实验一、蛋白质的等电点测定和沉淀反应

1、实验一、蛋白质等电点实验一、蛋白质等电点测定及沉淀反应测定及沉淀反应 一、实验目的一、实验目的1 1、了解蛋白质的两性解离性质、了解蛋白质的两性解离性质2 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法、学习测定蛋白质等电点的一种方法3 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识4 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义5 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系、了解蛋白质变性与沉淀的关系 二、实验原理二、实验原理n蛋白质是蛋白质是两性电解质两性电解质。在蛋白质溶液中存在下。在蛋白质溶液中存在下列平衡：列平衡：n蛋白质分子的解离状态和解离程度

2、受蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸溶液的酸碱度碱度影响。影响。n当溶液的当溶液的pHpH为一定值时，蛋白质极性基团解离为一定值时，蛋白质极性基团解离的正负离子数相等，净电荷为的正负离子数相等，净电荷为0 0，此溶液的，此溶液的pHpH值值为该为该蛋白质的等电点蛋白质的等电点。n不同蛋白质具有各自特定的等电点，与该蛋白不同蛋白质具有各自特定的等电点，与该蛋白质的组成结构有关。质的组成结构有关。n在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用性质的变化测定各种蛋白质的等电点。利用性质的变化测定各种蛋白质的等电点。n常用方法常用方法：测其溶解度最低时的溶

3、液：测其溶解度最低时的溶液pHpH值。值。问题：蛋白质等电点的测定还有哪些方法问题：蛋白质等电点的测定还有哪些方法?n本实验通过本实验通过观察不同观察不同pHpH溶液中酪蛋白的溶解溶液中酪蛋白的溶解度来测定其等电点度来测定其等电点。n用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同中）配制各种不同pHpH值的缓冲液。向各缓冲值的缓冲液。向各缓冲溶液中加入酪蛋白后，溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲沉淀出现最多的缓冲液的液的pHpH值即为酪蛋白的等电点值即为酪蛋白的等电点。n在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成水水化

4、层化层和和双电层双电层而成为稳定的亲水胶体。而成为稳定的亲水胶体。n在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因因失去电荷和脱水失去电荷和脱水而沉淀。而沉淀。n蛋白质的沉淀反应可分为两类。蛋白质的沉淀反应可分为两类。可逆的沉淀反应可逆的沉淀反应 l蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。l如：盐析作用、低温下用乙醇（丙酮）短时间如：盐析作用、低温下用乙醇（丙酮）短时间作用

5、于蛋白质。作用于蛋白质。l提纯蛋白质时，常利用此类反应。提纯蛋白质时，常利用此类反应。问题：提纯蛋白质时常用的沉淀方法有哪些问题：提纯蛋白质时常用的沉淀方法有哪些? 不可逆沉淀反应不可逆沉淀反应l蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。而沉淀，不再溶于原来溶剂中。l加热加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金重金属离子属离子或某些或某些有机酸有机酸的反应都属于此类。的反应都属于此类。问题：这些不可逆的沉淀反应有哪些应用问题：这些不可逆的沉淀反应有哪些应用?l蛋白质变性后，有时由于维持溶液

6、稳定的蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。条件仍然存在（如电荷），并不析出。l因此因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而而沉淀的蛋白质也未必都已变性沉淀的蛋白质也未必都已变性。三、试剂器材三、试剂器材1 1、实验材料、实验材料n 鸡蛋清鸡蛋清n 牛奶牛奶2 2、仪器设备、仪器设备 n水浴锅水浴锅 n温度计温度计n锥形瓶锥形瓶 n100mL100mL容量瓶容量瓶n吸管吸管n试管及试管架试管及试管架 n0.4% 0.4% 酪蛋白乙酸钠溶液：酪蛋白乙酸钠溶液：取取20mL20mL牛奶，加入牛奶，加入10mL 1mol/L NaAC,10

7、mL 1mol/L NaAC,用去离子水定容至用去离子水定容至100mL100mLn 1.00 mol/L 1.00 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液n 0.10 mol/L 0.10 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液n 0.01 mol/L 0.01 mol/L 醋酸溶液醋酸溶液3 3、试剂、试剂n蛋白质溶液：蛋白质溶液：5%5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清（新鲜鸡蛋清: :水水=1:9=1:9）n0.2M 0.2M 醋酸醋酸- -醋酸钠缓冲液，醋酸钠缓冲液，pH4.7 pH4.7 n3%3%硝酸银溶液硝酸银溶液n5%5%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液n95%95%

8、乙醇乙醇n饱和硫酸铵溶液：饱和硫酸铵溶液：2525，100mL100mL水水76.7g76.7g硫酸铵硫酸铵n0.1 M0.1 M盐酸溶液盐酸溶液n0.1 M0.1 M氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液n0.05 M0.05 M碳酸钠溶液碳酸钠溶液n0.1 M0.1 M醋酸溶液醋酸溶液n甲基红溶液：甲基红溶液：pHpH变色范围为变色范围为4.4-6.24.4-6.2，由红变黄，由红变黄 四、实验操作四、实验操作（一）酪蛋白等电点的测定一）酪蛋白等电点的测定（1 1）取）取4 4支试管，按下表顺序分别加入各试剂，混匀。支试管，按下表顺序分别加入各试剂，混匀。试管号试管号蒸馏水蒸馏水mL0.01 M醋酸醋酸

9、mL0. 1 M醋酸醋酸mL1. 0 M醋酸醋酸mL18.40.6-28.7-0.338.0-1.047.4-1.6（2 2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL1mL，加一管，摇匀一管。此时加一管，摇匀一管。此时1 1、2 2、3 3、4 4管的管的pHpH依次为依次为5.95.9、5.55.5、4.74.7、3.53.5。观察其混浊度。静置。观察其混浊度。静置1010分钟分钟后，再观察其混浊度。后，再观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀）的一最混浊（有颗粒沉淀）的一管管pHpH即为酪蛋白的等电点即为酪蛋白的等电点。（二）蛋白质沉淀实验（二）蛋白质沉淀实验

10、1. 蛋白质的盐析蛋白质的盐析n加加5%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液5 mL于试管中，再加等量于试管中，再加等量饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。蛋白的沉淀。n离心，取沉淀，加少量水，观察是否溶解。离心，取沉淀，加少量水，观察是否溶解。n离心后上清液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为离心后上清液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。止，此时析出的沉淀为清蛋白。n离心，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察离心，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀能否重新溶解。沉淀能否重新溶解。2. 重金属离子沉淀蛋白质重金属离子沉淀蛋白质n取取1

11、支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加，再加3%硝酸银溶液硝酸银溶液12滴，振荡试管，有沉淀产生。滴，振荡试管，有沉淀产生。n离心倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉离心倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？淀是否溶解？为什么？ 3有机酸沉淀蛋白质有机酸沉淀蛋白质n取取1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加，再加1 mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。生成。n离心倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察离心倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解沉淀是否溶解。4有机溶剂沉淀蛋白质有机溶

12、剂沉淀蛋白质n取取1支试管，加入支试管，加入2 mL蛋白质溶液，再加蛋白质溶液，再加入入2 mL 95%乙醇。混匀，观察沉淀的生乙醇。混匀，观察沉淀的生成。成。5乙醇引起的变性与沉淀乙醇引起的变性与沉淀 取取3支试管，编号，依下表顺序加入试剂：支试管，编号，依下表顺序加入试剂： 试剂试剂 mL 管号管号 5%卵卵清蛋白清蛋白0.1 M氢氧化氢氧化钠钠0.1 M盐酸盐酸pH4.7缓冲液缓冲液 95%乙乙醇醇 111121113111n振摇混匀后，观察各管有何变化。振摇混匀后，观察各管有何变化。n放置片刻，向各管内加水放置片刻，向各管内加水8 mL。在。在2、3号管中各加一滴甲基红，分别用号管中各

13、加一滴甲基红，分别用0.1 M醋醋酸酸溶液及溶液及0.05 M碳酸钠碳酸钠溶液中和。溶液中和。观察颜观察颜色的变化和沉淀的生成色的变化和沉淀的生成。n每管再加每管再加0.1 M盐酸溶液数滴，观察沉淀盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。的再溶解。n解释各管发生的全部现象。解释各管发生的全部现象。提示：卵清蛋提示：卵清蛋白等电点白等电点4.7n实验结果与分析：实验结果与分析：按照实验报告要求记录实验结果并分析。按照实验报告要求记录实验结果并分析。n研讨：研讨：通过本次实验，有否对该项目改进的合理建议。通过本次实验，有否对该项目改进的合理建议。 解释盐析、有机溶剂、等电点、重金属、有机酸沉淀解释盐析、有

14、机溶剂、等电点、重金属、有机酸沉淀蛋白质的不同机理。蛋白质的不同机理。查阅资料，介绍蛋白质等电点的测定方法。查阅资料，介绍蛋白质等电点的测定方法。查阅资料，介绍查阅资料，介绍生物大分子制备常用的沉淀方法。生物大分子制备常用的沉淀方法。蛋白质变性有哪些方面的应用？蛋白质变性有哪些方面的应用？n大组总结交流（大组总结交流（PPT）：）：内容：内容：实验结果与分析，课后研讨题，实验体会等。实验结果与分析，课后研讨题，实验体会等。五、实验结果与报告五、实验结果与报告实验结果实验结果管号管号 pH值值混浊度混浊度 解释现象解释现象1234（一）酪蛋白等电点的测定（一）酪蛋白等电点的测定（二）蛋白质沉淀实验（二）蛋白质沉淀实验 1蛋白质的盐析蛋白质的盐析 现现 象象 解解 释释蛋白质溶液中蛋白质溶液中加硫酸铵溶液加硫酸铵溶液加水加水上清液中加硫上清液中加硫酸铵粉末酸铵粉末加水加水2重金属离子沉淀蛋白质重金属离子沉淀蛋白质 现现 象象解解 释释蛋白质溶液蛋白质溶液中