第二章7 重组DNA筛选

1、(1)第七节 重组DNA筛选与鉴定基因工程之基因工程之Screening of recombinant DNA通常将摄取外源通常将摄取外源DNA 分子并能使该分子在分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称其中稳定维持的受体细胞统称克隆子克隆子；把采用转化方法获得的克隆子叫做把采用转化方法获得的克隆子叫做转化子转化子。一般仅有少数受体细胞成为克隆子。一般仅有少数受体细胞成为克隆子。 重组体重组体DNADNA分子经转化、转导等途径引入宿主分子经转化、转导等途径引入宿主细胞会得到重组体细胞和噬菌体，其中有多种细胞会得到重组体细胞和噬菌体，其中有多种DNADNA发生：发生： 自连（末连入外源片段的

2、载体）自连（末连入外源片段的载体） 一个载体分子与数个外源片段连接一个载体分子与数个外源片段连接 单纯外源片段连成的多聚体（由于没有单纯外源片段连成的多聚体（由于没有复制起始点和复制基因不能长期存活）复制起始点和复制基因不能长期存活） 目的重组子（载体与一个目的片段相连目的重组子（载体与一个目的片段相连接）接） 因而对于得到的大量克隆群体要进行筛选和鉴因而对于得到的大量克隆群体要进行筛选和鉴定定从转化细菌菌落中筛选含有阳性重组从转化细菌菌落中筛选含有阳性重组DNADNA分子分子的菌落，并鉴定重组的菌落，并鉴定重组DNADNA分子的正确性。分子的正确性。目的基因的筛选和鉴定目的基因的筛选和鉴定（

3、筛筛）1、针对遗传表型筛选、针对遗传表型筛选2 2、根据重组子的结构特征筛选、根据重组子的结构特征筛选快速裂解菌落，鉴定分子大小快速裂解菌落，鉴定分子大小内切酶图谱鉴定内切酶图谱鉴定PCRPCR筛选重组子筛选重组子核酸分子杂交核酸分子杂交1.1 根据载体标记基因筛选根据载体标记基因筛选标记基因在受体细胞内进行表达，呈现出标记基因在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，主要作为筛选特殊的表型或遗传学特性，主要作为筛选转化子的依据。转化子的依据。常用的标记基因常用的标记基因主要是抗性基因以及表达主要是抗性基因以及表达产物可以发光或使反应底物显色的基因。产物可以发光或使反应底物显色的基因

4、。1、针对遗传表型筛选、针对遗传表型筛选抗生素筛选法抗生素筛选法(1) 单抗生素筛选单抗生素筛选 大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素（氨苄青霉素（ampicillin, Amp）、四环素）、四环素(tetracycline,Tet)、卡那霉素、卡那霉素(kanamycin, Kan)抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。平板上生长。 （2）双抗生素筛选）双抗生素筛选双抗生素筛选结果示意图双抗生素筛选结果示意图插入失

5、活筛选法插入失活筛选法当外源当外源DNA序列插入质粒中某一序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。素的培养平板上。 抗生素平板筛选抗生素平板筛选（插入失活插入失活）互补：互补：lazlaz编码的编码的肽链；肽链；半乳糖苷酶突变体半乳糖苷酶突变体-互补（互补（-complementation）：）：许多载体（如许多载体（如M13M13系列、系列、pUCpUC系列、系列、pGEMpGEM系列）都含系列）都含有有-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（laclacZ Z）的调控序列和氨基端的调控序列和氨

6、基端145145个氨基酸的编码序列个氨基酸的编码序列。 （又称（又称-肽）；肽）；这类载体对应的宿主菌（如这类载体对应的宿主菌（如JMJM、DH5DH5系列）系列）-半半乳糖苷酶基因失去了编码乳糖苷酶基因失去了编码-肽碱基序列肽碱基序列只有当这类载体引入到宿主菌后，载体上的只有当这类载体引入到宿主菌后，载体上的-半乳半乳糖苷酶糖苷酶N-N-端片端才能与宿主菌的缺陷端片端才能与宿主菌的缺陷-半乳糖苷酶半乳糖苷酶互补，产生有活性的互补，产生有活性的-半乳糖苷酶，这种作用称为半乳糖苷酶，这种作用称为-互补。互补。蓝蓝-白白筛选筛选显色反应选择法显色反应选择法(-互补法互补法)蓝蓝- -白白筛选筛选:

7、 : （互补）互补）载体：载体：编码编码-半乳糖半乳糖 宿主：宿主： 编码编码-半乳糖半乳糖 苷苷酶酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端序列序列细菌表达细菌表达： - -半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性 （ X-gal） 形成形成当在质粒中插入外源当在质粒中插入外源DNA-DNA-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活不能与宿主不能与宿主-半乳糖半乳糖苷苷酶的酶的C端端进行进行-互补互补产生产生（IPTG 存在下）存在下） - -互补互补IPTG（异丙基（异丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 ）存在下，）存在下，（诱导（诱导LacZ及及LacZ(F因子上因子上)表达）表达）白色菌落。白

8、色菌落。 (5-溴溴-4氯氯-3-吲哚吲哚-D- 半乳糖苷半乳糖苷) 蓝色菌落蓝色菌落互补显色反应互补显色反应 互补显色反应互补显色反应 报告基因的检测报告基因的检测法法 是一种快速而简易地区分转基因生物和非是一种快速而简易地区分转基因生物和非转基因生物的方法。转基因生物的方法。报告基因检测法：指在构建目的基因时将一报告基因检测法：指在构建目的基因时将一种报告基因种报告基因( (如如GUSGUS基因基因) )构建在一起，当目的构建在一起，当目的基因转入受体细胞时，报告基因一同被转入。基因转入受体细胞时，报告基因一同被转入。 报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或报告基因：是一种编码可被检测的蛋

9、白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。容易被鉴定的基因。1.2根据报道（告）基因筛选根据报道（告）基因筛选 gus gus的基因产物的基因产物-葡萄葡萄糖酸酶（糖酸酶（GUSGUS）能够催化）能够催化4-4-甲基伞形花酮甲基伞形花酮-D-D-葡萄糖葡萄糖苷酸，苷酸，产生荧光物质产生荧光物质4-4-甲基甲基伞形花酮，以此筛选含伞形花酮，以此筛选含gusgus基因的转化子。基因的转化子。 由于植物细胞由于植物细胞GUSGUS本底非本底非常低，因此广泛地应用于筛常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。选植物转化子。 尤其是尤其是gusg

10、us基因的基因的33端端与其他结构基因连接产生的与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达，产嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有生的融合蛋白中仍有GUSGUS活活性，可用于外源基因在转化性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。生物体中的定位分析。 luc luc表达产物萤火虫荧光素表达产物萤火虫荧光素酶（酶（LUCLUC）在）在MgMg2+2+的作用下的作用下，可以可以与荧光素和与荧光素和ATPATP底物发生反应底物发生反应，形成与酶结合的形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰腺苷酸荧光素酰化复合物化复合物，经过氧化脱羧作用后经过氧化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态该复合物转变成为

11、处于激活状态的氧化荧光素，可以用荧光测定的氧化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光，仪快速灵敏地检测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。的一种报告基因。 LucLuc基因检测十分迅速，灵基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在放射性敏度高，成本低，不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害，也没有内源荧态所造成的危害，也没有内源荧光产牛的背景干扰，因此，光产牛的背景干扰，因此，LucLuc是一种理想的报告基因。是一种理想的报告基因。 -葡萄糖酸酶基因（葡萄糖酸酶基因（gus）萤火虫荧光素酶

12、基因（萤火虫荧光素酶基因（luc）gus gus 基因基因（葡醛糖酸酶，（葡醛糖酸酶，GUSGUS） 4-4-甲基伞形花酮甲基伞形花酮-D-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-4-甲基伞甲基伞形花酮形花酮 易检测、定量、灵敏度高易检测、定量、灵敏度高 荧光素酶基因荧光素酶基因lucluc， 营养缺陷型检测法营养缺陷型检测法 已知蛋白质中的亮氨酸（已知蛋白质中的亮氨酸（LeuLeu）为）为LeuLeu营养缺陷菌营养缺陷菌所必需所必需, , 当外源目的基因可表达亮氨酸当外源目的基因可表达亮氨酸, , 将该基因的将该基因的重组子转入重组子转入LeuLeu缺陷菌中缺陷菌中, , 在

13、不含亮氨酸的基本培养基在不含亮氨酸的基本培养基平板中平板中, , 只有重组子表达的亮氨酸才能被只有重组子表达的亮氨酸才能被LeuLeu缺陷菌所缺陷菌所利用而能生长繁殖利用而能生长繁殖, ,形成菌落。因而能生长的细菌集落，形成菌落。因而能生长的细菌集落，均为阳性的重组子克隆，而无该重组子的均为阳性的重组子克隆，而无该重组子的LeuLeu缺陷菌在缺陷菌在不含亮氨酸的平板上则不能生长，不能形成菌落。不含亮氨酸的平板上则不能生长，不能形成菌落。营养互补筛选系统：营养互补筛选系统： 细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞

14、营养互补作用原即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。如：理可以筛选杂种细胞。如： A A：色氨酸缺陷型；：色氨酸缺陷型；B B：苏氨酸缺陷型：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。而亲本细胞均会死亡。 通过系列筛选方法获得转化子后，为通过系列筛选方法获得转化子后，为了确定获得的转化子是真正需要的重了确定获得的转化子是真正需要的重组子，还须进一步分析鉴定重组子基组子，还须进一步分析鉴定重组子基因组中的外源因组中的外源DNADNA片段、目的基因转录片段、目的基因转录的的mRNA

15、mRNA或翻译的多肽（蛋白质、酶）。或翻译的多肽（蛋白质、酶）。2、根据重组子的结构特征筛选、根据重组子的结构特征筛选2.1根据重组根据重组DNA 分子大小鉴定分子大小鉴定 主要是根据主要是根据有外源有外源DNADNA片段插入载体后的重组片段插入载体后的重组DNADNA与载与载体体DNADNA之间的大小差异之间的大小差异来鉴定重组子。来鉴定重组子。 分别提取不同转化子的分别提取不同转化子的DNADNA，经琼脂糖凝胶电泳，由于，经琼脂糖凝胶电泳，由于重组重组DNADNA是载体是载体DNADNA中插入了外源中插入了外源DNADNA片段，其分子量大片段，其分子量大于载体于载体DNADNA分子，在琼脂

16、糖凝胶板上出现的分子，在琼脂糖凝胶板上出现的DNADNA带中，带中，落后的带是重组落后的带是重组DNADNA的带的带。 这是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法，这是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法，直观快捷，只须获得质粒直观快捷，只须获得质粒DNADNA分子的粗制裂解液即可进分子的粗制裂解液即可进行琼脂糖凝胶电泳，尤其适用于插入片段较大的重组行琼脂糖凝胶电泳，尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。子的筛选。 此方法只用于重组子的初步鉴定。此方法只用于重组子的初步鉴定。2.2酶切鉴定酶切鉴定 用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出

17、的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。 （1） 插入片段大小的鉴定插入片段大小的鉴定 （2） 插入片段方向性的鉴定插入片段方向性的鉴定限制性内切酶图谱鉴定限制性内切酶图谱鉴定 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力 不同迁移率分子量标准参照物l 酶切和电泳方法2.32.3利用利用PCRPCR方法筛选确定重组子方法筛选确定重组子 由于在载体由于在载体DNADNA分子中，分子中，外源外源DNADNA插入位点的两侧插入位点的两侧序列多数是已知的，序列多数是已知的，可以可以设计合成相应

18、的设计合成相应的PCRPCR引物，引物，以待鉴定的转化子或重组以待鉴定的转化子或重组子的子的DNADNA为模板进行为模板进行PCRPCR反反应，反应产物经琼脂糖凝应，反应产物经琼脂糖凝胶电泳，胶电泳，若出现特异性扩若出现特异性扩增增DNADNA带，并且其分子量带，并且其分子量同预期的一致，同预期的一致，则可确定则可确定含此重组含此重组DNADNA分子的重组分子的重组子是期待的重组子。子是期待的重组子。PCR筛选法筛选法主混合池主混合池行混合池行混合池列混合池列混合池分别分别PCR扩增扩增引物：引物：1）同源引物，即）同源引物，即 邻近种属的相应基因邻近种属的相应基因2）根据氨基酸序列设计简并引

19、物）根据氨基酸序列设计简并引物2.42.4核酸分子杂交检测法核酸分子杂交检测法 基本原理是基本原理是：具有一定同源性的两条核酸：具有一定同源性的两条核酸(DNA(DNA或或RNA)RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下，单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。链。 该技术也可用于重组子的筛选鉴定，杂交的双该技术也可用于重组子的筛选鉴定，杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段段( (称为称为探针探针) )。 核酸杂交核酸杂交：两种不同来源单链：两种不同来源单链D

20、NA或或RNA相互配对的过程相互配对的过程分子杂交分子杂交：生物大分子之间通过相互作用结合在一起：核酸：生物大分子之间通过相互作用结合在一起：核酸之间通过碱基互补配对；蛋白质之间通过抗原、抗体反应；之间通过碱基互补配对；蛋白质之间通过抗原、抗体反应；核酸、蛋白质之间通过疏水作用，氢键进行相互作用。核酸、蛋白质之间通过疏水作用，氢键进行相互作用。 是将待测核酸变性后，用一定的方法将其固是将待测核酸变性后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维膜定在硝酸纤维膜( (或尼龙膜或尼龙膜) )上，这个过程也称为上，这个过程也称为核酸印迹转移核酸印迹转移，然后用经标记示踪的特异核酸探，然后用经标记示踪的特异核酸探

21、针与之杂交结合，洗去其他的非特异结合核酸分针与之杂交结合，洗去其他的非特异结合核酸分子后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补子后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异的特异DNADNA片段所在的位置。片段所在的位置。 根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同，核酸分子杂交检测法相支持物上的方法的不同，核酸分子杂交检测法可分为可分为 菌落印迹原位杂交菌落印迹原位杂交、 斑点印迹杂交斑点印迹杂交、 southern southern印迹杂交印迹杂交 Nothern Nothern印迹杂交印迹杂交 基本做法基本做法:核酸原位杂交的基本

22、步骤核酸原位杂交的基本步骤1.1.细胞或组织的固定细胞或组织的固定（如（如载玻片）载玻片）2.2.组织细胞杂交前的预处理组织细胞杂交前的预处理 - -用去垢剂或蛋白酶除去用去垢剂或蛋白酶除去 核酸表面蛋白质核酸表面蛋白质3.DNA3.DNA探针的选择和标记（探针的选择和标记（ 32P ）4.4.杂交杂交5.5.杂交结果检测（杂交结果检测（放射自显影法）1.荧光染色体原位杂交荧光染色体原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 基本原理是将基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来

23、检测的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染序列在染色体上的定位。色体上的定位。 2.多色荧光染色体原位杂交多色荧光染色体原位杂交(multicolor FISH; mFISH )3.比较基因组原位杂交比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridization；CGH )由原位杂交发展起的一些新技术由原位杂交发展起的一些新技术斑点杂交斑点杂交： 将待测将待测DNA或或RNA或细胞裂解物变性后直接点在硝或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上，不需限制性酶进行酶切，即可与探针酸纤维素膜上，不需限制性酶进行酶切，即可与探针进行杂交反应。进行杂交反应。 该技术对

24、于基因拷贝数多的样品很适合，具有间接快该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有间接快速的特点，一般可作大批量样品的筛选。速的特点，一般可作大批量样品的筛选。 Dot blotting（斑点杂交）（斑点杂交）Southern blotting(DNA印迹印迹)Southern杂交纪念发明者Edward Southern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析DNA样品限制酶样品限制酶 酶解酶解电泳电泳鉴定克隆-Southern分子杂交 探针可以探针可以是是DNADNA，也可，也可以是以是RNARNA； 可以

25、用可以用放放射性同位素射性同位素标记，也可标记，也可以用以用生物素生物素或荧光素或荧光素标标记。记。 裂解细胞，使裂解细胞，使DNA释放，用释放，用Tris液液溶解，交替使用酚、氯仿两种蛋白溶解，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质（标准质变性剂，有效去除蛋白质（标准程序：酚程序：酚酚酚-氯仿氯仿氯仿）氯仿）硝酸纤维素硝酸纤维素(NC)膜、膜、尼龙膜尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法转印法、真空转移法电转印法电转印法真空转移法真空转移法毛细管虹吸印迹法毛细管虹吸印迹法 在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应

26、用最广的一种固相支持物，但它也存在一些不足之处：种固相支持物，但它也存在一些不足之处：第一、硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合第一、硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNADNA的，这的，这种结合并不十分牢固。种结合并不十分牢固。第二、硝酸纤维素滤膜质地校脆弱，容易碎裂，因此操作须小第二、硝酸纤维素滤膜质地校脆弱，容易碎裂，因此操作须小心谨慎心谨慎( (待别是经烘烤后待别是经烘烤后) )。第三、硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐第三、硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐浓度时结合浓度时结合DNADNA效果不佳，不适宜于电转印迹法。效果不佳，不适宜于电转印迹法。

27、第四、硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的第四、硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNADNA片段片段( (特别是小于特别是小于200bp200bp的的DNADNA片段片段) )结合能力不强。结合能力不强。硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 现在人们更倾向于使用现在人们更倾向于使用尼龙膜尼龙膜。 尼龙膜结合尼龙膜结合DNADNA和和RNARNA的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合，经烘烤或紫外线照射后，子质量的核酸也能较好地结合，经烘烤或紫外线照射后，这种结合更加牢固。同时尼龙膜韧性强，操作较方便，对这种结合更加牢固。同时尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓

28、度要求不高，可重复用于杂文。但其杂交信号本底离子浓度要求不高，可重复用于杂文。但其杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高，这可通过增加预杂交液中的非待异较硝酸纤维素滤膜高，这可通过增加预杂交液中的非待异性封闭试剂用量的方法加以克服。性封闭试剂用量的方法加以克服。尼龙膜尼龙膜放射自显影照片放射自显影照片GGATCCATCCCCTGCTC AGGAGGCAAGAGGCATGGGGACGAGTCCTCCGTTCTP32Target geneDNAdenaturationSingle colonyLysedHybridizationProbe is labeled with radioactive 32PJu

29、ang RH (2004) BCbasics如果核苷酸序列测定结果如果核苷酸序列测定结果与预期与预期DNA 片段的核苷片段的核苷酸序列一致，表明待鉴定酸序列一致，表明待鉴定的重组子是真正含有预期的重组子是真正含有预期DNA 片段的重组子。片段的重组子。2.5根据根据DNA 核苷酸序列鉴定核苷酸序列鉴定3 根据目的基因转录产物鉴定根据目的基因转录产物鉴定采用杂交法鉴定采用杂交法鉴定主要采用的是主要采用的是Northern杂交法，类似于杂交法，类似于Southern 杂交，不同的是用杂交，不同的是用DNA 探针探针检测检测RNA 分子。分子。RNA操作！？操作！？Northern吸印杂交吸印杂交具

30、体做法是具体做法是： 提取重组体总提取重组体总RNARNA或或mRNAmRNA，在强变性剂如甲基汞或甲醛，在强变性剂如甲基汞或甲醛存在的情况下存在的情况下( (防止防止RNARNA形成二级结构环形成二级结构环) )，进行琼脂糖，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后，将电泳分离开的凝胶电泳，电泳后，将电泳分离开的RNARNA原位吸印到经原位吸印到经化学处理过的纸或硝酸纤维素膜上，用同位素标记的探化学处理过的纸或硝酸纤维素膜上，用同位素标记的探针进行杂交，然后放射自显影，根据针进行杂交，然后放射自显影，根据X X光片上的条带，光片上的条带，可以了解与探针互补的可以了解与探针互补的RNARNA的大小及数量。的

31、大小及数量。由于由于RNARNA比比DNADNA更易受到各种因素的降解，整个操作过程必更易受到各种因素的降解，整个操作过程必须十分小心，按规程操作。须十分小心，按规程操作。对转基因生物对转基因生物NorthernNorthern杂交显示阳性，说明外源基因已经杂交显示阳性，说明外源基因已经转入受体基因组中，并且顺利地进行转录，形成转入受体基因组中，并且顺利地进行转录，形成mRNAmRNA。 基本原理与基本原理与Southern大致相同，只是检测的对象大致相同，只是检测的对象不是不是DNA，而是，而是RNA。Northern 印迹杂交印迹杂交(Northern bloting)检测检测RNA（主要

32、是（主要是mRNA）的方法）的方法 与与Southern杂交的不同杂交的不同 靶核酸：靶核酸：RNA，不需用限制酶消化，不需用限制酶消化 RNA电泳电泳 转膜：电泳结束后不需变性转膜：电泳结束后不需变性(一般不能采用碱变一般不能采用碱变性处理性处理) 应用：检测外源基因在宿主中能否转录RNARNA提取注意事项提取注意事项：1.1.样品细胞的有效破碎样品细胞的有效破碎 2.2.使核蛋白复合体变性使核蛋白复合体变性 3.3.对内源对内源RNARNA酶的有效抑制酶的有效抑制4.4.有效地将有效地将RNARNA从从DNADNA和蛋白混合物中分离和蛋白混合物中分离4 根据目的基因翻译产物鉴定根据目的基因

33、翻译产物鉴定4.1蛋白质凝胶电泳法鉴定蛋白质凝胶电泳法鉴定20.1 kD14.3 kD97.2 kD18 kD4.2免疫检测法鉴定免疫检测法鉴定酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法(Elisa)必须制备特异必须制备特异性抗原的酶标性抗原的酶标一抗或针对一一抗或针对一抗的酶标二抗抗的酶标二抗 主要用于检测外源基因在转化细胞中的表达情况，主要用于检测外源基因在转化细胞中的表达情况，即是否进行了翻译，产生了外源基因所编码的蛋白即是否进行了翻译，产生了外源基因所编码的蛋白质质主要步骤：主要步骤： 蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳电泳 蛋白质的电转移：蛋白质

34、的电转移： 靶蛋白的免疫学检测（靶蛋白的免疫学检测（抗体与抗原结合反应抗体与抗原结合反应） 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应显色反应：酶促反应Western吸印杂交吸印杂交：如何从所克隆到基因重组体中鉴定目的基因如何从所克隆到基因重组体中鉴定目的基因的存在和正确性？的存在和正确性？根据插入基因的遗传性状进行筛选根据插入基因的遗传性状进行筛选 只有当已知需克隆基因所编码蛋白质的功能只有当已知需克隆基因所编码蛋白质的功能, , 且且该蛋白质又为细菌的生命活动所必需时该蛋白质又为细菌的生命活

35、动所必需时, , 即可用该即可用该方法筛选。方法筛选。 如：已知蛋白质中的亮氨酸（如：已知蛋白质中的亮氨酸（LeuLeu）为）为LeuLeu营养缺陷营养缺陷菌所必需菌所必需, , 当外源目的基因可表达亮氨酸当外源目的基因可表达亮氨酸, , 将该基将该基因的重组子转入因的重组子转入LeuLeu缺陷菌中缺陷菌中, , 在不含亮氨酸的基本在不含亮氨酸的基本培养基平板中培养基平板中, , 只有重组子表达的亮氨酸才能被只有重组子表达的亮氨酸才能被LeuLeu缺陷菌所利用而能生长繁殖缺陷菌所利用而能生长繁殖, ,形成菌落。因而能生长形成菌落。因而能生长的细菌集落，均为阳性的重组子克隆，而无该重组的细菌集落

36、，均为阳性的重组子克隆，而无该重组子的子的LeuLeu缺陷菌在不含亮氨酸的平板上则不能生长，缺陷菌在不含亮氨酸的平板上则不能生长，不能形成菌落。不能形成菌落。根据重组子的结构特征筛选根据重组子的结构特征筛选(1). 重组子大小鉴别筛选重组子大小鉴别筛选 重组子中因装有一段较大分子量的外源基因重组子中因装有一段较大分子量的外源基因D DNA, NA, 因此其分子量明显比原载体大得多因此其分子量明显比原载体大得多, , 因此可因此可从平板上挑取菌落分别提取重组载体（如质粒重从平板上挑取菌落分别提取重组载体（如质粒重组子）和原载体（质粒），组子）和原载体（质粒），无需用限制性内切酶无需用限制性内切酶

37、消化，直接进行凝胶电泳，携带外源性目的基因消化，直接进行凝胶电泳，携带外源性目的基因的重组子质粒因分子量大，电泳迁移率较小，的重组子质粒因分子量大，电泳迁移率较小，其其电泳条带在后，而原载体质粒因分子量较小，电电泳条带在后，而原载体质粒因分子量较小，电泳迁移率较大，其电泳条带在前。通过比较可初泳迁移率较大，其电泳条带在前。通过比较可初步判断重组子中是否插入外源基因片段步判断重组子中是否插入外源基因片段。本方法本方法适用于插入片段较大的重组子的初步筛选。适用于插入片段较大的重组子的初步筛选。(2). 酶切鉴定酶切鉴定 对于筛选出的具有重组子的菌株，应经小量培养后，再分别对于筛选出的具有重组子的菌

38、株，应经小量培养后，再分别提取原载体或重组体载体（重组质粒或重组噬菌体提取原载体或重组体载体（重组质粒或重组噬菌体DNADNA），根），根据已知重组时外源基因两端的酶切位点，分别用相应的两种内据已知重组时外源基因两端的酶切位点，分别用相应的两种内切酶进行酶解，经琼脂糖电泳后，原载体因无外源性目的基因，切酶进行酶解，经琼脂糖电泳后，原载体因无外源性目的基因，切开后变成线性，电泳呈一条带，若载体上有外源性目的基因切开后变成线性，电泳呈一条带，若载体上有外源性目的基因插入，切开后电泳出现两条带：一条为载体质粒线性条带，一插入，切开后电泳出现两条带：一条为载体质粒线性条带，一条为释放出的插入基因片断的

39、小分子条带，这样就可以看出载条为释放出的插入基因片断的小分子条带，这样就可以看出载体中是否有插入的目的基因片断，以及由体中是否有插入的目的基因片断，以及由DNA markerDNA marker条带对比条带对比分析可得知插入基因片段的大小分析可得知插入基因片段的大小(3). 目的基因序列测定目的基因序列测定1.化学降解法也叫化学降解法也叫Maxam-Gilbert法。法。 2. 酶促法酶促法 又叫又叫Sanger法和链终止法。法和链终止法。3.自动化测序法自动化测序法 小小 结结重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的

40、基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 Cre-LoxP重组酶系统 P36(自学) Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。 Cre重组酶和LoxP序列 ： 于1981年从P1噬菌体中发现，属于Int酶超基因家族。 Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。Cre重组酶Lo

41、xP（locus of X-over P1）序列：）序列： 来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与 DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：5 - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 33 - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5 CreCre重组酶介导两个重组酶介导两个LoxPLoxP位点间的重位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可组是一个动态、可

42、逆的过程，可以以分成三种情况分成三种情况：1 1、如果两个、如果两个LoxPLoxP位点位于一条位点位于一条DNDNA A链上，且方向相同，链上，且方向相同，CreCre重组酶能重组酶能有效切除两个有效切除两个LoxPLoxP位点间的序列；位点间的序列；2 2、如果两个、如果两个LoxPLoxP位点位于一条位点位于一条DNDNA A链上，但方向相反，链上，但方向相反，CreCre重组酶能重组酶能导致两个导致两个LoxPLoxP位点间的序列倒位；位点间的序列倒位；3 3、如果两个、如果两个LoxPLoxP位点分别位于两位点分别位于两条不同的条不同的DNADNA链或染色体上，链或染色体上，CreC

43、re酶酶能介导两条能介导两条DNADNA链的交换或染色体易链的交换或染色体易位。位。 另外，另外，Cre不仅可以识别不仅可以识别LoxP的的2个个13bp的反向重的反向重复序列和复序列和8bp的间隔区的间隔区域，而且当一个域，而且当一个13bp的的反向重复序列或者反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利能识别并发生重组。利用这一特点，人们在构用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要建载体时可以根据需要改造改造LoxP位点序列，以位点序列，以用于特定的基因突变或用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的修复，增加了该系统的应用范围。应用范围。 Cre-Lo

44、xP系统的特性 Cre-LoxPCre-LoxP重组酶系统在基因打靶中的应用策略重组酶系统在基因打靶中的应用策略 基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。 Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。或者将Cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达

45、Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除（诱导性基因敲除），实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。 五、重组体在宿主细胞中的表达和调控五、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。白质产品。 克隆基因表达有三个条件克隆基因表达有三个条件 基因的编码区不能被插入序列中断基因的编码区不能被插入序列中断; ; 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的细胞的RNARNA聚合酶有效地

46、识别聚合酶有效地识别; ; mRNA mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 目的基

47、因表达，是否有合适的启动子，用外来基因目的基因表达，是否有合适的启动子，用外来基因的启动子；启动子与受体细胞的的启动子；启动子与受体细胞的RNA聚合酶是否协聚合酶是否协调；外源调；外源DNA插入方向与转录方向是否一致插入方向与转录方向是否一致 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因e、复制原点、复制原点大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？优点：大肠杆菌培养方便、

48、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。缺点：在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。基因表达的四大表达系统分别为 大肠杆菌、酵母

49、菌、 哺乳动物细胞 、昆虫细胞 。1. 原核表达体系原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准标准：选择标志：选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋

50、白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点缺点：操作技术难、费时、经济：操作技术难、费时、经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2. 真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞 重组重组 DNA DNA 分子进入寄主细胞后，其中的目的基分子进入寄主细胞后，其中的目的基因能否表达，表达效率高低，还有很大差别。因能否表达，表达效率高低，还有很大差别。表达表达通常是指目的基因编码的蛋白质合成。通常是指目的基因编码的

51、蛋白质合成。基因工程的基因工程的最后一步，是把所获得的蛋白质最后一步，是把所获得的蛋白质分离纯化分离纯化，得到蛋，得到蛋白质产品。白质产品。分离基因用于基因诊断、分离基因用于基因诊断、基因治疗或基因结构与基因治疗或基因结构与功能研究功能研究基因工程的产品如乙肝疫基因工程的产品如乙肝疫苗、胰岛素、生长激素、苗、胰岛素、生长激素、生长因子、肿瘤坏死因子、生长因子、肿瘤坏死因子、干扰素等干扰素等基因工程菌基因工程菌基因工程反应器基因工程反应器一、反义基因技术的基本概念和原理一、反义基因技术的基本概念和原理 反义反义RNA(antisenseRNA)RNA(antisenseRNA)： 反义反义RNA

52、RNA是指与是指与mRNAmRNA互补的互补的RNARNA分子分子, , 也包括与也包括与其它其它RNARNA互补的互补的RNARNA分子分子. .由于核糖体不能翻译双链由于核糖体不能翻译双链的的RNARNA，所以反义，所以反义RNARNA与与mRNAmRNA特异性的互补结合特异性的互补结合, , 即抑制了该即抑制了该mRNAmRNA的翻译。的翻译。 转录产生反义转录产生反义RNARNA的基因称之为反义基因。的基因称之为反义基因。 通过反义通过反义RNARNA控制控制mRNAmRNA的翻译是原核生物的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式，最早是在基因表达调控的一种方式，最早是在E.coli E

53、.coli 的产肠杆菌素的的产肠杆菌素的Col E1Col E1质粒中发现的质粒中发现的, ,许多实许多实验证明在真核生物中也存在反义验证明在真核生物中也存在反义RNARNA。反义基因技术 反义反义RNARNA的来源的来源 细胞中反义细胞中反义RNA的来源有两种途径的来源有两种途径 第一是反向第一是反向转录的产物，在多数情况下转录的产物，在多数情况下, 反义反义RNA是特定靶基因是特定靶基因互补链反向转录产物互补链反向转录产物, 即产生即产生mRNA和反义和反义RNA的的DNA是同一区段的互补链。第二种来源是不同基因产是同一区段的互补链。第二种来源是不同基因产物，如物，如OMPF基因是大肠杆菌

54、的膜蛋白基因，与透性基因是大肠杆菌的膜蛋白基因，与透性有关，其反义基因有关，其反义基因MICFZE则为另一基因则为另一基因 反义子反义子：编码反义：编码反义RNA的的DNA称为反义子。称为反义子。反义子在反义子在DNA的的复制、转录和翻译复制、转录和翻译三个水平对基因的表达三个水平对基因的表达起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍。起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍。 复制水平的调节复制水平的调节直接抑制直接抑制反义反义RNA与引物与引物RNA前体互补，使得引物前体互补，使得引物RNA无法与无法与DNA模板结合，进而抑制模板结合，进而抑制DNA复制的频率。复制的频率。间接抑制间

55、接抑制反义反义RNA通过阻断复制激活蛋白因子的合成通过阻断复制激活蛋白因子的合成而间接抑制而间接抑制DNA的复制。的复制。 转录水平的调节转录水平的调节反义反义RNA通过与通过与mRNA的的5 端互补结合而阻止转录的延伸；端互补结合而阻止转录的延伸；作用于作用于mRNA的的poly(A)区域，抑制区域，抑制mRNA的成熟及其运输；的成熟及其运输；与真核生物与真核生物mRNA结合而影响其剪切加工。结合而影响其剪切加工。 翻译水平的调节翻译水平的调节通过与通过与mRNA的的5 端端SD序列结合，改变其空间构象，从而序列结合，改变其空间构象，从而影响核糖体在影响核糖体在mRNA上的定位；上的定位；通

56、过与通过与mRNA的的5端编码区（如起始密码）结合，直接抑端编码区（如起始密码）结合，直接抑制翻译的起始。制翻译的起始。SD序列（序列（SD sequence）：系：系Shine-Dalgarno序列的简称，序列的简称，此为纪念最早发现该序列的研究者而命名的。它此为纪念最早发现该序列的研究者而命名的。它是原核生物是原核生物中核糖体的结合位点中核糖体的结合位点，亦即存在于，亦即存在于mRNA分子分子AUG起始密码起始密码子之前的多聚嘌呤序列子之前的多聚嘌呤序列AGGAGGG的部分或全部，可与的部分或全部，可与16S rRNA的的3 -末端序列互补。末端序列互补。SD序列在核糖体同序列在核糖体同m

57、RNA的结合的结合过程中起重要作用。过程中起重要作用。 指把一段指把一段DNADNA序列以反义方向插入到合适的启序列以反义方向插入到合适的启动子和终止子之间，然后把此基因构建体转化到动子和终止子之间，然后把此基因构建体转化到受体细胞中去受体细胞中去( (通常用农杆菌转化的方法通常用农杆菌转化的方法) )，通过，通过选择培养获得转化生物体的技术。选择培养获得转化生物体的技术。反义反义RNA技术：技术： 就是应用反义技术(antisense technology)特异封闭某些基因的表达，以达到抑制某些有害基因的表达。 基因失活基因失活(gene inactivation)(gene inactiv

58、ation)反义基因的表达载体构建方法：反义基因的表达载体构建方法：第一步，分离得到的第一步，分离得到的mRNAmRNA为模板，合成反义为模板，合成反义DNADNA；第二步，以此反义链为模板合成有义第二步，以此反义链为模板合成有义DNADNA链；链；第三步，以细菌质粒第三步，以细菌质粒(DNA)(DNA)为载体，用限制性内切酶为载体，用限制性内切酶在靠近启动子处切割一缺口；在靠近启动子处切割一缺口；第四步，将有义第四步，将有义DNADNA插入表达载体的缺口中，即得到插入表达载体的缺口中，即得到一表达质粒，如果启动子开始转录，表达载体即转录一表达质粒，如果启动子开始转录，表达载体即转录原来的原来

59、的mRNAmRNA；如果将插入的表达载体用限制性内切酶；如果将插入的表达载体用限制性内切酶切割后，以相反的方向插入载体切割后，以相反的方向插入载体DNADNA环中，即表达载环中，即表达载体转录形成反义体转录形成反义RNARNA。 二、二、 反义基因技术的特点反义基因技术的特点 1 1、反义、反义RNARNA可以高度专一地调节某一特定基因可以高度专一地调节某一特定基因的表达，不影响其他基因的表达。的表达，不影响其他基因的表达。 2 2、转化到植物中的反义、转化到植物中的反义RNARNA的作用类似于遗传的作用类似于遗传上的缺陷型，表现为显性。所以被转化的植物上的缺陷型，表现为显性。所以被转化的植物

60、材料不必为纯合体就可表现相应的性状，从而材料不必为纯合体就可表现相应的性状，从而避免了二倍体内等位基因的显隐性干扰。避免了二倍体内等位基因的显隐性干扰。 3 3、反义基因整合到植物的基因组中可独立表、反义基因整合到植物的基因组中可独立表达和稳定遗传，后代符合孟德尔遗传规律。达和稳定遗传，后代符合孟德尔遗传规律。 4 4、反义基因不必了解其目的基因所编码的蛋、反义基因不必了解其目的基因所编码的蛋白质结构，可省去对基因产物的研究工作。白质结构，可省去对基因产物的研究工作。 5 5、反义基因不改变目的基因的结构，在应用、反义基因不改变目的基因的结构，在应用上更加安全。上更加安全。 三、三、 反义基因