生物学利用MEGA5.0和Clustalx软件构建进化树

1、生物学利用 MEGA5.0禾口 Clustalxl .83软件构建进化树MEGA是一个关于序列分析以及比较统计的工具包，从3.1版本到后来的4.0版本一直都广为大家熟悉，现在推出了 Mega5.0版本。功能比以前多有改进。现主要介绍使用Mega5.0构建系统进化树的方法。供大家参考。用MEGA构建进化树有以下步骤：1、测序:将克隆扩增测序得到的 16S rDNA序列进行测序。2、NCBI 上做 Blasthttp:/www. ncbi. nlm.n /blast/Blast.cgi找到相似度最高的几个序列，确定一下你分离的细菌大约属于哪个科哪个属，如果相似度达到百分之百那基本可以确

2、定你分离得到的就是Blast到的那个，然后寻找相似性最高的细菌，通常把该属的序列（Fasta格式文件）下载下来，或点击Gen Ba nk登录号，复制FSATA 格式，整合在一个*.txt文档中（单独建立一个文件夹存放，后面的很多文件会自动装入该 文件夹），如>xxxxAGGCTTAACACA TGCAAGTCGAGCGGAGCGAGGGTGCTTGCACCTTAGCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA TGCTTAGGAA TCTGCCTA TTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGA ATGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGA T

3、CTTCGGACCTTGCGCTAA TAGATGAGCCTAAGTCGGA TTAGCTAGTTGGTGGG>gi|289469964|gb|GU388381.1| Acinetobacter tandoii strain DSM 14970 16S ribosomal RNA gene, partial seque neeACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGGATGCTAATACCGCA TACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCTTCGG ACCTTGCGCTAATAG

4、ATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTAC CAAGGCGACGA TCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGA 参考序列选择注意事项：1、不选非培养（unclutured）微生物为参比；2、 不选未定分类地位的微生物，最相近的仅作参考；c,在保证同属的前提下，优先选择16S rDNA全长测序或全基因组测序的种；d，每个种属选择一个参考序列，如果自己的序列中同一属的较多，可适当选择两个参考序列。3、使用clustalx1.83进行序列比对打开压缩文件 clustalx1.83，运行其中的 clustalx.exe文件，如图：扫自辭压格式毎压到

5、测试 査看点击大小压缩后犬水类型修改时人孑 dliyhaiff. h£.699l.oec文诗k2003-1 colpr ot. p-ar1,429S61艾件fT2003-1閔 ffQlprillt p«r36$1.5：丈件220C3-1eoldna. parE30文拌par2003-1£ clii&talx. hlml口 13421,200 3&D=elBL2003-1M flustAljc. hip64,3132O.7T2帮明文件2003-1Jcliistalx的岂36203, HI应用程序2003-4File/load seque nces,将

6、整理好的*.txt序列文件导入clustalx1.83，如图E 唇tluslLilKl. 03. Tip - ZIF JE缩丈唯 解赳大水为1, 7S1. 3S2手节M ClustalX (t. 83)-n.xMultiple Alignment Mode * Fonl Size; 1 0 _*271342056 00422&10 1&1579972 348161412 1&4652764 2S592705S 册1弓11驻 3211E9371 2&5927064b bbbh-h-bbb9d- mg-gggg-g rCGCCCTTTAATrTAAAAGACTTGG

7、TGCGCAACTiCCATGCAiGTCGGACGGTAGCACAGA GAGTTTGATC iTGGCTCASATTGI WtQCTGGfGGCAGGCC T 融 11CATGC 酣GTCG 审匚 mTq；.ACQCT2qGGfcGCCT.AAr A 2 ATQC A AGTC qiCQGT AQC ACAGiaGCTTQCT TTCTCGGGrTGACi3AGrGQCCGACGGGTGAGriATi3TCTi3CGC*TCTGCOCGAT*GAGGGG CTAGAAGAGTTTGATCATGQCTCiGArTGAA 匚 GUTEGCGGCAGGQC 丁盒直匚 ACTGC 扎GT WCSj

8、GGGTGAGTMT右 TCTGGGgATCTGCCCgAT 占 G1GGGG诽 TMCSCTGGA 血亡 GGT ATTGliC'XTG 3CGGCiGGCCTA ACAC AT' A A 電ZQ ；TAACA ；iACiGCTTGC TGQCGGGAGQCTiACACATi；CAACTCGACCGTAi；CACiCA4a*QCTTQCTCTTQQGGTQ ；占 TT'SAACGCTGGCGGCAGGCCr 占 AC 直 ETGCAAGTCGUACGGT盘 GC盒CAGG Tc匚占G 乂匚T型ACACATGCAALTCGAACg TAACAGGiAGCAGCrTuCr

9、 r. -t Ti-T'r-Tr-i-. -r-1 T'i-Ti-rri- t i r f, rr ._ r-r-人 t 人 l广 £ lt t- sl 入 i rr. ATTG14CGCTGQCGGC1GCTGGCTATTGiAi接着点击 Alignment/Do Complete Aligment CtlHtAlX 1JJmtE'J*口|*巳 fc弧+ 2*Y tH-MuMiplFtciduc# 3de Trw O4y g AAgrww* from Gode TreeMeet 就 SeouerKM r 申*1.Rei4j« Un#程序自动运行，得

10、出结果，自动输出*.aln和* .dnd为后缀的两个文件，并自动存入你*.txt文件所在的文件夹内。序列比对也可以直接用 MEGA来做。4、运行程序 MEGA 5.0，如下图所示:First braUsBi?TutorsEKamptesCitai ionIEGA icImm h5i 10426MEGA Web冋IReport a BugUpdates?Custofflize TedCai ” Pt首血ncei 点击：File 导入 Clustal 程序得到的 *.aln 文件。再点 File/Convert to MEGA Format，打 开转换文件对话框，从目的文件夹中选中Clustal对

11、比分析后所产生的*.aIn文件，转换为*.meg文件。转换时一路确认相关界面。最后查看meg序列文件最后是否正常，命名新文件 存盘保存*.meg文件，*.meg文件会和aln文件保存在上述*.txt同一个文件夹中。5、关闭转换窗口，回到主窗口，现在点面板上的"Click me to activate a data file打开刚才 ”的*.meg文件。 HEFiii line U冊存luiorial EwnplcgME&APieeierces 囚口 盃 2Q1H 214 mw如果为核酸序列，选择 Nucleotide sequenee”，点击"OK,得到以下图示。/

12、OpiiansRun StatusEbail timefileSt-alusFrsL tiri'ie User?TTutorial2CH112U.oZC1-2Z 20111214 nw. iMEGA idrae H&l 10426选择默认的Standard,点击OK后，如图所示。TA <点击程序中的，可以得到下图05C T G G&4GATTG*ACG - I 料 |t I V A A »C Q -I - - 1 A . IT T a A A £ aT 1 A A T T T A A A A05可对所选择的在另外一个窗口内，出现以下数据文件点击

13、选择和编辑数据分类图标,序列进行编辑，完成后点击close即可。0505昶让 11414-9 II vMl1 l«ii| i1|Bi. Id#i IHLTtlil i m « tIl审.' I r ft H H < E W r I. 9 t扌 *r»*il s Ad-N T IVlftiPI hsi rQtai|ii!p4Vllfe i |rrftflijj.4i!liMUMr r 1 « I L >«-> kKTinrt i P f点击*cl T!小1 fl审爲| - 1 * |>i1 A 1* gA细.1 -

14、A |Y Hpf PC > 1 « W< *»"芽-工V # I4 E帀Tir wa 44 w flVt ¥T «tE i k * I- *II t 1 411i 4 »h44 W Vi H¥ 4I4 i A 4vM9 t ta 0 Ii. a： r w ii * h h M T i i n N i. h | 4 V | u i V N h b * f I M L * « *PEa itit.W厅屯-W -LT* 少-uuiuKi叹击，可进齐的序列* #«VT|d #* 厅KR4审 *j序列名

15、LI+JJ称编辑05ok即可。序列编辑完成后，可进行保存，点击保存后出现以下界面，点击1 A. U W 4 Ua ft ta枣*w t 4 vi Ci * |i * 叶.【*p i0 *w 1 t .9t*lV M-rf1 A 41 * |finD « «-.Qo 1卩If t ID B=tAp1 ft n 1Il 5F |r r I fc *infSvivupru'* Vfl* rE i 9 V< C 1F *|Q|4P 常P V i甲l£ fvIN 4» & W1 « R W 4 Vc i豊ft*rf0T i F $

16、PMI 1H>1巾v tV09* | T| 1打#fP f *a RV V i T « I-o * wf >Jk V- TA 1 * d* t '1 iF 1： f-L1w"rilflIA -if* a4y * i 'J fr v*H M L* p1 FQifl fr 9ir VTA p T一 P>tf M V f |2WhkIs Codkp 11 A 11Uv w o vP A9in：iP口戸1* A- 1 看 TA A f »Ki9 t具0 if f期中A1 T#1t f1 鼻 1 譬用A C p *f 0 1f p*1 if

17、ti 1¥44* Ta < l F-'ft 1<Q*Q>QM*IV4台爲 N 如皿“ 2耳叮jC A r rI ft 4 V U阳F fT .if''XTtLa4 w th tA AL Iysmu 0 *1 M- 4 W > M4MHW1 H £r tb * Q ft事 p «W lb >K* # fl ¥ t 十a* i *中v« *#A Ml鼻”心*馨G Mw *1* r? tt* *e 輩1 4k ©13Q i aqFtMMinjrPg fW * V V d |ecuv &#

18、165; : " D 7 T TT "W p A-J A Jr rV寸i1« 4 W ft Wten* f.f4 fta *v # i #v h « «* 4 I w wIft p * *l 6» l TFrn ft：Q' II »4 W C14lb轉* k fL ID*l* » *审V “ AA-A和吋点I P1 « ' « t门J律！？卫6* f-i构建进化树的算法两类主要方法简要说明：独立元素法(discrete character methods)是指进化树的拓扑形状是由

19、序列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的(例如：一个序列上可能包含很多的酶切位点，而每个酶切位点的 存在与否是由几个碱基的状态决定的，也就是说一个序列碱基的状态决定着它的酶切位点状态，当多个序列进行进化树分析时，进化树的拓扑形状也就由这些碱基的状态决定了)距离依靠法(distanee methods)是指进化树的拓扑形状由两两序列的进化距离决定的。进化树枝条的长度代表着进化距离。独立元素法包括最大简约性法(Maximum Parsim onymethods)和最大可能性法(Maximum Likelihood methods)；距离依靠法包括除权配对法(UPGMAM )和邻位相连法(Neighbo

20、r-joining )。(1) phyloge ny 宀 UPGMAmm-(2)用Bootstrap构建进化树，MEGA的主要功能就是做 Bootstrap验证的进化树分析， Bootstrap验证是对进化树进行统计验证的一种方法，可以作为进化树可靠性的一个度量。 各种算法虽然不同，但是操作方法基本一致。进化树的构建是一个统计学问题。我们所构建出来的进化树只是对真实的进化关系的评估或者模拟。如果我们采用了一个适当的方法，那么所构建的进化树就会接近真实的进化树”。模拟的进化树需要一种数学方法来对其进行评估。不同的算法有不同的适用目标。一般来说，最大简约性法适用于符合以下条件的多序列：i所要比较的

21、序列的碱基差别小，ii对于序列上的每一个碱基有近似相等的变异率，iii没有过多的颠换/转换的倾向，iv所检验的序列的碱基数目较多(大于几千个碱基)；用最大可能性法分析序列则不需以上的诸多条件，但是此种方法计算极其耗时。如果分析的序列较多，有可能要花上几天的时间才能计算完毕。具体构建过程如下Phylogeny 参数的设置：点击，选择该菜单中的 Construct/test Neighbor-Joining tree,选择前面转换得到的*meg文件，得到下图点击OK对下图的参数进行设置:说明:系统进化树的测试方法Test of Phylogeny，通常要选择 Bootstrap method，也可

22、以选择不进行测试；重复次数No. of bootstrap Replications通常设定至少要大于100比较好，随机数种子可以自己随意设定，不会影响计算结果。一般选择500或1000。Model/Method通常选择 Kimura 2-paramete r。设定完成，点compute,开始计算得到进化树构建的结果。如下图所示;Original free SDOfistrap consensus iret59Z7gi|27O342DS6|gb|G 051699 1| gi32221C03|gbkJN 175332 1| gi|l646S27S4|9b|EU2l673£.1|ZC1

23、22gi|1894'92194|gb|Ell727121 1|S gir3i8161412|gb|JN6i|4500 1| gi|151fi79972|9h|EF69J403.1gipCad22B1O|dbjlAS5?1245 1|Igill 9682357 |gb|EU9W42 1|S31 gi|1577603H|gb|EF668C11 1|I gi33O717793|ghklF792OaS.-|gi 339267731 gh|JF5aGg39.115E pgi|3J35288S0|gb|JF295Q53 1|1 gi|343526895|gbUF296055 1| gi |i 94

24、022222|gh lAFl 30959.2|I9i|3422210l3|gb|JN175342 l|bTL g,|3432O5&2J|reqNF? 0J39B0 1|gi|I21159371 |gb|HQ7O6113 1|gir329131195|gb|JF-19d01S .l|SB该窗口中有两个属性页，一个是原始树Original tree，个是 bootstrap验证过的一致树Bootstrap concensus tree。树枝上的数字表示bootstrap验证中该树枝可信度的百分比。得到构建的进化树后可以对该进化树进行优化。(本文参考网友的文章，同Mega的其它版本使用基本相

25、同，在此表示感谢。以下进化树的优化部分直接引用)(1)利用该软件可得到不同树型，如下图所示：B> soraiditC. c Lin ed（2radi3tion（3）circJe（2radi3tion（3）circJe（2radi3tion（3）circJe（2radi3tion（3）circJe除此之外，还可以有多种树型，根据需要来选择。（2radi3tion（3）circJe（2radi3tion（3）circJe2）显示建树的相关信息：点击图标（2radi3tion（3）circJe（2radi3tion（3）circJe3）点击优化图标，可进行各项优化：rectangular tr

26、ee/circle tree/radiation tree。每种树Tree栏中，可以进行树型选择:都可以进行长度，宽度或角度等的设定迂 Options冈Branch：可对树枝上的信息进行修改。3C百j-CWWjT'jB t-M-点主点壬R SMnrr PTi ik.-4 -JSwwrPgBJJ-a3mrftvAl-2SittVCEhftAl-S . IwrePccJiV-lF"l 3mrncA-l肌 *jL2> 1 KfliVS-EFiBiU SCMill-J 3«4«3113 54toV«-FOIjdh.4>l kkVdEtci.4

27、-"!Swrtt Ji就斗-1 BwtflrVtM-" i 3iHVWEDlbA4-Z 3w»rAwA9-> *4v<e Aveldil-A 3*v«rlvwl2-l3v»rWal2-JSrrvKMvvAJ-l!ItVfg *負）- JSwvHugawwrFIWl-J选中Branch,可对已 恂建吊树枝上显录的 信息进行欣*盍击 Hide values lower iham轩入救据"可设 直支持車？歸以上的 数值才显示！点壬placemen!下拉框 可选择皺据信枚覧在 帕枝申的世肯.Lable:可对树枝的名字进行修改。Sw

28、virFtiH-iSwverr tetl-3-_- Saver Pt e 12-2选中Lab d总可对已构 建的樹橈的名称进行 修饰.点击Shape下拉框，可 选中殛械！Cdor下拉框可 选中颜色°SMiF«4Jll-4 SbVePIcII-S SwvwPTe-t-1 3«wePc*15-1 awtrftrii-i 3«vr<KeA£-i SwwrPtsl.1 ScMlilS SeaclLl'JiB71 T 3«v*rl¥«A4-3». 3&-vezAwJL1->-l9

29、1;wrivrK3-3 jwvirclveJi9-l'L JlVCJL±-JSavIv# 11- -swtriwl'l hi/VEi AAj-2 SWceIiwAj!-!O3.>d&AaTi Lln T 弔说至耳启"已世干1匪口 朗用国它祢*晾£，R 可 4相厂冲的£Z 疔不冏用喊性辭， &工卸从ftM|r申iX 坪rum-即可选屮另生在怀二的 g聃.逢玄灯直色® tb債櫛!t川二旧薔称0.击即可.堆设.吉曰3 巧壬3：Scale :标尺设置Cutoff : cut off for consensus tr

30、ee。一般为 50%。9、进化树的分类优化Place root on branch ：可以来回转换。B昌电观专唾煙臺確0 谆“I tr*B B ootstrdp ctnseniut tieeGXHP-2 E-GXGP EGXH不2 EGXHZI E尹 GXHB2 EGXBH-J EGXBHJ E- GXHXEGXWZ-2 EGXHPgGXXY EJ GXWM詁 nwv7怎 hRH | BeWth ttnWnftjs hn |9EEGWXE2 AME1CAM-TYPE PRRSVILV LsljFslQd19idGXNNGXWH2E3S-GfXCZIgxgl-GMSHFlip subtree :

31、 180度翻转分枝，名字翻转180度。Swab subtree：交换分枝，名字不翻转。Compress/expa nd subtree与Set diverge nt time :可以把同一分枝的基因压缩或扩展。点击 Compress/expand subtree后，在要压缩的分枝处点击，出现以下界面，在OK。name/caption中输入文件名（例如 wwww），其他还有很多的选项，设置好了，点击1Q130.05pGaz-i1»1G)CLZ2所得到的结果，可以在压缩和扩展之间转换。gpT litfl 0cc4siia<p can sens ue lice10l GXBH19GX

32、FSE2GXWM-2 Eme鸟 Dignalh-eB | BcoisGXNNQW2 门:附P2EG池2EGXB0-2EOXBH-TEGXWZ-2EGXJ-FGKCY EGWVMI Ji10.调整进化树根据所的进化树的效果，要进行调整，包括多余序列删除、不足序列添加、种属名称标注等等，还要根据投稿杂志要求在PHOTOSHOP中修改等。完成后的进化树应包含充足的信息。参考网友的进化树完成图如下：aiMsiice tranipin gciicaiwnile oxidise geneMininml i nhihim<y gfiecinraEboih MICHITS4 H20 mM. irs0/4

33、CR3(2)勺TS33 IS mM, araB/ACRJ(2)|i IS 12 20mUZACRJU)DeJ/ijj tsuru加胆刖祖 ATCC BAA-554 (ABO75CH7)ITS30 9» jtlM. ansB/ACR3(2)TS4D (5 mM rTS37 (21 *rsB-4- TS3 K (2« eMe araB 常J SY5 l?mM, aF5 " Cc.manwnujs 嘟血Itrufi别rain ViTtB IW5 (AM IS42S4) nwanwnas denitn/iesns strain I tO (AF2J3IS76 -TS24

34、U niMwrs曲 TS32(7 inM. ACRJ(2)T$35 口 niM. ACBM2)I (KI0.G2I 恤TS7 (10 mMb 4CJ?(2)j * Acrjcvunr.T jwnirc hrulli AAOOCi-】1啊1'_00?!"?5即100 SY8(13 mM, fciKMCJU. AchfiinHxlMurcrxyw.xjdang strain A19 |AF43931i4j 柿HcTrnr/TJjmDnns arwnjiraiydans (IC_00* II3B盟 ITS3 H mMe btsBl 血nthMofw吧rim忖踽-ICI6I (AK1

35、%254)IW)| TS4 116 mMlI Th刖吐宓幼;iriwM $叶诂 LGSJAJ-S 156A0) 91 IS23 (21 mM, ACXJ(J)iJ' SfimtrtmpdhMkNias 印.IC193 < AB 1962561 -| SY 2& rmM. ACR31JCJ(2)2 rTS15E2l tttM, SJicjwrnjpfioinorjj.? ip. Toyama-1 1A E51 *066；)100 TS2S 12 mH, ACJ?.1(JV4Cfl3(2» S¥2 (16 mM, 4rRJ(i XACR3t2)jTS2*

36、E16 mM, 4CKJ(i MCKJ(2) TSJ6 39 rtiM. AC站灯御Awvrm?Ei、RydE时山 ATCX 79Mi (NC_OUKS70 Ewrwmhw Mi K12 (NC_0W)I 刃Kk TS34(? ioM, arH)I- Ktehalh jWvjhi MGH 7SJ1S iJC CldUA) IVOiTS29 12 mM, raa/ACR3(2) L SHwsjk曲 sp. ANA-3 (NC 0CMIJ77)TS9 (6 mM, 4CRJ(2J TS44(23 mM r aoiH/rtC!f J (I yA CR312) SV6 3 mhl, usflTS5 9 mM* SY7灯eM.聪珈"：恥他 /SfudorthMUs 紳ri曲 KT?4d" (N<'bwfo咖rnft flwrwvfflj Ff-S (NC_tift4l2*FSY4 (5 mM, ara&：4Cfi3(2)f WrTSStfnMnj4yp- TS42 32 mM】制