针。 检测单链靶序列选用与其互补的DNA单链探针或RNA探针。 长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体。 100bp左右的探针适合原位杂交。

34、2.探针的标记方法在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和价廉的HRP显示系统等 。3、探针的浓度随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。 膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为510ng/ml和251000ng/ml。原位杂交中，一般各种标记探针，其用量均为0.55.0g/ml 。4、杂交最适温度 若反应温度低于Tm 1015，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。 一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在65进行，当含50%甲酰胺时，在4

35、2进行。5、反应时间和洗膜温度 杂交时间短了，反应无法完成；长了引起非特异结合增多。一般杂交20 h左右。 杂交后的最终洗膜温度一般应低于Tm值512进行 。基因芯片的应用1. 基因表达水平的检测2. 基因突变和多态性的检测 3. 基因芯片在药物筛选中的应用4. 预防医学领域的应用 5. 基因芯片在疾病诊断中的应用：感染性疾病诊断 、遗传性疾病的诊断基因诊断：分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学技术，直接检测遗传物质结构和表达是否异常，从而对疾病做出判断的方法。基因诊断特点：1. 灵敏度高，特异性强。2. 可以进行病因诊断。3. 病原体诊断时所耗时间短，同时可以检查成百上千个病原体4. 在症状

36、出现前作出前瞻性诊断。遗传性疾病的基因诊断策略1. 直接诊断策略2. 间接诊断策略感染性疾病的基因诊断策略1.一般性检出策略2.完整检出策略肿瘤的基因诊断策略1. 检测肿瘤相关基因2. 检测肿瘤相关病毒基因3. 检测肿瘤标志物4. 表观遗传学检测基因治疗（ Gene therapy ）：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。广义概念，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。基因治疗的必备条件：1. 分子缺陷清楚2. 可以得到相应基因的克隆3. 病理生理机制已知4. 有利的风险-利益比5. 治疗基因可以被调控6. 合适的靶

37、细胞7. 有效安全8. 相关法规健全基因治疗的总体策略针对致病基因：（1）基因矫正（gene correction） 对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能； （2）基因置换（gene replacement） 用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态； （3）基因增补（gene augmentation） 将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除；（4）基因表达调节（modulation ） 指将特定的反义核酸、RNA干扰或核酶等技术抑制目的基因表达从而消除致病基因的作用。针对非致病基因：（1）自杀基因

38、 这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药 物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。 （2）免疫基因治疗 将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。 （3）耐药基因治疗 在肿瘤化疗过程中， 把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。基因治疗的基本程序1. 目的基因的选择和获取 2. 目的基因与转运载体结合3. 靶细胞的确认 4. 载体携带外源基因进入细胞5. 外源基因的整合6. 外源基因的表达及检测 7.

39、治疗作用及稳定性、安全性评价逆转录病毒载体的特点（1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；（2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；（3）感染靶细胞后不扩散；（4）假病毒感染靶细胞的效率非常高；（5）不感染非增殖细胞。缺点: 容量小，只能容纳8kb-10kb的外源基因片段； 血清补体能使之失活； 病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度； 病毒整合到DNA后，可能引起插入突变和激活癌基因的可能； 宿主范围有限，只感染增殖细胞，故在应用上有一定局限性。腺病毒载体特点（1）宿主范围广（2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件（3）可获得高病毒效价（4）重组体非常稳定（5）不会引起肿瘤（6）有较高

40、的安全性（7）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用（8）不整合入染色体痘苗病毒载体 优点：1. 宿主范围广泛且易于培养，容易获得高滴度的病毒颗粒。2. 允许在同一或不同非必需区插入多个基因，以表达多种或一种外源蛋白。缺点：细胞毒性；病毒能被人体的补体系统灭活并降解 单纯疱疹病毒载体特点（1）滴度高（2）容量大（3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染（4）不整合，但可长期存在并可稳定表达脂质体载体：是用人造双层磷脂质，包装DNA 后形成的脂质体-DNA复合物。优点：（1）无毒无抗原性；（2）目的基因与脂质体的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大；（3）可单独或联合其他载体使用，并可通过静脉注射使目的

41、基因进入特定部位。 缺点：表达时间短，不能通过细胞膜屏障 分子耦联载体：由DNA、DNA结合因子和配体三部分组成。配体与特异的受体结合，经受体介导的细胞内吞途径，将目的基因转移至细胞内。 多聚物载体：利用带正电荷的多聚阳离子与带负电荷的DNA相结合，形成稳定的多聚复合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可与细胞表面带负电荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。 纳米微生物优点：(1)纳米脂质体主要由磷脂以及胆固醇合成，可以通过与细胞膜的融合或者胞吞作用将目的基因导入靶细胞； (2)纳米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在传递过程中无毒，无免疫原性，并且可以通过新陈代谢降解，因此不会对细胞产生毒性；

42、 (3)通过调节纳米材料的降解速度，还可以控制目的基因的释放速度，延长其治疗效果； (4)纳米基因载体比表面积大，并可在表面偶联靶细胞的配体或抗体，实现基因治疗的主动靶向性，大大提高基因传递的特异性和加强靶细胞对目的基因的摄取。 靶细胞的选择原则：（1）必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内；（2）具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；（3）易于受外源遗传物质的转化；（4）在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞 。干细胞:一种具有复制能力、可以形成各种组织的早期未分化细胞进行基因治疗必须具备下列条件：（1）选择适当的疾

43、病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚；（2）纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件；（3）该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；（4）具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。 靶向性基因载体的选择：1.靶向特异性，并且可被免疫系统识别。2.高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化。3.安全，无毒性，对人体以及环境无危害。4.有利于基因高效转移和长期表达。反义技术：是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段，使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的。RNA干扰（RN

44、A interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。小干扰性RNA（siRNA）：长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA，siRNA）。RISC ：RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,)，siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RISC。该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRN

45、A切断。基因治疗存在的问题：1.导入基因的稳定高效表达；选择合适的转移方法；选择适当的受体细胞。 2.导入基因的安全性；一方面应构建相对安全的反转录病毒载体；另一方面，应寻找更安全的非病毒载体；体细胞基因治疗。 3.基因治疗与社会伦理道德 。基因治疗应满足的条件1、单基因缺陷疾病2、仅限体细胞的基因治疗3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。 4、治疗效果应胜过对病人的危害。 5、表达水平无需调控且无副作用。 6、需经动物实验验证安全可行。基因治疗有待解决的问题1、难以获得真正有治疗作用的基因。 2、外源基因的表达难以在体内精确调控。3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变。4、过多的外源蛋白

46、对机体带来可能的影响。5、随机整合潜在的威胁。生物分子（Biomolecule）：泛指生物体特有的各类分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。生物大分子：生物体内结构具有一定规律性，由基本结构单位按一定顺序和方式连接而形成的多聚体。主要是指蛋白质、核酸和糖复合物，是生命活动的物质基础。提取：在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于适当的溶液中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶液中，最大限度分离出来的过程。根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型：（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；（2）根据分子形状和大小不

47、同，如凝胶过滤层析等；（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。（5）根据配体特异性，如亲和层析。影响提取效果的因素1. PH值2. 盐浓度3. 温度4. 水解酶5. 搅拌与氧化6. 有机溶剂盐溶：蛋白质或酶在稀盐溶液中，溶解质随着盐浓度升高而增加。盐析：蛋白质或酶在稀盐溶液中，溶解质随着盐浓度升高而增加。但当盐浓度达到一定数值时，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。选择性沉淀法：生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白变性沉淀而得到分离提纯。超滤：指在一定压力下，使小分子溶质和溶剂穿

48、过一定孔径的特制的薄膜，而大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到部分纯化。对于核酸的纯化应达到以下三点要求：（1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂； （2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度； （3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。保持核酸的完整性（1）温度不要过高(04)；(高温破坏氢键)（2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破坏磷酸二酯键) （3）保持一定离子强度; （4）减少物理因素对核酸的机械剪切力。DNA提取，DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

49、原因：1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2. DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3. DNA中残留有金属离子对策：1. 重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2. 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3. 增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）DNA降解原因：1. 材料不新鲜或反复冻融2. 未很好抑制内源核酸酶的活性3. 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4. 外源核酸酶污染5. 反复冻融对策：1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的

50、含量4. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融DNA提取量少原因：1. 实验材料不佳或量少2. 破壁或裂解不充分3. 沉淀不完全4. 洗涤时DNA丢失对策：1. 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2. 动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3. 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4. 低温沉淀，延长沉淀时间5. 加辅助物，促进沉淀6. 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒蛋白质分离纯化的总体原则一是保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活性蛋白质的变性；二是尽量满足研究与诊

51、断对靶蛋白纯度的要求。蛋白分离纯化影响因素：1. 缓冲液2.盐、金属离子和螯合剂3. 还原剂 4. 去垢剂5. 增溶剂 6. 蛋白酶抑制剂7. 蛋白质的环境因素：表面效应的影响；温度的影响；保存的方式。蛋白质的纯度：指是否含有其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内，及在一定条件下的相对均一性。凝胶过滤层析：亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。电泳：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳。亲和层析：是以蛋白质与结合在介质上的配基间的特异亲

52、和力为工作基础的蛋白质分离方法。纯化程度：常用某一特定靶蛋白成分的含量（一般用活力单位）与总蛋白量（质量单位）之比来表示。蛋白质的分离纯化方法：1.以溶解度的差异为依据的方法：盐析、分配层析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀和结晶等；2.以分子大小及形状差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤层析等；3.以电离性质差异为依据的方法：电泳、离子交换层析等；4.以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析。生物小分子提取方法：1、溶剂提取法2、水蒸气蒸馏法 3、升华法 4、超临界流体萃取法 5、超声提取法 6、固相萃取法 分离精制的原理主要是根据：1.物质溶解度差别；2.物质在两相溶剂中的分

53、配比不同；3 .物质的吸附性差别；4.物质分子大小差异等进行分离生物小分子纯化方法液-液萃取法1、逆流分配法（CCD） 2、液滴逆流色谱法（DCCC）3、高速逆流色谱法（HSCCC）4、气液分配色谱（GC或GLC）沉淀法1. 溶剂沉淀法2. 酸碱沉淀法3. 盐析法了解超临界流体：(SF)指某种气体（液体）或气体（液体）混合物在操作压力和温度均高于临界点时，使其密度接近液体，而其扩散系数和黏度均接近气体，是性质介于气体和液体之间的流体。超临界流体萃取法（SFE）:利用超临界流体为溶剂，从固体或液体中萃取出某些有效组分，并进行分离的一种技术。超生提取法：利用超声波特殊的强纵向振动、空化效应、高速冲

54、击破碎、搅拌及加热等物理性能，破坏提取物细胞结构，使溶剂能渗入细胞内部，从而加速有效成分的溶解，提高有效成分的提出率。固相萃取法：利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。PCR特点：1.灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平；能从100万个细胞中检出一个靶细胞；病毒检测的灵敏度可达3个 PFU (空斑形成单位)；细菌检测的最小检出率为3个细菌2.简便、快速一次性加好反应液，24 小时完成扩增；扩增产物一般用电泳分析3.对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细

55、胞、活组织等组织的粗提DNA平台效应:DNA的指数扩增并不能无限期地进行下去，PCR循环后期时由于引物、dNTP消耗、DNA聚合酶活力下降等因素使地扩增产物累积趋于饱和，原来以指数递增的速率曲线变成平坦的曲线，此现象称为平台效应。引物设计基本原则1. 引物长度，典型的引物为18-24个核苷酸，在一定范围内引物需要足够长，最多不超过50个核苷酸。2. PCR产物长度，扩增片段长度在普通PCR以200500bp为宜；实时荧光PCR则为50150bp。3. 引物的均衡性和GC含量，同一碱基连续出现不应超过5个，G-C含量一般为40-60%。4. 引物溶解温度（Tm值），引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.聚丙烯酰胺凝胶电泳特点1.分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；2.上样量远大于琼脂糖凝胶；3.回收的DNA纯度高；4.采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）：根据目的基因序列可查出所包含的酶切位点，用相应的限制性核酸内切酶消化PCR扩增产物，然后进行电泳，观察消化片段的大小是否与序列资料相符，从而确定产物的特异性。单链构型多态性