手性胺酰胺型液相色谱手性固定相的制备及几种氨基酸衍生物的拆分

1、手性胺酰胺型液相色谱手性固定相的制备及几种氨基酸衍生物的拆分第35卷2007年6月分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry第6期845849手性胺酰胺型液相色谱手性固定相的制备及几种氨基酸衍生物的拆分谭徐林侯士聪王敏(中国农业大学理学院应化系,北京100094)摘要用(月)一l一苯基2一对甲基苯基乙基胺(PrE)与一异亮氨酸制得含两个手性中心的手性选择剂,以琥珀酸酐作为连接臂,将手性选择剂键合到氨基丙基硅胶上制得手性固定相.以正己烷一异丙醇为流动相,利用该固定相对氨基酸衍生物进行高效液相色谱手性拆分,并考察了流动相中异丙醇

2、含量对手性拆分的影响.结果表明,该手性固定相对所分析的氨基酸衍生物大部分都具有一定的拆分能力.当异丙醇含量为l%时,亮氨酸与苯丙氨酸的苯甲酰甲酯衍生物获得基线分离.当异丙醇含量为20%时,亮氨酸,缬氨酸,丙氨酸,谷氨酸的3,5一二硝基苯甲酰甲酯衍生物获得基线分离.关键词手性固定相,高效液相色谱,氨基酸衍生物,手性拆分1引言简单,快速地分析和制备手性化合物一直是药物学家和有机化学家追求的目标.手性固定相(CSPs)高效液相色谱法(HPLC)因其简单,快速和准确的优点,已成为分析和分离对映体的最重要的方法¨."刷型"手性固定相(brushtypeCSP)是HPLC手性

3、固定相中非常重要的一类,这类CSP一般通过一定的间隔臂,连接一个单分子层的手性有机分子到硅胶载体上而制得,因而被称之为"刷型"CSP.Pirkle等最早开展这类手性固定相的研究,主要是将氨基酸的3,5一二硝基苯甲酸衍生物键合到硅胶上.徐修容等也将氨基酸的酰胺衍生物键合到硅胶上制得手性固定相并对氨基酸衍生物进行拆分.具有不对称中心的手性固定相的研制,是手性色谱发展的前沿领域.最近的研究动向是对已有固定相进行结构的修饰和寻找新的廉价手性源.目前,未衍生的氨基酸的手性检测用配体交换柱ll.或者配体交换毛细管电泳¨已满足,也可用冠醚手性柱¨来进行手性拆分,但氨基

4、酸衍生物的手性检测还有许多难点.本研究利用易得的手性原料(尺)一1一苯基2一对甲基苯基乙基胺与异亮氨酸缩合制得含两个手性中心的手性选择剂,通过键合将其连接到氨丙基硅胶上,制得未见报道的"刷型"手性固定相,用于拆分氨基酸衍生物获得了较好结果.2实验部分2.1仪器与试剂BrukerDPX300核磁共振仪(芬兰Bruker公司);ElementarVarioEL元素分析仪(德国AnalysengeriteGmbH公司);CGY一100液相色谱装柱机(北京福思源);1100系列高效液相色谱仪,包括G1311A型四元泵,G1314A型可变波长紫外检测器(VWD)和化学工作站(美国安捷

5、伦公司).球形硅胶(青岛美高化工厂),粒径l0m,平均孔径10nm,比表面390m/g;()一N一叔丁氧羰基异亮氨酸(上海吉尔生化股份),(尺)一1一苯基2一对甲基苯基乙基胺(江苏扬农化工股份);2一乙氧基一1一乙氧碳酰基一1,2一二氢喹啉(EEDQ),氨丙基三乙氧基硅烷(Acros,美国);二环己基碳二酰亚胺(DCC),亮氨酸,正缬氨酸,丙氨酸,苯丙氨酸,蛋氨酸,丝氨酸,谷氨酸,精氨酸(北京化学试剂公司);其它试剂均购自北京化学试剂公司并经重蒸后使用.20061012收稿;200612-28接受Email: 分析化学第35卷2.2实验方法2.2.1氨丙基硅胶(AP

6、S)的制备3.0g经酸活化的硅胶在100和P20存在下真空干燥10h.加入20mL干燥甲苯,装上分水器,在120下回流分水3h.加入6.0mL氨丙基三乙氧基硅烷,回流9h,用G4砂芯漏斗过滤,依次用无水甲醇,甲苯和无水甲醇洗涤,抽干,在60下真空干燥10h.元素分析结果:C.3.42%;N.0.92%;H.1.22%.2.2.2手性固定相的制备合成路线如图1所示.将2.31g(L).N.叔丁氧羰基异亮氨酸放人100mL的三口烧瓶中,加30mL四氢呋喃搅拌溶解,冰盐浴至0C;然后滴加2.11g(R).PTE的15mL四氢呋喃溶液,再滴加2.10gDCC的15mL四氢呋喃溶液,保持在0C反应2h,

7、然后自然升温到室温继续反应15h.过滤除去不溶的副产物,滤液旋蒸脱溶除去四氢呋喃得产物2(白色).加入80mL二氯甲烷溶HR/NyCOOH:(1)(R)PTE,0/,而l.c.'.入HB.c,NH/4)TFA,DCM0OHN,H.OOv/(CH:)NHllH图1手性固定相的合成路线Fig.1Reactionschemeforthepreparationofchiralstationaryphase解,经5%的HC1溶液,饱和NaHCO溶液,饱和NaC1溶液洗涤后,用无水NaSO干燥.将干燥好的溶液滤人100mL的三口烧瓶中,冰盐浴至0C,滴加5mL三氟乙酸,搅拌反应30min旋蒸脱溶得

8、产物3(白色固体).将固体溶于40mL无水吡啶中,冰盐浴至0C,滴加1.1g琥珀酸酐的15mL吡啶溶液,然后室温搅拌反应24h.旋蒸脱溶除去吡啶得白色固体,用乙酸乙酯/石油醚(2-1,V/V)重结晶得产物4(白色固体).将2.15g产物4溶于30mL无水四氢呋喃中,冰盐浴至0C,加入3.0g氨丙基硅胶(APS),加入2.0g(EEDQ),反应24h.滤掉溶液,固体用四氢呋喃,无水甲醇,乙醚洗涤,60C真空干燥6h得手性固定相.2.3色谱条件色谱柱为不锈钢柱(4.6mm×250mm,i.d.).3.0g固定相分散于30mL四氯化碳中,超声波处理12min,采用高压匀浆法装柱,装柱压力为

9、37.5MPa,顶替液为正己烷/异丙醇(90:10,V/V).色谱分离均在室温下进行,流动相经过滤,超声脱气后使用,流速为1.0mL/min.氨基酸衍生物参照文献13制备,用正己烷/异丙醇(90:10,V/V)溶解后进样,检测波长均为254nm.色谱柱死时间用1,3,5.三叔丁基苯测定,为2.69min.3结果与讨论3.1手性固定相的表征各中间体产物都经核磁共振氢谱确证其结构.产物2:H-NMR(CDC1,300MHz),7.317.22,(m,5H),7.026.93,(m,4H),6.34(d,1H,J=7.11),5.24(d,1H,J=6.72),4.92(s,1H),3.883.83

10、(m,1H),3.073.01(m,2H),2.28(S,3H),1.851.83(m,1H),1.43(S,9H),1.25(S,1H),0.95(S,1H),0.800.78(m,6H);产物3:H-NMR(CDC13,300MHz),7.67(d,1H,J=8.46),7.607.20(m,5H),7.046.90(m,4H),5.265.19(m,1H),3.21(d,1H,J=3.84),3.122.98(m,2H),2.28(S,3H),1.941.86(m,1H),1.271.19(m,1H),1.030.88(m,1H),0.860.76(m,6H);产物4:H.NMR(DMS

11、O,300MHz),l2.01(S,1H),8.35(d,1H,J=,e,卜第6期谭徐林等:手性胺酰胺型液相色谱手性固定相的制备及几种氨基酸衍生物的拆分8478.58),7.72(d,1H,J:9.05),7.387.19(m,5H),7.147.02(m,4H),5.064.98(m,1H),4.204.14(m.1H),2.952.80(m,2H),2.412.26(m,4H),2.23(s,3H),1.531.51(m,1H).1.141.11(m,1H),0.890.86(m,1H),0.680.54(m,6H).手性固定相元素分析结果:C.11.62%:N.2.35%;H.1.88%

12、.3.2手性固定相的手性拆分能力评价用氨基酸衍生物对手性固定相的拆分能力进行初步评价.以正己烷和异丙醇为流动相,手性样品在固定相上的拆分结果见表1和表2.氨基酸衍生物的结构见图2.化合物l7的结构见图2(thestructure0fracematesl一7isshowninFig.2);k容量因子(capacityfactor);d:分离因子(selectivityfactor);Rs:分离度(resolutionfactor).表2,v_3,5一二硝基苯甲酰氨基酸甲酯衍生物在手性固定相上的拆分结果化合物813的结构见图2(thestructureofracemates8一I3isshowni

13、nFig.2).olR=CHCH(CH).亮氰酸(1eucine);2R=CH!CHCH,正缬氨酸(nor-varine);3R=CH,丙氨酸(alanine):4R=cH:CH苯氧酸(PheyIa】anjne):5R=CH!CH,SCH,蚩氨酸(methionine);6R=CH2OH,丝氧酸(serine);7.R=CH,CH,COOH.谷氨酸(glutamicacid);图2外消旋化合物的结构oNO18R=cH:CH(CH,)2,亮氨酸0eucine);9R=CH,CH,CH,正缬氨酸(nor-varine);10R=CH,丙氨酸(alanine);l】R=CH,OH.丝氨睃(serin

14、e);12R=CH,CHCOOH.谷氨酸(glutamicacid);13R=(cH2),NHC(NH)NH:,精氨酸(arginine).上述结果表明,除丝氨酸,谷氨酸的苯甲酰甲酯衍生物和精氨酸的3,5一二硝基苯甲酰甲酯衍生物未能获得拆分外,其它的氨基酸衍生物获得了较好的拆分.由表1可知,随异丙醇含量的减少,溶质的容量因子增大,分离因子增大;而分离度也随之增大.这是由于随异丙醇浓度的减少,流动相的极性降低,固定相与溶质之间作用力增强.当流动相中异丙醇含量为1%时,亮氨酸,苯丙氨酸甲酯的苯甲酰衍生物获得基线分离,其分离因子和分离度分别为1.18,2.53和1.11,1.60.而对于氨基酸3,5

15、一二硝CooCR人NHHCooCR,NH848分析化学第35卷dl41618201517l9l8202224303540t/mint/mint/mint/min图3N-苯甲酰基氨基酸甲酯衍生物的手性拆分色谱图Fig.3ChromatogramsofenantioseparationofN-benzamideOmethylesterderivativesofaminoacidsa.亮氨酸(1eucine);b.正缬氨酸(norvMine);C.苯丙氨酸(Phenylalanine);d.蛋氨酸(methionine);流动相(mobilephase):正已烷/异丙醇(nhexane/isopro

16、pano1)99:1,(wv);流速(flowrate):1.0mL/min;检测波长(detectorwavelength):254am.基苯甲酰甲酯衍生物,流动相中异丙醇的含量对分离因子的影响不明显.当流动相中异丙醇含量为20%时,亮氨酸,缬氨酸,丙氨酸,谷氨酸甲酯的3,5.二硝基苯甲酰衍生物都能获得基线分离.图3是亮氨酸(a),正缬氨酸(b),苯丙氨酸(c)和蛋氨酸(d)的苯甲酰甲酯衍生物手性拆分色谱图.普遍认为,键合型小分子手性固定相拆分机理为氢键作用,7r.7r作用和偶极.偶极作用.本研究氨基酸衍生物的分离可能主要依赖于这些作用.氨基酸衍生物分子中含有苯环,酰胺和酯基,与手性固定相的

17、苯环和羰基可分别发生7r?7r作用和氢键作用.两个对映体由于结合力的差异导致复合物的稳定性不同,因而有不同的洗脱顺序,达到分离的目的.流动相中极性成分异丙醇和样品分子竞争与手性固定相的作用,加快洗脱,所以增加异丙醇的含量可减少保留时间,同时手性选择作用也随之减小.在亮氨酸,正缬氨酸,丙氨酸中,尺基团逐渐变小,其容量因子反而逐渐变大,分离因子却变小,说明氨基酸衍生物与手性固定相之间还存在立体阻碍作用,这种作用对手性识别有影响.References1YuShilin(于世林).MethodsandApplicationsofHighPeormaneeLiquidChromatography(高效液

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22、86,51(25):4991500oPreparationofAmideChiralStationaryPhaseContainingChiralAmineforHighPerformanceLiquidChromatographyandTanXuLin,HouShiCong,WangMin(CollegeofScience,DepartmentofAppl&dChemistry,ChinaAgriculturalUniversity,Beifing100094)AbstractAchiralselectorwhichcontainingtwochiralcenterswasp

23、reparedbycondensationof(R)-1-phenyl一2-(4一methylpheny1)ethylaminewithL-isoleucine.TheL(Boc)-isoleucinewasreactedwith(R)-PTEusingOCCascondensingagentindrytetrahydrofuranatOCfor2handthenatroomtemperaturefor15h.Theinsolublebyproductwasfiltered.Thefiltratewasconcentratedinvacuum,dilutedwithmethylenechlor

24、ideandwashedwith5%HC1solution,saturatedaqueousNaHCO3,andsaturatedNaC1.Theorganicphasewasseparated,driedoveranhydrousNa2SO4overnight.TheBocgroupwassubsequentlycleavedwithtrifluoroaceticacidtoaffordthechiralselector.Thechiralselectorwascovalentlybondedtoaminopropylsilicagelforpreparationofthechiralsta

25、tionaryphaseusingsuccinicanhydrideasconnectingspacer.ThechiralstationaryphasewasappliedtotheenantioseparationofaminoacidderivativesbyHPLCusingn-hexane/isopropanolasmobilephase.Theeffectoftheconcentrationofisopropanolinmobilephaseonenantioseparationwasinvestigated.Theresultsshowedthatthechiralstationaryphasepossessedtheenanti0selecjvitytoaminoacidderivatives.Whentheconcentrationofisopr