第五讲 RNA的生物合成

1、第五讲 RNA的生物合成以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚合酶的催化下合成RNA的过程，称为转录（transciption）。把与m RNA序列相同的那条DNA链称为编码链（coding strand）或有意义链（sense strand），并把另一条根据互补原则指导m RNA合成的DNA链称为模板链（template strand）或反义链（antisense strand）。贮藏在任何基因中的生物信息都必须首先被转录生成RNA，才能得到表达。除了少数的RNA病毒，所有RNA分子都来自DNA。储存于DNA双链中的遗传信息通过碱基互补配对原则转化为单链RNA分子。生物体内共有3种RNA：

2、编码特定蛋白质序列的信使RNA（messenger RNA, m RNA），能特异性解读mRNA中的遗传信息、将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的转移RNA（transfer RNA, t RNA），直接参与核糖体中蛋白质合成的核糖体RNA（ribosomal RNA, r RNA）。一、RNA的转录无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程包括：模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。1、 转录的特点2、 转录过程中所需物质1） 底物2） 模板3） RNA聚合酶A 聚合酶的特点B 大肠杆菌RNA聚合酶大肠杆菌RNA聚合酶由2个亚基、一个亚基、一个亚基和一个亚基组成，称为核心酶(core

3、 enzyme)。加上一个亚基后则成为聚合酶全酶（holoenzyme），相对分子质量为4.65105。亚基可能与核心酶的组装及启动子识别有关，并参与RNA聚合酶和部分调节金子的相互作用。实验证明，T4噬菌体感染大肠杆菌后对亚基的一个精氨酸残基进行ADP糖基化修饰，造成RNA聚合酶全酶对启动子亲和力降低。因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，酶底结合常数提高103倍，酶底复合物的半衰期可达数小时甚至十小时。因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异为点的结合常数降低104倍。因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始使酶专一性识别模板上的启动子。在某些细菌细胞内包含有能识别

4、不同启动子的因子，以适应不同生长发育阶段的要求，调控不同基因装炉的启示。列如，枯草杆菌中就有6种不同相对分子质量的因子。C 真核生物的RNA聚合酶真核生物中有3种RNA聚合酶，即RNA聚合酶I、RNA聚合酶和RNA聚合酶，分布于细胞核的不同部位。它们之间的区别主要在于对-鹅膏碳碱的敏感性：最敏感的是聚合酶，存在于核质中，转录前体m RNA；其次是聚合酶，也存在于核质中，转录t RNA、5S r RNA和其它几种小分子RNA；不敏感的是聚合酶I，存在于核仁中，转录r RNA。这三种聚合酶的相对分子量都在5105左右，一般为814个亚基。聚合酶研究得比较深入，至少由1012个亚基组成，有2个最大亚

5、基。第一大亚基相对分子量为2.4105，相当于细菌RNA聚合酶的亚基，其羧基端有多磷酸化位点的7肽重复序列，称为羧基末端结构域（carboxy-terminal domain, CTD），为聚合酶独有特征，可能是转录起始过程中不同阶段的开关。第二大亚基的相对分子量为1.4105，与大肠杆菌RNA聚合酶亚基有同源区，可能类似原核生物RNA聚合酶的亚基的识别功能。真核生物除上述3种RNA聚合酶外，在线粒体和叶绿体中，也发现了少数的RNA聚合酶，它们都是由核基因编码，在细胞质中合成后再运送到细胞器中。这些RNA聚合酶的相对分子质量小，活性也比较低，这与细胞器DNA的简单性是相适应的。4）终止因子 因

6、子是一种强碱性蛋白，由3个二聚体组成，能与RNA结合。能水解各种核苷酸三磷酸，实际上是一种NTP酶。RNA合成起始以后，因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着53方向朝着RNA聚合酶移动，到达RNA的3OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，使之从模板DNA上释放m RNA，完成转录过程。3 原核生物的转录 一般过程包括启动、起始、延伸、终止。1）启动子A 定义B 几个概念C 启动子的结构2）识别原核生物RNA聚合酶中的因子识别转录起始点，并促使核心酶结合形成全酶复合物。被辨认的区段就是位于转录起始点-35区的TTGACA序列。酶与该区结合后，即滑动至-10区的TAT

7、AAT序列（Pribnow盒），并启动转录。因子在DNA双链上迅速、随机滑动,寻找到启动子因子识别转录起始点（-35区）促使核心酶结合形成全酶复合物酶与该区结合后,即滑动至-10区,并启动转录。 3）起始4）延伸 核苷酸不断加到RNA链的3OH上，RNA链就延长。酶沿DNA链移动，解开DNA螺旋，裸露一段新的单链模板区，核苷酸以共价键加合到RNA成长链的3末端，在去螺旋区形成一段RNADNA杂交链。在解螺旋的后部，DNA摸板链由于原配对链重新形成双螺旋，RNA以自由单链形式被挤出来。 在延伸过程中，DNA分子和酶分子发生构象的改变。DNA从解旋到重旋。酶分子也是如此。在转录起始阶段，全酶与DN

8、A分子形成稳定的复合物；在延长阶段，亚基从全酶上释放出来，由核心酶负责链的延伸。亚基的存在与否，因其与亚基构象上的变化，即当亚基缔合时，与表现为有利于专一与DNA结合的构象，而亚基释放后留下核心酶，则与DNA结合不专一，不能形成稳定的复合物。 链的延伸速度是不恒定的，在DNA某些区域，转录速度减慢或停止，这种速度的降低叫pause，pause发生在复含GC区，在图中，由于GCAT的变化，使得突变株消除了pause，因为GC变成AT后降低了氢键的稳定性。 一个RNA聚合酶附属因子，称为NusA蛋白。像一样，NusA与RNA聚合酶的核心酶结合，但不那么牢固。在细胞中，当释放出来以后，NusA就马上

9、与RNA聚合酶分子结合，并转录出一条RNA链。但是，在转录时，NusA并非总是固定在一个RNA聚合酶上，二是可以和几个RNA聚合酶分子起作用。RNA聚合酶从DNA分子上释放出来后，因子由于与核心酶的亲合力比NusA大，所以又取代了NusA与核心酶结合在一起。5）终止（1）不依赖于因子的终止 终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发夹结构。在终止位点前面有一段由48个A组成的序列，所以转录产物的3端为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。 在新生RNA中出现发夹式结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏RNADNA杂合链5端的正常结构。寡聚U的存在

10、使杂合链的3端部分出现不稳定的r UdA区域。两者共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。（2）依赖于因子的终止 RNA合成起始以后，因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着53方向朝着RNA聚合酶移动，到达RNA的3OH后端取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，使之从模板DNA上释放m RNA，完成转录过程。4 转录后的加工 RNA在转录完成后，继续形成具有功能的活性的RNA分子。即转录后加工（Post-transcriptional processing）在转录中新合成的RNA往往是较大的前体分子，需要经过进一步的加工修饰，才转变为具有生物学活性的、成熟的RNA分子，这一

11、过程称为转录后加工或RNA的成熟。主要包括剪接、剪切和化学修饰。 与一个多肽链相对应的DNA片段加上启动部位再加上终止部位叫做一个顺反子，一次转录下来的mRNA可以包含一个顺反子也可以包含多个顺反子，分别叫做单顺反子mRNA（mono-cistron mRNA）和多顺反子mRNA（poly-cistron mRNA）。原核生物中，多顺反子mRNA比单顺反子更普遍。 由于转录与翻译过程偶联，大多数原核生物mRNA都不需要加工，转录后直接翻译；只有少数多顺反子mRNA需要经过加工，切成小单位后再进行翻译。 rRNA 和tRNA的合成过程与mRNA没有什麽不同，但r RNA 和t RNA有以下三点特

12、性与mRNA不同：成熟的rRNA和tRNA5端是5-单磷酸； 比原初转录产物小； 所有tRNA都含有稀有碱基1）mRNA的加工 少数多顺反子mRNA须通过核酸内切酶切成较小的单位，然后再进行翻译，加工的意义在于可对mRNA的翻译进行调控。T7早期转录的6个基因转录成一个大的多顺反子mRNA分子，每个mRNA分子之间有茎环结构，RNaseIII在茎环处将大分子切开，形成单个mRNA分子进行翻译。切点在不配对的泡上，而不是在环上。2）tRNA的加工 tRNA的种类远比r RNA要多，在原核生物中有3040种。并且一些tRNA基因和rRNA基因连接在一起。此外，tRNA基因多以基因簇存在，构成多顺反

13、子转录单位。原核的tRNA初始转录本多为多顺反子（polycistron），也就是几个tRNA分子串连在一起。这有三种不同的情况：串联的tRNA分子都是相同的，如在27的tRNATyr-tRNATyr；串联的tRNA分子是不同的，如71的tRNAIle-tRNAAla-tRNAThr；由tRNA和rRNA串联组成。少数的tRNA前体为单顺反子（monocistron）如43的tRNAser（图13-1）。tRNA的加工分成3个阶段（图13-2）：(1) 剪切、修剪和剪接： RNase P是一种不常用的酶，是由23蛋白和至少77RNA组成的复合体。其RNA长375nt，分子量为130kDa。RN

14、ase P具有内切酶的活性，是一类主要的加工酶，可切除E.coli前体tRNA 5端的前导序列（41nt），形成成熟的5末端，也被叫做tRNA5成熟酶。此酶不识别特殊的序列，而识别二级结构发夹所组成的tRNA。实验还发现，RNase P的专一性也与3CCAOH有关。RNaseF是3内切核酸酶，切下前体中3端的核苷酸序列。RNase和RNaseE在tRNA加工中可能也起作用，使大的新生转录产物变得小些。 RNaseD，分子量38000U，为单一亚基蛋白质。可以从3端逐个切去附加的序列，以暴露出tRNA3端，是体内3tRNA成熟酶。 （2）核苷修饰 成熟的tRNA分子中含有许多修饰成分，不同的tR

15、NA所含修饰成分种类和数目都各不相同。tRNA的修饰是在多核苷酸链上进行的，由修饰酶所催化。 tRNA修饰酶具有高度的专一性，一般说来，每种修饰核苷都有催化合成本身的修饰酶。 tRNA甲基转移酶，高度的专一性，如tRNA（腺嘌呤1）甲基化酶催化tRNA中特定位置的Am A，tRNA甲基化酶也具有严格的顺序要求，如酵母中的二个甲基化酶，分别甲基化tRNA中的G19和G43生成m1G19和m1G43。 还有tRNA异戊烯转移酶、tRNA鸟嘌呤转糖苷酶和tRNA合成酶。3）rRNA的加工 大肠杆菌中的rRNA有三种：5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA。这些rRNA和几个tRNA全部包

16、含在一个具有5000个核苷酸的转录子中。 当转录子完成以后，一序列的酶与之作用。其中最主要的是RNase，这是一种切割双链RNA的酶。四、真核生物的转录 真核生物的顺式作用元件，即DNA上对基因表达有调节作用的特定序列，包括启动子、增强子、沉默子。 真核生物的转录，是由RNA聚合酶与这些元件相互作用，在蛋白质辅助因子的协同下完成的。1、启动子的结构 真核生物有3种RNA聚合酶，每种酶都有自己的启动子。1）RNA聚合酶的启动子 Pribnow实验时发现5个核苷酸组成的共有序列，RNA聚合酶紧密结合位点，称为Pribnow区，又位于上游10bp处，又称为10区。2）RNA聚合酶的启动子真核生物DN

17、A序列5上游区有一段与原核生物Pribnow区相似的富含TA的保守区列。在2535区含有TATA序列，称为TATA框（hogness box），它可选择转录起始位点，控制转炉的精确性。在7080区含有CCAAT序列，为CAAT框，共有序列是GGCCCAATCT，决定启动子的起始频率。在80110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列，称为GC框，也具有调控启示和转录效率的功能。3）聚合酶的启动子 可以用上游和下游启动子。分为两类：内部启动子和上游启动子。2、增强子的结构 能强化转录起始的序列成为增强子或强化子（enhancer）。增强子位于上游，距转录起始点至少100bp以上，是一种远端控

18、制元件，又称游上激活序列（upstream activating sequence, UAS）或上游启动子元件（upstream promoter element, UPE），它通过启动子来增强转录效率。增强子区的跨度一般为100200bp，由812bp的“核心”组件构成，共有序列为TGGAAAG与TTT，可有完整或部分的回文结构，并以单拷贝或多拷贝的形式存在。增强子通常能距转录起始点14kb，甚至30kb外起作用。 增强子是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物、甚至在原核生物中都发现了增强

19、子。增强子通常占100-200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，其基本核心组件常为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子的作用有以下特点：增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离起作用，通常可距离1-4kb、个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。增强子的作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒置就不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同的。增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现活性。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。例如当含有增强

20、子的病毒基因组整合入宿主细胞基因组时，可能够增强整合区附近宿主某些基因的转录；当增强子随某些染色体段落移位时，也能提高移到的新位置周围基因的转录。使某些癌基因转录表达增强，可能是肿瘤发生的因素之一。增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的。3、转录因子 真核生物的转录起始较为复杂。目前已知RNA聚合酶至少有六种不同的蛋白因子参与转录复合体的形成。这些蛋白因子被称为转录因子（trans-criptional f

21、actor, TF)。包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TF-I。 4、转录的过程1）起始复合物的形成：，TFD与TATA框特异结合，形成TFD启动子复合体；TFD是起始转录中最重要的基本起始因子。TFA进入复合物，使TFD能够保护上游更远的区段。TFB结合于TATA框的下游，保护模板链的起始区域。TFF携带RNApol装配转录复合物。TFE结合，保护延伸的下游区段。 真核生物转录的起始，基本上与原核相似，先形成封闭复合物，再转变成开放复合物。2）延伸 延伸前，TF因子要释放，便于聚合酶活动转录。TF因子释放后，RNA聚合酶转变为延伸过程。TFH因子再延伸中起重要作用。TFH和TF

22、E结合进入无缠绕的DNA区带，使RNA聚合酶开始移动进行转录。3）终止 目前机制还不是特别清楚，在一些因素的影响下，如，受到核小体结构的影响、蛋白因子与转录的3端结合、DNA双螺旋结构弯曲、DNA形成环状结构等等，转录起始复合物被迫停止在一定位置上，只是转录停止。修饰位点.转录越过修饰点后,合成的mRNA被切断,随即加polyA尾巴和5帽子.余下的RNA虽然继续转录,但很快被RNA酶降解.5 转录后的加工 真核生物的核DNA，由于基因的长度和性质的差异，原使转录产物很不均一，被统称为不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）。1）mRNA的加工A 帽 成熟

23、的真核生物mRNA，其结构的5端都有一个m7G-PPNmN结构，该结构被称为甲基鸟苷的帽子。鸟苷通过5-5焦磷酸键与初级转录物的5端相连，反应由鸟苷转移酶完成。当鸟苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN时，此时形成的帽子被称为“帽0”，被尿苷酸7甲基转移酶催化。第一个甲基出现在所有真核生物中，单细胞真核生物主要使这个结构。如果除m7G-PPNmN外，在第二个核苷酸核糖的第“2”号碳上也甲基化，形成m7G-PPNm，称为“帽1”，真核生物中以这类为主。如果5末端N1和N2中的两个核糖均甲基化，成为m7G-PPNmPNm2，称为“帽2”。有帽2的mRNA只占有帽mRNA总量的1015以下。

24、从真核生物帽子结构形成的复杂可以看出，生物进化程度越高，其帽子结构越复杂。有帽结构的mRNA可免遭核酸酶的破坏，更容易被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质的合成。B尾目前还不清楚RNA聚合酶所转录基因的准确终止位点，但研究发现，几乎所有真核基因的3末端转录终止位点上游1530bp处的保守序列AAUAAA对于初级转录产物的准确切割及加尾是必需的。大多数的真核mRNA 都有3端的多聚尾巴（A），多聚（A）尾巴大约为200bp。多聚（A）屠巴不是由DNA编码的，而是转录后在核内加上去的。加polyA时需要由内切酶切开m RNA3端生物特定序列，然后受polyA聚合酶催化，该酶能识别，mRNA

25、 的游离3-OH端，并加上约200个A残基。polyA是mRNA由细胞核进入细胞质所必须的形式，大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。C 剪接 在5端帽子和3端尾巴形成以后，内含子一个一个被切除，外显子连接形成成熟的m RNA，这个过程就是RNA的剪接（核内） 。mRNA拼接反应需要有核内小分子RNA参与，以及它们与蛋白质形成的复合物称为小核糖核蛋白颗粒（snRNA），SnRNA分别被命名为U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA(由100-200个核苷酸组成)。步骤：U1snRNA以碱基互补的方式识别mRNA前体5剪接点；由结合在3剪接点上游富嘧啶区的U2AF因子引导SnRNA中的U2sn

26、RNA与分支点相结合，形成一个剪接前提，并进一步与U4、U5、U6snRNA相结合，形成环状结构剪接体，由特定的酶来识别切除该环状结构，完成剪接过程。 内含子通常是有序或组成性的从mRNA前体中被剪接。真核生物 mRNA前体在剪接过程中，还可以形成套索样的结构，在内含子序列中常有一个分支部位的腺苷酸残基，它的2-OH可以自动攻击内含子5端与外显子1连接的磷酸二酯键，切开了外噗子1，而腺苷酸原来已有3，5-磷酸二酯键相连的两个相邻的核苷酸残基，加上此3，5-磷酸二酯键连接后，在腺苷酸处出现了一个套索，已被切下的外显子1的3-OH攻击内含子3末端与外显子2之间的3，5-磷酸二酯键，键断裂后，内含子

27、以套索的形式被节下来，此时外显子1和外显子2可以连接起来（图17-13）。D 编辑 图23.15 所示是哺乳动物的肠和肝脏中，载脂蛋白B(Apolipoprotein B)基因和mRNA的序列。基因组中含有一个单基因(割裂基因)，基因序列在所有的组织中都是相同的，编码区有4563个密码子。此基因转录成一个能代表肝脏中整个编码序列的mRNA，翻译的蛋白质大小为512kD，即全长载脂蛋白。在肠中合成的却是只包含有2153个密码子的m RNA，产生的蛋白质较短，为250kD 左右。这种蛋白质其实是全长载脂蛋白的N-末端。翻译此蛋白质的mRNA序列和肝脏中的这种mRNA 序列基本相同，只是在第2153

28、个密码子上的一个C 变成了U。这个碱基的替换使得编码谷氨酰胺的CAA 变成了终止密码UAA。是什么导致了这种替换？基因组中没有编码这种新序列的任何可变基因或外显子，其剪接机制也没有任何改变。我们只能认为在转录物的序列中直接发生了一种变化。 RNA 编辑的另外一个例子是在大鼠脑中谷氨酸受体中发现的。一个位置上的编辑使DNA中谷氨酰胺的密码子在RNA中变成了精氨酸的密码子，这种变化影响了通道的传导性，因此对控制通过神经递质的离子流有重要影响。在谷氨酸受体中另外一个位置上，一个精氨酸密码子变成了甘氨酸密码子。载脂蛋白B中的编辑使C2153变成了U；谷氨酸受体中两个位置上A变成了I(次黄苷)。这些事件

29、是脱氨基作用，即核苷酸环上的氨基酸基团被除掉了。这些事件分别是由胞苷和腺苷脱氨酶(Deaminase)催化的。如在锥虫cox的mRNA上158个位点插放了394核苷酸；在9个位点删去了18个尿苷酸，实际增加了376个核苷酸，使coxIII的长度增加了55%。因此cox的基因比成熟的mRNA小了很多，故称其隐匿基因。E 变异不论拼接过程如何，拼接必须极为精确，否则会导致遗传信息传递障碍，合成的蛋白质可能丧失其正常的功能。我国南方广大地区是-地中海贫血的高发区，这是由于-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制所引起的一种血红蛋白病。实验表明-珠蛋白基因元1中核苷酸的点突变改变了正常拼接部位的碱基顺序，结

30、果造成错误部位的拼接。加工成熟的 mRNA虽能翻译，但产物不是正常的-珠蛋白，结果引起血红蛋白级结构和功能的改变。2）tRNA加工原核生物和真核生物刚转录生成的tRNA前体一般无生物活性，需要进行剪切和拼接碱基修饰3-OH连接-ACC结构。成熟的tRNA分子中有许多的稀有碱基，因此tRNA在甲基转移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如AmA,GmA。有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。尿嘧啶核苷转变不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸（）3末端加上CCA：在核苷酸转移酶作用下，3-末端除去个别碱基后，换上tRNA分子统一的CCA-OH末端，完成tRNA分子中的氨基酸臂结构。 tRNA前体的

31、加工tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子。大肠杆菌RNase P可特异剪切tRNA前体的5旁顺序，因此，该酶被称为。除了RNaseP外，tRNA前体的剪切尚需要一个3-核酸内切酶，这可将tRNA前体3端的一段核苷酸序列切下来。此外RNaseD是tRNA3端成熟酶。近年来的研究表明大肠杆菌RNaseP是一种非常特殊的酶分子，它是由RNA和蛋白质组成，最近发现RNAaseP分子中的RNA部分在某些条件下，可以单独地催化tRNA前体的加工成熟，这个发现和四膜虫tRNA能自我拼接被认为是近十年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。说明RNA分子确具有酶的催化活性。经过剪切后的t

32、RNA分子还要在拼接酶作用下，将成熟tRNA分子所需的片段拼起来。 转录后加工：第一，切除tRNA前体两端多余系列。tRNA前体5端较成熟tRNA通常多几个到10个核苷酸，去除这些核苷酸是有高度专一的RNaseP（即tRNA 5端成熟酶）催化的。tRNA 3端的切除有两个酶催化，即tRNA3端成熟核酸内切酶核酸外切酶。第二是末端的添加，即在3添加CCA序列，此一步骤由tRNA核苷 转移酶（tRNA nu-cleotidyl transferase）催化。第三，修饰。tRNA修饰碱基很多，主要为甲基化修饰占被修饰碱基的一半以上。其它如碱基（U异化产生），Y碱基（tRNA特定位置上的G37转变而来

33、），I和Q主要系置换产生（前者是次黄嘌呤置换了前提tRNA上34位的腺嘌呤，后者是Q碱基置换了前提tRNA34位上的鸟嘌呤获得）。3）rRNA加工真核生物rRNA前体比原核生物大，哺乳动物的初级转录产物为45s，低等真核生物的rRNA前体为38s，真核生物5sRNA前体独立于其他三种rRNA的基因转录。真核生物rRNA前体的加工真核生物rRNA前体中含有插入顺序，rRNA前体要形成成熟的rRNA，需要经过拼接反应。例如，四膜虫的rRNA前体的拼接是一种无酶催化的自动拼接过程。四膜虫基因组内，26srRNA编码的区域内有413bp的插入顺序。该插放序列可以不消耗能量从rRNA前体中被除掉。用SD

34、S煮沸和用蛋白酶外理等破坏酶活性办法，都不能破坏拼接活性，但反应中Mg2+和鸟嘌呤核苷酸是必在的。用32P-GTP进行追踪实验表明，起始过程是GTP在插入顺序5端发生亲核反应，同时GMP与5端切点的切除段形成磷酸二酯键并使原RNA断开。第二步是5切点的外元3-OH与3切点的外元5-P共价连接，获得成熟的rRNA，被切除部分最后环化，形成一个环状结构，同时从5端去掉一个15核苷酸啐片。剩余部分连接成399核苷酸的环状产物，再经过几步，最后切下一个19个核苷酸的线性内含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由内含子本身的催化性质决定的 。从哺乳动物的中间产物的大小来看rRNA前体的加

35、工可能有多种途径，但并不是所有的途径都已搞清楚了。图13-9表明HeLa（人类）细胞和L（鼠）细胞中rRNA的加工途径：切除5端的前导序列，即外部的转录间隔序列（ETS），使45S的初始转录本变成41S的中间产物；从41S的中间产物中先切下18S的片段，但Hela细胞途径和L途径不同，前者的切点在18S和5.8S之间的内部转录间隔序列（ITS），产物分别为20S（含18S rRNA片段）和32S；而后者的切点在18S序列和ITS的交界处，这样18S rRNA就已经成熟，无需修整，故称为先成熟；部分退火：两种途径中的32S和36S中间产物（含5.8S和28S rRNA）中的5.8S和28S之间进

36、行退火，形成发夹结构；最后修正：在HeLa细胞途径通过外切酶等将20S中残余的ITS切除，还要将已退火的32S中的ITS切除掉；在L细胞途径中只需将已退火的32S中的ITS切除即可。我们现在尚不知道加工的细节；但已知道45S RNA立即和蛋白质结合，在核糖体上进行加工，而不是以游离的rRNA进行加工的。 4）核酶的发现众所周知，核酸DNA、RNA是遗传信息的载体，而作为功能分子的蛋白质能催化成千上万的化学反应，即起着酶的作用。蛋白质与DNA、RNA之间存在着千丝万缕的联系，这一点从中心法则中可窥其一斑（图1）。没有DNA和RNA，就无法进行蛋白质的生物合成，而没有酶（蛋白质），DNA和RNA无

37、法自我复制或相互转录。蛋白质是DNA和RNA调控的产物，而DNA、RNA的自我复制离不开蛋白质，那么蛋白质（酶）与核酸（DNA、RNA）在生命形成过程中究竟孰先孰后呢？RNA可作为催化剂这一功能的发现打破了生物体内生化反应仅由蛋白质酶催化的框子，为生命进化提供了新的理论。这种RNA的形成需要从其前体中准确地切去含有413个核苷酸的插入片段（IVS）并进行一系列切割、剪接（图2、3）。在研究中，Cech等惊讶地发现，该片段的切割、剪接并不需要酶至少不需要传统意义上的酶只需要适量三磷酸鸟苷（GTP），或者正如后来所发现的，只需要适量鸟嘌呤或其衍生物。核酸所进行的是一系列快速、温和的化学反应，从而导

38、致不需要蛋白质酶的辅助而完成自身的切割、剪接。在剪接过程中，鸟嘌呤（或其衍生物）进攻RNA中413个核苷酸插入序列的5端。这是一种酯交换反应，鸟嘌呤的羟基（OH）进攻第一个内含子核苷与第一个外显子核苷之间的磷酸二酯键的3端，使得鸟嘌呤基团与内含子的5端相连，而外显子的3端被游离出（图3）。“自由”了的外显子3端又自发地与413个核苷酸插入序列的最远端相接，完成了将外显子两端相剪接的过程。内含子被切除，外显子被剪接后，自由的内含子又自发地产生了一系列反应（图4）。首先该多聚核苷酸的3端几乎完全专一地进攻第15个核苷与第16个核苷之间的磷酸二酯键，形成环多聚核苷酸，从而导致从内含子的5端切去含15

39、个核苷酸的片段。如果该环多聚核苷酸被置于高pH值（如pH=9.0）环境下，则分子精确地在最新形成的化学键处开环。活泼的3端又一次进攻，切去含有4个核苷酸的短链，并再一次成环。同样，在碱性条件下开环，形成了含有395个核苷酸的多聚核苷酸长链。定义为Ribozyme，即RNA酶（或RNA催化剂）。然而，近年的研究发现，许多RNA却能催化其他分子而不是本身，从此，Ribozyme就完全符合酶的定义了。类内含子的结构特点类内含子的结构特点是：其边界序列为5 U G3（表示剪切位点）；具有中部核心结构（Central core strucature）。所有的类内含子中都具有2级结构，图13-24表示四膜

40、虫内含子中二级结构模型，共九个配对区（P1-P9）其中有2个配对区（P4和P7）是类内含子中共有的保守序列，P4由P和Q序列形成，长10nt，有6-7碱基是可以配对的。P7是由R和S序列构成的，长12nt，但只有5个碱基可配对。其他的配对区在不同的内含子中是不同的，突变分析表明，P3，P4，P6，P7是核心结构，也就是可以执行催化的最小区域。 具有内部引导序列（internal guide sequence IGS）。Davies（1982年）第一个提出了内部引导序列，它由六个nt组成，GGAGGG（四膜虫）。内含子中可与外显子配对的序列称为内部引导序列。最初人们认为IGS的作用是通过和两个外

41、显子近侧区域配对，使外显子并在一起，现在认为其作用是决定剪接的专一性。而且使切点的U处于易于受到攻击的暴露点。有的序列很短，在P7和P9之间配对，要在内含子3端G激活前立即配对。碱基的配对对于产生核心结构是很必要的，顺式作用位点的突变就会阻止类内含子的剪接。各种突变的线粒体内含子在体内都不能被切除，而四膜虫的内含子插入到细菌基因中，再转化到细菌中，它仍可以剪切。图13-25表示构建一个重组DNA，转化到在E.coli中表达。将自我剪接的内含子插到-半乳糖苷酶的第10个密码中，再转化-gal-E.coli，若此内含子不被剪接的话，-半乳糖苷酶基因受到破坏不能表达，菌株为白色，若能自我剪切，则-半

42、乳糖苷酶基因可以翻译成完整的酶，能使底物X-gal发酵变兰。用此方法可以检测内含子是否具有自我剪接的活性。(二) 类内含子的剪接机制核酶具有多种催化活性，对于类内含子来说这些活性是由于它可以产生特殊的二级和三级结构，形成活性位点，相当于传统酶的激活位点。图13-26就表示在这些位点上进行的剪接反应。内含子的二级三级结构形成了G苷酸结合位点和底物结合位点，后者依赖于内部引导序列的配对来确定。核心结构和内部引导序列又使这两个位点彼此靠近，便于相互作用。首先是GTP进入G结合位点，左边外显子的3端通过和引导序列的互补配对进入底物位点。GTP的3-OH作用左边外显子和内含子交界处的磷酸二酯键，本身结合

43、到内含子的5末端，被切下的5外显子仍保持在底物位点上，并未游离。第二步内含子的G414（即3交界序列上的G）又进入了G-结合位点，切下的外显子的3-OH又对G-结合位点上的G与3外显子之间的磷酸二酯键发动亲核进攻，切开磷酸二酯键，而其3-OH和3外显子的P重新形成磷酸二酯键而连接起来，这样就完成内含子的剪接。内含子成为线形的413nt的RNA分子。第三步，内含子5端和引导序列相邻的序列通过引导序列互补配对，进入底物位点。仍然留在G结合位点上的G414其3-OH再作用底物位点上的序列，切下19nt的内含子5端，并和余下内含子的5-P形成二酯键，形成414nt的环状内含子。类内含子的剪接型内含子在

44、植物和低等真核生物的细胞器基因组中发现。类内含子的剪接和I类内含子不同，而和核mRNA 内含子的剪切有些相似。但也有不同之处。(一)结构特点1列为5GUGCGYnAG，符合GT-AG法则。2二级结构的形成使两个并列的功能区靠近。功能区5和功能区6被2碱基隔离开。功能区6含有1个不配对A残基，其上带有2-OH首先进行转酯反应。3在内含子的近3端具有分支点顺序（branch-point seguence），也就是在第6功能区有6-12nt保守序列，在哺乳动物中为YNCURAY（Y：嘧啶，R：代表嘌呤，N表示任何核苷酸）。分支点顺序可和上游序列互补，形成茎环，但A不配对（图13-27）。(二)剪接机

45、制类内含子的剪接无需鸟苷的辅助，但需镁离子的存在。首先是分枝点A的2-OH对5端外显子和内含子交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻（图13-28）切下外显子1，内含子5的边界序列上的G与5磷酸和分枝点A的2-OH形成磷酸二酯键，从而产生了套索（lariat）结构；第二步是切下的外显子1，其3-OH继续对内含子3端的交界序列进行亲核进攻，切下的外显子2的5磷酸和外显子1的3-OH形成磷酸二酯键，连接在一起，同时释放出套索状的内含子。核mRNA的剪接和类内含子十分相似，但根本的不同点是核mRNA前体的剪接本身不能形成二级结构，必需依赖于snRNP（U1，U2，U4，U5，U6）的帮助才能形成剪接体，进行

46、自我剪接。它们自己本身不能象I类及类内含子那样依赖核心结构，形成茎环，将5和3剪切点拉在一起。和snRNA的结合是相当复杂的，但剪接反应的第一步5位点的剪接是由U6催化的，3位点是由5外显子1的3-OH对内含子3端切点进行转酯反应来完成。(一) 结构特点1. 边界顺序:其边界序列是完全符合GU-AG法则。2. 分枝点顺序：它和类内含子相似也具有分枝点顺序。位于内含子3端上游18-40nt处，序列为Py80NPy87Pu75APy95其中A为百分之百的保守，且具有2-OH。3. 内含子5端有一保守序列（5GUAAGUA3）可以和U1 snRNA的5端的保守顺序3CAUUUCAU5互补（图13-2

47、9）。(二)剪接机制图13-29已初步表明了核mRNA剪接的过程，实际上要比这复杂得多，首先要解决的是如何识别剪接位点，一般是通过两种途径：存在一种酶可以特异识别它们，并将两者的保守序列拉到一起；通过RNA的碱基配对产生二级结构，再由一种酶来识别。核mRNA的剪接可能要依赖于反式作用RNA（trans-acting RNA）。在高等生物中都含有很多的不连接的小分子RNA片段，在高等生物中其长度在100-300nt，在酵母中长度可达1000nt，其丰度很高。仅限制在核内的这些RNA称为小分子核内RNA（small nuclear RNAs, snRNA）。在细胞质内的称为小分子胞质内RNA(sm

48、all cytoplasmic RNAs,ScRNA)。在自然状态下，它们以核糖核蛋白（snRNP）的形式存在。在剪接装置中会有几种snRNPs和大量的附加蛋白，常称为剪接因子,这些snRNPs是U1，U2，U5和U4/U6。U1，U2和U5 snRNA每种都含有单个的snRNA和几种蛋白，而U4/U6含有U4和U6 snRNAs及几种蛋白。U1 snRNA自我配对形成了多个茎环结构，从而构成了不同的功能区（图13-30）。Sm结合位点是和其他snRNP相互作用的区域。其5末端有一保守序列：3CAUUCAU 5，这一序列可与核mRNA内含子5端的边界序列互补结合，这对于剪接反应是很重要的。以腺

49、病毒12S RNA的5端边界顺序为例，如果此序列发生突变，从GUGAGG突变成为GUGAAU，虽然仅二个碱基发生突变，配对的碱基数仍然未变，仅减少了一个氢键，结果不能剪接。若在此基础上U1 RNA的5端序列也发生相应的突变，使得突变的碱基也能配对，结果又恢复了剪接的能力（图13-31）。由此可见U1 RNA 5端保守序列和内含子5剪接位点的配对对于剪接反应来说是十分重要的。其作用可能是通过配对使URNP可以和核mRNA3剪接位点牢固地结合，再通过U1和其他snRNP的相互作用使5剪接接点与3剪接位彼此靠近，弥补了核mRNA本身不能通过形成特殊的二级结构将两个剪接位点拉近的问题。使剪接能顺利进行

50、。图13-32表示snRNAp的剪接功能和反应步骤。第一步是U1通过和5剪接位点的配对和5位点结合。但U1也可和分枝点结合，因带有突变的分枝位点的pri-mRNA其5位点是不能和U1snRNA结合的，现在还不知道U1如何识别分枝位点的，可能和snRNP的某些组分有关，或者存在某些辅助因子。U1的存在对于第二步也是必要的。在第二步中U2 snRNA结合在分枝位点上。U2 snRNA通过和分枝位点的碱基配对来识别它。在酵母中分枝位点顺序为5UACNACA 3，由于分枝位点紧靠3剪接位点，U1 snRNA（结合在5位点）和U2snRNA（结合在分枝位点）之间的反应使两个剪接点彼此靠近。含有U5和V4

51、/U6 snRNA的3聚体结合，水解ATP，现在剪接装置的所有成分都全部到位，在剪接反应前，它们都装配起来。U1和U2是剪接起始阶段是所需要的，它们的失活会阻碍5位点的剪切和套索的形成。虽5位点和U1snRNA的碱基配对是负责剪接位点的识别，但并不控制剪切。U1在反应开始前解离。在此点上的U5 snRNA会改变自己的位置，开始它靠近外显子，后来移到附近的内含子上。催化反应是通过U4的释放来启动。此也需ATP的水解，U4snRNA的作用可能是抓住U6snRNA，直到U6参加反应。以上几种内含子的剪接机制是不同的，现总结如表11-2所示：表11-2 几种不同内含子剪接反应的区别酵母tRNAI类内含

52、子类内含子核mRNA前体边界顺序无5U-G35GU-AG35GU-AG3特殊顺序C（茎上）G(环上)内部引导序列分支点顺序分支点顺序,5外显子顺序二级结构茎环构象核心结构5、6功能区连接体基因外的成分内切酶，连接酶GTP，镁离子镁离子U1U2,U4,U5,U6能量要求ATP不不ATP中间型分子半分子tRNA环状L-19 IVS套索套索Ribozyme的类型与特点 自从第一个Ribozyme被发现并命名后，至今已发现了几十种Ribozyme。现已发现的Ribozyme按其作用方式可分为切割型和剪接型。切割型的Ribozyme是只切不接，而剪接型的却既剪又接。无论是切割还是剪接，所有的切割-连接反

53、应都是转酯基作用，即酯交换过程。根据作用的底物分类，Ribozyme可分为自体催化和异体催化两类。绝大多数Ribozyme以自身为底物，进行自体催化，即自我切割或自我剪接。而异体催化则是以其他分子为底物，可以是不同的RNA，也可以是其他分子。各类Ribozyme通常以RNA为底物，但也有例外。与蛋白质酶相比，Ribozyme的催化效率较低。如四膜虫rRNA插入序列具有核糖核酸酶的作用，水解RNA的速率为30秒钟一次，而胰RNA酶作用速率则为每秒钟数千次。另外，RNaseP中RNA单独作用时，催化效率很低，而结合蛋白质后，其催化效率大为提高，这也许与蛋白质上含有多种活泼基团有关。核酶作用方式较简

54、单，归纳起来主要有以下几种类型：剪切型，这类核酸能催化自身RNA或异体RNA分子剪掉一段核苷酸片段，其催化功能相当于内切核酸酶的作用。剪接型，这类核酶催化自身RNA进行化学反应，首先切去自身RNA内一个核苷酸片段，再将剩余的两个片断连接起来；相当于内切核酸酶及连接酶的联合作用。其他类型，如核苷酸转移，脱磷酸作用。锤头状结构的RNA分子有13个保守的核苷酸序列，如果它们中的碱基改变会使这种催化活性失去作用。根据这种特片，科学家们在体外没计并人工合成这种RNA分子，用于抗肿瘤及抗病毒的实验中。1. 核酶的锤头结构:科学家Symons自多种植物病毒卫星RNA及类病毒RNA的自我剪接研究中，观察到自我

55、切割区内有锤头结构（hammer-head structure），其中的结构特点是：（1）三个茎区形成局部的双链结构；其中含13个保守的核苷酸，N代表任何核苷酸。（2）图中的箭头表示自我切割位点，位于GUX的X外侧，X可表示为C、U或A，不能是G2. 核酶的作用（1）核苷酸转移作用。（2）水解反应，即磷酸二酯酶作用。（3）磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。（4）脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。（5）RNA内切反应，即RNA限制性内切酶作用。从大多数Ribozymw的结构中发现一些特征，例如：锤头状结构的RNA分子有13个保守的核苷酸序列，如果它们中的碱基改变会使这种催化活性失去作用。根据这种特点

56、，科学家们在体外设计并人工合成这种RNA分子，一个19ntRNA和一个24ntRNA，形成锤头RNA。其中19ntRNA是酶，而24ntRNA是底物。合成的核酶在特定的部位切割靶RNA，以阻止病原物的RNA病毒的基因或基因组的表达，达到治疗RNA病毒病的目的，用于抗肿瘤及抗病毒的实验中。1. RNA为生物催化剂，具有重要生物学意义。2.打破了酶是蛋白质的传统观念。3.在生命起源问题上，为先有核酸提供了依据。4.为治疗破坏有害基因，肿瘤等疾病提供手段。 有关RNA酶的资料：RNA作为催化剂的化学本质磷元素在生命化学过程中起着重要作用，磷酯基团充分胜任DNA、RNA的桥连基团的角色。这是因为磷酯基

57、团既能连接两个核苷基团，又能保证自身的离子化。其离子化不仅可使核酸分子能存在于磷脂生物膜中，而且能防止被水解，确保核酸分子的稳定。磷酯基团的这些特殊功能是其他基团所无法替代的。不仅如此，由于磷酯基团的存在，能导致一系列不需要酶作用而发生的生化反应，这是其他基团所无法替代的，而Ribozyme的催化机理正是其中一种在磷酯基团作用下发生的自发反应。磷酯基团的特殊功能与磷原子的原子结构密切相关。磷位于元素周期表近中心位置，外层有3个未成对的p电子和5个3d空轨道。其3s、3p及3d轨道的能量较为接近，易形成sp3、sp3d、sp3d2等多种杂化轨道，具有形成4、5、6等根化学键的能力。核酸磷酯基团中的磷为五配位结构，由于磷原子具有较多可利用的空电子轨道，配位数较多以及各化合价态间在一定条件