第三章固定化酶及反应动力学ppt课件

1、北京理工大学北京理工大学 生命学院生命学院孙立权孙立权第三章第三章 固定化酶催化反响过程动力学固定化酶催化反响过程动力学概述概述固定化后酶性量变化及动力学影响要固定化后酶性量变化及动力学影响要素素外分散限制效应外分散限制效应内分散限制效应内分散限制效应分散影响下的表观动力学参数分散影响下的表观动力学参数内 容酶运用过程中的一些缺乏酶运用过程中的一些缺乏l酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶、淀粉酶、TaqTaq酶等；和酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的胃蛋白酶等可以耐受较低的pHpH条件以外，大多数的酶在高温

2、、强酸、条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界要素影响下，都容易变性失活。强碱和重金属离子等外界要素影响下，都容易变性失活。 l酶的一次性运用：酶普通都是在溶液中与底物反响，这样酶在反响系酶的一次性运用：酶普通都是在溶液中与底物反响，这样酶在反响系统中，与底物和产物混在一同，反响终了后，即使酶仍有很高的活力统中，与底物和产物混在一同，反响终了后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性运用酶的方式，不仅使消费本钱提高，也难于回收利用。这种一次性运用酶的方式，不仅使消费本钱提高，而且难于延续化消费。，而且难于延续化消费。 l产物的分别纯化较困难：酶反响后成为杂质与产物混

3、在一同，无疑给产物的分别纯化较困难：酶反响后成为杂质与产物混在一同，无疑给产物的进一步的分别纯化带来一定的困难。产物的进一步的分别纯化带来一定的困难。 固定化技术固定化技术什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶固定化酶固定化酶固定化技术固定化技术01 概 述固定化：将酶经过物理或化学方法固定在载体上或限制在一定空间内。固定化酶固定化酶immobilized enzyme亦称固相酶或水不溶酶。是用物理的或化学的亦称固相酶或水不溶酶。是用物理的或化学的方法使酶装变为在一定的空间内其运动遭到方法使酶装变为在一定的空间内其运动遭到完全约束，或遭到部

4、分约束的一种不溶于水完全约束，或遭到部分约束的一种不溶于水，但仍具有活性的酶。能以固相形状作用于，但仍具有活性的酶。能以固相形状作用于底物进展催化反响。底物进展催化反响。水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。固定化酶的研讨始于固定化酶的研讨始于19101910年，正式研讨于年，正式研讨于2020世纪世纪6060年代、年代、7070年代已在全世界普遍开展。年代已在全世界普遍开展。19531953年德国的年德国的 Grubhofer Grubhofer和和SchleithSchleith采用聚

5、氨基苯乙烯树脂采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。，制成固定化酶。6060年代后期，固定化技术迅速开展起来。年代后期，固定化技术迅速开展起来。19691969年，日本的年，日本的千烟一郎初次在工业上消费运用固定化氨基酰化酶从千烟一郎初次在工业上消费运用固定化氨基酰化酶从DL-DL-氨基酸延续消费氨基酸延续消费L-L-氨基酸，实现了酶运用史上的一大变革氨基酸，实现了酶运用史上的一大变革。在在19711971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的

6、一致英文称号为定化酶的一致英文称号为Immobilized enzymeImmobilized enzyme。随着固定化技术的开展，出现固定化菌体随着固定化技术的开展，出现固定化菌体 。19731973年，日年，日本初次在工业上运用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨本初次在工业上运用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸延续消费酸酶，由反丁烯二酸延续消费L-L-天门冬氨酸。天门冬氨酸。在固定化酶和固定化菌体的根底上，在固定化酶和固定化菌体的根底上，7070年代后期出现了年代后期出现了固定化细胞技术。固定化细胞技术。 1976 1976年，法国初次用固定化酵母细胞年，法国初次用固定化酵母细

7、胞消费啤酒和酒精，消费啤酒和酒精，19781978年日本用固定化枯草杆菌消费淀年日本用固定化枯草杆菌消费淀粉酶，开场了用固定化细胞消费酶的先例。粉酶，开场了用固定化细胞消费酶的先例。19821982年，日本初次研讨用固定化原生质体消费谷氨酸，年，日本初次研讨用固定化原生质体消费谷氨酸，获得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的妨碍，获得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的妨碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶消费技术道路的更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶消费技术道路的变革提供了新的方向。变革提供了新的方向。与游离酶相比与游离酶相比, ,固定化酶在坚持其高效专注及温暖的酶催化固定化酶在坚持

8、其高效专注及温暖的酶催化反响特性的同时反响特性的同时, ,又抑制了游离酶的缺乏之处又抑制了游离酶的缺乏之处, ,呈现储存稳呈现储存稳定性高、分别回收容易、可多次反复运用、操作延续可控定性高、分别回收容易、可多次反复运用、操作延续可控、工艺简便等一系列优点。、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研讨异常活泼学等学科领域的研讨异常活泼, ,得到迅速开展和广泛的运用得到迅速开展和广泛的运用, ,而且由于具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环而且由于具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而

9、符合可继续开展的战略要求。境效应而符合可继续开展的战略要求。 为什么固定化？易从反响系统分别，简化产物纯化过程。稳定性添加，不易失活具有一定外形和机械强度，可以装填于反响器固定床反响器可延续消费，过程易控制。简化了提取工艺，添加产物收率，提高产质量量更适宜多酶反响酶运用效率提高，产品本钱降低存在问题(1)制备困难，活性降低(2) 添加了载体本钱费及固定化操作费用；(3) 增大了颗粒分散阻力，使反响速度下降。 固定化细胞01 概 述固定化细胞固定化细胞 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。 特点： 1. 无需进展酶的分别和纯化。

10、 2. 细胞本身含有多酶体系，可催化一系列反响。 3. 酶的辅助因子可以再生，稳定性高。 4. 坚持酶的原始形状，酶的回收率高。 5. 抗污染才干强。01 概 述工业规模的酶固定化方法应具备的条件：(1) 载体价廉、固定化费用低； (2) 能反复利用，即对非一次性固定化酶，其载体要求能再生；(3) 固定化收率高、制备简便、而且结合力强；(4) 载体的机械强度高；(5) 物理及化学性质稳定，运用于食品加工时要平安无毒01 概 述固定化酶制备方法固定化酶制备方法01 概 述l吸附载体结合法：物理吸附(活性碳，硅胶等)，离子结合离子交换剂和离子交换树脂，共价结合。作用力加强，对酶影响加大。l交联法：

11、利用多功能试剂使酶间交联异氰酸酯，联苯胺，构成共价键。l包埋法：包埋于高分子凝胶网格网格型，高分子半透膜微囊型医学运用多化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇延续延续酶的固定化技术和固定化酶01 概 述l活性中心：维护酶的催化作用，并使酶的活性中心的活性中心：维护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级构造不遭到损害，在制备固定氨基酸基团固有的高级构造不遭到损害，在制备固定化酶时，需求在非常严密的条件下进展。化酶时，需求在非常严密的条件下进展。l功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的

12、酚基、丝氨酸和苏氨酸的组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合不参与酶的固定化结合l酶的高级构造：要防止用高温、强酸、强碱等处置，酶的高级构造：要防止用高温、强酸、强碱等处置，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温暖的条件下进展。此，操作应尽量在非常温暖的条件下进展。固定化酶操作的本卷须知固定化酶操作的本卷须知1 吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。物理吸附法: 经过氢键、疏水作用和电子亲和力等

13、物理作用，将酶固定于水不溶载体上从而制成固定化酶。常用的载体有：有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用纤维素作为吸附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体外表构成单分子层，吸附蛋白才干约70mg/cm2。无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。比如用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的alpha-淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45进展固定化，用高浓度的底物进展延续反响。半衰期分别为14、35、60d。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易零落。固定化酶制备方法固定化酶制备方法01 概 述l吸附载体结合法：物理吸附(

14、活性碳，硅胶等)，离子结合离子交换剂和离子交换树脂，共价结合。作用力加强，对酶影响加大。l物理法固定酶的优点在于酶不参与化学反响，整体构造坚持不变，酶的催化活性得到很好保管。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体妨碍作用，因此对一些反响不适用。l(2)离子交换吸附法: 这是将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而到达固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类ECTEDLA-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、410、900等。阳离子交换剂，如羧

15、甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC50、IR200、Dowex50等。uDEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀用0.5mol/LNa0H和水洗涤后，参与pH7.07.5的米曲霉-粗酶液(水解乙酰DL-Ala活力为25umol/m1h)充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4备用。固定化酶活力回收50-60，水解乙酰DLA1a活力为600-800umol/gh湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于DEAE纤维素。 u此外，D

16、EAE纤维素吸附的淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。 经过酶蛋白化学修饰来添加蛋白质分子上电荷。能有效的抑制吸附法制备的固定化酶在运用过程的解吸。用水溶性乙烯顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE纤维素和DEAEScphadex载体有效的固定。这种固定几乎是不可逆的吸附。此外酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关。pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(1-2pH单位)吸附将明显减少，但也有个别例外。盐对吸附的影响较为复杂在一些特殊事例中、盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。对蛋白质吸附来

17、说，随温度的升高吸附下降。载体的外表积、多孔性及其顶处置都影响对酶的吸附。 吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同外形的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在运用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用。但由于有些机理不十清楚了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于吸附法制备的固定化酶易零落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性。共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反响基团经过化学价键构成不可逆的衔接的方法。在温暖的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。常用的载体包括天然

18、高分子纤维素、琼脂糖、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物，合成高分子(聚酰胺、聚丙烯酰胺、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等)和无机支持物多孔玻璃、金属氧化物等。共价结合法制备的固定化酶，酶和载体的衔接键结合结实，运用寿命长，但制备过程中酶直接参与化学反响，经常引起酶蛋白质的构造发生变化，导致酶活力的下降，往往需求严厉控制操作条件才干获得活力较高的固定化酶。(1) 酶分子和载体衔接的功能基团 从实际上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：酶蛋白N端的M氨基或赖氨酸残基的-氨基。酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的-羧基和Glu残基-羧基。Cys残基的巯基。Ser、Tyr、Thr残基的羟基。Phe和Tyr

19、残基的苯环。His残基的咪唑基。Trp残基的吲哚基。 在实践中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否那么将导致酶失去活性。(2)载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和构成。对载体的普通要求是:普通亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定 性上都优于疏水载体。载体构造疏松，外表积大，有一定的机械强度。载体必需有在温暖条件与酶共价结合的功能基团。载休没有或很少有非专注性吸附。载体来源容易便便并能反复运用。 (3)偶联反响 酶和载体的衔接反响取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在非常温暖的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进展。

20、现已有许多种偶联反响都能制备固定化酶。这些方法在实践运用中经济意义起着决议性作用，必需思索到酶的偶联效率固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的本钱等要素。现引见如下：重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处置成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH89)条件下与酶蛋青丝生偶联反响，得到固定化酶。 能够与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N端氨基或Lys的氨基构成双偶氮化合物。常用载体及其反响如下：a.多糖类的芳香族氨基衍生物。我国独创的运用对-硫酸脂乙砜基胺(ABSE)多糖(纤维素，葡聚糖，文联琼脂糖，交联琼脂及淀粉)属于此类

21、载体。在碱性条件下用对硫酸脂乙砜基胺话化多糖，制得的醚键衔接的乙砜基苯胺衍生物，经重氮化后偶联酶：b.氮基酸共聚体。如LLeu和对氨基DL苯丙氨酸共聚物：待1mol/L的LLeu和对氨基DLPhe的N羧基酐的苯溶液在少量水存在及室温下进展反响制成。共聚物与亚硝酸作用转变为重氮盐，可供酶固定用。用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。c.聚丙烯酰胺衍生物。该类衍生物的商品称号为bioGel或Enzacry。如EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，经重氮化可固定酶。用此法制备的有氨基酰化酶，淀粉酶等固定化酶。d.苯乙酰树脂。这是聚氨基苯乙烯(a)和一种异丁烯一间一氨基苯乙

22、烯(b)的共聚物，经过重氮化后可固定酶如胃蛋白酶、核糖核酸酶等。e.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。 玻璃的化学改造物多孔玻璃在丙酮中与Y氨基丙基三氧乙烷硅回流加热，生成烷基胺玻璃:烷基氨玻璃用对硝基苯酚氯处置后，再复原，转变为芳香基衍生物:此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合产生固定化酶。 芳香烃化反响 具有卤素取代的芳香环或含有卤素取代的杂环的高聚物以及含有卤乙酰基的高聚物，可以经过烷基化、芳香基化，在碱性条件下，与酶分子上的氨基、酚基、巯基等反响，如： a.将纤维素在二恶烷(Diaxanc)-溴乙酸中与嗅乙酰溴反响，构成溴乙酰纤维素，可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化：常用载休有卤乙酰、卤

23、异丁烯衍生物，如氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维索、碘乙酰纤维素等。b.纤维素等载体在碱性条件下和均三氯三嗪等反响，引入活泼的卤素基后，能与酶的氨基、酚羟基、巯基反响，产生固定化酶。 与纤维素共价结合的另一类芳香烃化功能基是3-F-4，6-二硝基苯。控制pH7，使它勺酶分子的氨基反响，产生固定化酶。c.四元缩合反响 利用四元化合物(羧酸、胺、醛和异氰酸)发生缩合反响，构成N取代的酰胺。在反响中，羧酸(R1)和胺化合物(R2)构成酰胺键，醛(R3)和异氰酸(R4)结合构成酰胺氮的侧链： 中选择适当条件，适当的载体及控制反响液中的添加物，可以使衔接键或经过酶的氨基或经过羧基，将酶固定并免除有害反响。例如：

24、在乙醛和小分子的3(二甲氨基)丙基异氰酸存在下，用0.5mol/L HCl维持pH6.5，搅拌反响6h，用带氨基的聚合物，可以与酶分子的羧基偶联。而带COOH的高聚物在醛和异氰酸存在下，可与酶分子的NH2偶联。 d.巯基二硫基交换反响 带有SH或二硫基的载体，经过巯基二硫基的交换反响，和酶分子上非必需巯基偶联。假设载体的功能基团为SH时，可先用2，2二吡啶二硫化物处置，生成的二硫基中间产物在酸性条件下能与酶分子的巯基发生交换反响，从而产生固定化酶。此法经过小分子巯基化合物的运转，使载体可以再生：e.金属偶联法 利用某些过渡金属盐溶液将载体(纤维素、尼龙、硼硅玻璃、滤纸及酵母细胞等)浸泡24h，

25、洗除末反响的金属盐后，制得的活化载体放入酶溶液中，即可将酶固定化。如： f.缩合反响 一些带羧基或氨基的载体用羰二亚胺活化后，与酶分子的氨基或羧基直接偶联，构成肽键，产生固定化酶。般在弱酸条件下(pH4.755)将酶、羰二亚胺、载体同时混合，羰二亚胺与载体的羧基反响生成活泼的O乙酰异脲衍生物，与酶分子的氨基缩合成肽键或者重排为酰基脲。 例如以丙烯酰胺和丙烯酸共聚物为载体用缩合法制备固定化胰蛋白酶。0.95g丙烯酸用3mol/L NaOH调pH6.5，参与1.95g丙烯酰胺和0.1g N，N甲叉双丙烯酰胺，再参与0.1mol/L pH6.5磷酸缓冲液，使体积为10m1，参与25mg过硫酸铵和22

26、ulN，N，N，N，N四甲基乙二胺，抽真空除气泡，4聚合30min，压挤成粒，搅拌下水洗丙酮枯燥备用。 70g干胶在20m10.5mol/L HCl中搅拌30min，用水和 O.1mol/L pH 6.5磷酸缓冲液洗涤后转至小烧杯，参与3.5ml 0.1mol/L pH65磷酸缓冲液的8.75mg胶原蛋白酶后，搅拌5min，接着加1环己基3(2吗啉乙基)羰二亚胺甲基对甲苯磺酸，延续搅拌18h，洗涤后即为固定化酶。g.叠氮反响 带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处置使之酯化，再用水合肼处置构成酰肼，最后在HNO3作用下转变成叠氮衍生物。此衍生物在低温下可与酶蛋白的羟基、酚基或

27、巯基等反响，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与一NH2反响。 此法常用载体有羧甲基纤维素、CMSephadex、聚天冬氨酸、BioGel100、乙烯顺丁烯二酸酐共聚物、Amberlite IRC50等。叠氮法用途较广，举例如下： 以CM一纤维素(CMC)叠氮衍生物为载体固定化胰蛋白酶。首先，载体的酯化与肼解：CMC依次用水、乙醇和乙醚洗涤，枯燥后，悬于无水甲醇，在冰浴冷却下通入HCl气体，使之饱和。室温下过夜，并反复此过程(甲酯化)。然后用甲醇、乙醚充分洗涤，并空气枯燥。将产物悬于甲醇中，参与80水合肼，回流1h。放置过夜，过滤，再用甲醇洗涤，枯燥。其次为偶联：1g CMC酰肼和150m1 2

28、HCl在冰浴中混合，搅拌下滴加9ml %3 NaNa2，冰水浴中搅拌20min。离心弃去上清液。沉淀用150m1二氧氯环洗涤再用150m1冷的蒸馏水洗涤二次，并且悬于预冷的10ml 0.05mol/L pH87磷酸缓冲液的胰蛋白酶溶液中，5搅拌反响23h，用HCl凋PH4，冷0.001mol/L HCl洗三次，冷水洗一次，冻干，即为固定化酶。j.异硫氰酸反响 含有芳香氨基的载体，在碱性pH条件下，与光气或硫芥子气反响生成异硫氰酸或异琉氰酸衍生物，可在温暖条件下与酶分子的氨基衔接，产生固定化酶。 用含有酰基叠氮的载体在加热下与HClI反响，亦得到异硫氰酸衍生物亦可用于固定化酶。k.溴化氰亚胺碳酸

29、基反响 含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下，载体的羟基与CNBr反响，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。例如：用CNBr活化的琼脂糖固定化胰蛋白酶。将Sepharose 4B用蒸馏水洗净，含0.1g干物质的湿胶加5ml水和4ml现配溴化氰水溶液(25mg/m1)，搅拌下用2mol/LNaOH调pHll.0，2325反响6min，抽干立刻用300ml 0.1mol/L NaHCO3洗净, (58min内完成)。活化的载体用0.025mol/L pH10.2含0.02mol/L CaCl2硼酸缓冲液液快速淋洗后，用5m1缓冲液转入烧杯内加1

30、6mg结晶胰蛋白酶，搅拌4h，用0.1mol/L pH8.5硼酸缓冲液(内含1mol/L NaCl)洗涤后，复用pH4.1的醋酸缓冲液洗涤，便制成了固定化胰蛋白酶。 酰氯化反响 含羧基载体如羧基树脂(Amberlite IRC50等)，可用氯化亚砜处置，生成酰氯衍生物，与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。 m酸酐反响 乙烯或苯乙烯、甲代乙烯基与顺丁烯二酸酐的共聚物，在己二胺作用下，酸酐与酶蛋白的氨基起偶联反响，产生固定化酶。n活化酯法 含羧基的共聚物载体在二环己基碳二亚胺(DDC)存在下用N羟基琥珀酰亚胺活化，产生活化酯，再在温暖条件下衔接酶。n.含醛基高聚物 多糖类如淀粉、葡聚糖、纤维素等用高

31、碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，构成含醛基(每葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可与酶蛋白氨基反响，产生固定化酶。例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶。载体制备：60g甘蔗渣纤维素浸于500ml 0.6NaOH溶液中85处置30min，水洗至中性，抽干。悬浮于NaI04溶液中，空温下搅拌12h，用水反复冲洗、抽干。置于IL脲溶液中，搅拌。产物用水反复洗涤，抽干后，置于12甲醛溶液中搅拌处置12h，用水洗涤，除去过量甲醛，反响过程如下：加酶固定:上述载体1g参与1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液配制)搅拌下48固定18h后，用PH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液

32、(合0.4mol/LNaCl)洗去多余酶液，抽干，即为固定化酶。交联法交联法 这是利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进展交联反响，以制备固定化酶的力法。最常用的交联试剂是戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮联苯胺-2，2二磺酸、1，5二氟2，4二硝苯、己二酰二胺甲脂等。用戊二醛交联制备固定化酶的反响如下： 交联法有以下方法： (1) 交联酶法 在一定条件下，参与一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。这种反响与酶和试剂浓度、溶液PH和离子强度、温度、反响时间均有一定的关系。如木瓜蛋白酶在0.2酶蛋白浓度、2.3戊二醛、pH5.27.2、0下交联24h，可构成

33、固定化酶。其中，FH的影响L清楚显，随pH升高，闭定化速度添加5pH低于4不能构成固定化酶。其中，pH的影响非常显著，随pH升高，固定化速度添加；pH低于4不能构成固定化酶。有人以为pH应控制在酶的等电点附近有利于固定化。在交联时，参与一定量中性盐如Na2SO4、NH4)2SO4等和丙酮等有机溶剂有助于构成固定化酶。温度也有一定影响如木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0长时间反响，只得可溶性固定化酶，假设在室温下0一5h，即可构成不溶性固定化酶。这种情况对不同酶能够有不同结果。 这种方法也用于制备交联的结晶酶。交结合晶酶仍具有一定酶活力。 例如：将500mg酶溶于5m1 0.2mol/L pH6

34、醋酸缓冲液中，在搅拌下滴加2m1 2.5戊二醛，在室温下放置1030min，会有沉淀析出，13h内反响结柬。构成的凝胶切碎后水洗，除多余戊二醛，即为固定化酶。(2)酶与辅助蛋白交联法 用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联从而制备固定化酶由于酶在交联反响过程中因化学修饰而引起失活，或因可得到的酶量有限时，因此，通常以一些辅助蛋白，如牛血洁白蛋白、明胶、胶原、抗体等，与酶一同进展交联。 例如：10mg脲酶与2.5ml含6白蛋自、0.2戊二醛的0.02mol/L pH8磷酸缓冲液混合，冷到30后，冉升温至4 下,放置4h将构成的泡沫聚合物彻底洗除后，冻干，即为固定化脲酶。(3)载体交联法 是用多

35、或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法。例如：尼龙固定化木瓜蛋白酶的制备：尼龙布用含18.6CaC12和18.6水的甲醇溶液处置10min，洗净吸干，于3.65mol/LHCl中45水浴中水解45min，水洗至中性，吸干，用5戊二醛溶液(0.2mol/L pH8.5硼酸缓冲液配制)，于20搅拌交联20min，用PH7.8 0.1mol/L磷酸缓冲液洗去多余戊二醛。2g处置载体(尼龙)参与4ml酶溶液(1mg/ml于45下固定3h后，用0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液(内含0.5mol/LNaCl)洗涤，除去多余酶液，抽干，即为固定化木瓜蛋

36、白酶。 单用戊二醛等试剂文联制备的固定化酶活力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合运用，可以到达既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。 壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶制备。壳聚糖微球制备：4g壳聚糖洛于100m12醋酸溶液，在搅拌下缓慢滴人烧杯中的透平油(酸性胶与透平油的比例为1：3)中，技4：35：1比例参与25戊二醛溶液，再用1mol/L NaOH溶液调pH910，置水浴(60一70)中3h，冷却后，弃去上层油液，依次用石油醚、丙酮、无水乙醇、水洗涤真空枯燥备用。 酶的固定化：0.5g载休于0.1mol/L pH7.2磷酸缓冲液浸泡24h，抽干，参与1.6mg/ml的木瓜蛋白酶溶液0.6mL，

37、48下吸附12h，滴入0.6戊二醛溶液3m1于48交联3h后弃去上层溶液，用0.1mol/L pH72磷酸缓冲液(含NaCl 0.5mol/L)洗多次，吸干水分，即得固定化酶。活力回收约60，在填充休反响器内延续水解酪蛋白(05)时半衰期为16d. 包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂(包括交联剂)的作用进展聚合，酶被包埋在聚合物中以到达固定化。包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未遭到化学反响，可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗酶制剂甚至完好的微生物细胞都是适用的。但是，只需小分子底物和产物可以经过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质分散的阻力导致固定

38、化酶动力学行为的变化、活力降低。包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。包埋法(1)凝胶包埋法 凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中。聚丙烯酰胺凝胶包埋法。普通的制备过程如下：将聚丙烯酰胺凝胶包埋法。普通的制备过程如下：将1ml溶溶于适当缓冲液的酶溶液参与含有于适当缓冲液的酶溶液参与含有750mg丙烯酰胺丙烯酰胺(单体单体)和和40mgN，N甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(交联剂交联剂)的的3ml溶液中，再加溶液中，再加0.5ml 15的二甲氨基丙腈的二甲氨基丙腈(加速剂加速剂)，同时，参与，同时，参与1过硫酸过硫酸钾钾(引发剂引发剂)，混合，于，混合，于25T：保温：保温10min，便得含酶凝胶。将，

39、便得含酶凝胶。将凝胶粉碎，制得不规那么的颗粒于低温储存或冷冻枯燥。凝胶粉碎，制得不规那么的颗粒于低温储存或冷冻枯燥。为制得珠状固定化酶，可以在聚合反响开场时，立刻转入为制得珠状固定化酶，可以在聚合反响开场时，立刻转入到疏水相到疏水相(一种乳化剂，与水相有一样密度一种乳化剂，与水相有一样密度)的有机溶液中，的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。使分散成含酶的珠状凝胶。 聚丙烯酰胺包埋法的缺陷是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，假设调整交联剂浓度与交联程度可以得到抑制。辐射包埋法。酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或辐射包埋法。酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或纯聚合物溶液中在常温或低温下，

40、用纯聚合物溶液中在常温或低温下，用x射线、射线、Y射线或射线或电子束辐照。可得到包埋酶的亲水凝胶。如用电子束辐照。可得到包埋酶的亲水凝胶。如用X射线引发射线引发聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。1973年年HMaeda等等用聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶。运用弱水性或略微疏水用聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶。运用弱水性或略微疏水性的玻璃化载体，用低温过冷态的辐照聚和，可用于性的玻璃化载体，用低温过冷态的辐照聚和，可用于般生般生物物质的固定化。这些生物物质主要分布在载体外表层区域，物物质的固定化。这些生物物质主要分布在载体外表层区域，固定化产物外表具有生物活性，曾称

41、这种方法为粘附法。这固定化产物外表具有生物活性，曾称这种方法为粘附法。这种方法可粘附酶、叶绿素、病毒等，长期运用后仍有较高的种方法可粘附酶、叶绿素、病毒等，长期运用后仍有较高的活性。可以运用玻璃化单体，玻璃化单体和非玻璃化单体混活性。可以运用玻璃化单体，玻璃化单体和非玻璃化单体混合物、单体和天然聚合物的混合物为载体。合物、单体和天然聚合物的混合物为载体。其他凝胶包埋法。其他凝胶包埋法。 a.淀粉凝胶包埋法。将氨基甲酸乙酯的泡沫垫浸入温热淀粉凝胶包埋法。将氨基甲酸乙酯的泡沫垫浸入温热的淀粉溶液和乙酰胆碱脂酶的混合物中，再经冷却、枯燥，的淀粉溶液和乙酰胆碱脂酶的混合物中，再经冷却、枯燥，便制得固定

42、化乙酰胆碱脂酶。，为加强机械强度和重新水便制得固定化乙酰胆碱脂酶。，为加强机械强度和重新水合可参与合可参与定量的甘油。定量的甘油。b.胶原包埋法即大分子络合法。胶原有纤维性，易成膜，胶原包埋法即大分子络合法。胶原有纤维性，易成膜，能在生理能在生理pH下自发的聚焦成束，胶束末端可以经过多种下自发的聚焦成束，胶束末端可以经过多种次级键与酶分子相互作用，经过酶和胶原分子构成网架而次级键与酶分子相互作用，经过酶和胶原分子构成网架而将酶固定化。其制备方法极为简单：将酶加到胶原悬浮液将酶固定化。其制备方法极为简单：将酶加到胶原悬浮液中、铺膜、枯燥即得固定化酶。或者经过透析的酶和胶原中、铺膜、枯燥即得固定化

43、酶。或者经过透析的酶和胶原混合，插入电极，酶混合，插入电极，酶胶原复合物便在电极上沉淀。胶原复合物便在电极上沉淀。 c.卡拉胶包埋法：卡拉胶(KCarrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。详细方法：将100gx酶在3750溶于水中，又将1.7g卡拉胶在40一60溶于34ml生理盐水中，二者混合后冷全10，所成凝胶浸在0.3mol/L KCl 溶液中硬化，作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。 d.天然血纤维包埋法：血纤维不会引起抗体构成，且无毒。在柠檬酸缓冲液中使酶和血纤蛋白原及凝血酶混合、便制得血纤蛋白包埋的固定化酶。酶分子的氨基和血纤蛋白

44、的谷氨酰胺残基之间发生交联而将酶固定化。e.大豆蛋白包埋法。含葡萄糖异构酶的链霉菌菌株与大豆蛋白溶液混合，在60用碳酸镁处置使其凝结，过滤制球，枯燥后用戊二醛和六甲叉二胺处置，硬化从而制得固定化葡萄糖异构酶。 (2)微囊化法 此法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的零落，防止微囊外环境直接接触从而添加了酶的稳定性同时，小分子底物能经过膜与酶作用，产物经分散而输出。微囊普通直径约1100um，膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm，外表积与体积之比极大，物质能很快到达平衡，能有效的包埋许多种酶。同时、可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取物或细胞，不

45、同组成和含量的膜包裹组建成人工巧胞. 因此，此法在医疗上极为有用。例如固定化天门冬酰胺酶(治疗白血病)就是用这种方法制成的微胶囊。微胶囊的制备方法有4种。界面沉淀法。是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上界面沉淀法。是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而构成膜，溶解度极低而构成膜，从而将酶包埋的方法。如，含有高浓度血红蛋白的酶溶液在从而将酶包埋的方法。如，含有高浓度血红蛋白的酶溶液在与水不互溶、沸点比水低的有机相中乳化，参与油溶性外表与水不互溶、沸点比水低的有机相中乳化，参与油溶性外表活性剂，构成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在活性剂，构成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高

46、聚物在搅拌下参与乳化液中，然后参与一种不溶解高聚物的有机溶搅拌下参与乳化液中，然后参与一种不溶解高聚物的有机溶剂使高聚物在油一水界面上沉淀构成膜，最后移于水相，剂使高聚物在油一水界面上沉淀构成膜，最后移于水相，从而制成固定化酶。作为高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和从而制成固定化酶。作为高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。如聚甲基丙烯酸甲酯等。如“人造细胞制备：人造细胞制备：25ml 10%血血红蛋白水溶液红蛋白水溶液(内含适当酶、内含适当酶、界面聚合法。界面聚合法是将疏水性和亲水性单体在界面进界面聚合法。界面聚合法是将疏水性和亲水性单体在界面进展聚合，构成半透膜展聚合，构成半透膜,

47、使酶包埋于半透膜微囊中。此法曾用来制使酶包埋于半透膜微囊中。此法曾用来制备备Asn酶、脲酶等。制备方法普通是：将酶水溶液与亲水单体酶、脲酶等。制备方法普通是：将酶水溶液与亲水单体(如乙二醇如乙二醇)用一种水不溶混的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同用一种水不溶混的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一有机溶剂疏水单体一有机溶剂疏水单体(如多异氰酸如多异氰酸)溶液在搅拌下参与到上述乳化溶液在搅拌下参与到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有机溶剂之间的界面发生聚合化液，便在乳化液中的水相和有机溶剂之间的界面发生聚合化 这样水相中酶便包埋在聚合体(聚脲)膜内。例如用含酶的10血红蛋白水溶液与己甲叉二胺的水溶液混

48、合，立刻在1Span85的氯仿-环已烷中分散乳化,加人癸二酰氯(有机相)后，便在油-水界面发生聚合反响，弃除上清液，参与Tween-20去乳化,洗除有机溶剂，除去未聚合单体后，转入水相，制得固定化酶。液体枯燥法。此法曾用乙基纤维素和聚苯乙烯包埋过氧化氢酶、脂肪酶等。它是将一种聚合物溶于一种沸点比水低，且与水不混溶的溶剂中参与酶液后，参与油溶性表面活性剂为乳化剂使之乳化。再把它分散于含有维护性胶质如明胶、聚丙烯醇和外表活性剂的水溶液中，第二次乳化.在不断搅拌下，低温真空除去有机溶剂，便得含酶微囊。常用聚合体有乙基纤维素、聚苯乙烯、氯橡皮等，有机溶剂有苯、环己烷和氯仿。红血球包埋法。在高渗溶液中红

49、细胞膨胀伸展后，细胞红血球包埋法。在高渗溶液中红细胞膨胀伸展后，细胞内血红蛋白漏出，同时胞外蛋白也能分散进红血球再放内血红蛋白漏出，同时胞外蛋白也能分散进红血球再放进等渗溶液中，红血球膜又回复至正常形状和透性，进入进等渗溶液中，红血球膜又回复至正常形状和透性，进入的酶不会漏出来的酶不会漏出来.脂质休包埋法。上述微囊法是一种半透性膜将酶包埋，近脂质休包埋法。上述微囊法是一种半透性膜将酶包埋，近年来采用双层脂质体构成极细球粒包埋酶。例如将卵磷脂、年来采用双层脂质体构成极细球粒包埋酶。例如将卵磷脂、胆甾醇和二鲸腊磷酯按胆甾醇和二鲸腊磷酯按7：2：1溶于氯仿中再参与酶液，溶于氯仿中再参与酶液，混合物在

50、旋转蒸发器中，在氮气下混合物在旋转蒸发器中，在氮气下32转动乳化，然后在室转动乳化，然后在室温下坚持温下坚持2h，再在氮气气流中，再在氮气气流中4用音波处置用音波处置10s，在室温，在室温下坚持下坚持2h，过，过Sepharose 6B柱，搜集脂质体，离心分别脂质柱，搜集脂质体，离心分别脂质体，所得球粒悬浮于缓冲液中，继续音波处置，并过体，所得球粒悬浮于缓冲液中，继续音波处置，并过Sepharose 6B柱，可得含酶的微囊。这种微囊液膜当底物产柱，可得含酶的微囊。这种微囊液膜当底物产物穿过时、与膜的径无关但与产物或底物对膜成分的溶解物穿过时、与膜的径无关但与产物或底物对膜成分的溶解度有关。度有

51、关。脂质体包裹脂质体包裹固定化酶制备方法固定化酶制备方法01 概 述l吸附载体结合法：物理吸附(活性碳，硅胶等)，离子结合离子交换剂和离子交换树脂，共价结合。作用力加强，对酶影响加大。l物理法固定酶的优点在于酶不参与化学反响，整体构造坚持不变，酶的催化活性得到很好保管。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体妨碍作用，因此对一些反响不适用。l化学法是将酶经过化学键衔接到天然的或合成的高分子载体上,运用偶联剂经过酶外表的基团将酶交联起来,而构成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.01 概 述酶固定化方法01 概 述CharacteristicCarrier Binding Methods

52、Cross-linking MethodEntrapping MethodPhysical adsorptionIonic Binding Covalent BindingPreparationEasyEasyDifficultDifficultDifficultEnzyme ActivityLowHighHighModerateHighSubstrate SpecificityUnchangeableUnchangeableChangeableChangeableUnchangeableBinding ForceWeakModerateStrongStrongStrongRegenerati

53、onPossiblePossibleImpossibleImpossibleImpossibleGeneral ApplicationLowModerateModerateLowHighCost of ImmobilizationLowLowHighModerateLowComparison of the Characteristics of Different Methods of Enzyme Immobilization固定化酶在工业消费上的运用乙酰乙酰 -(DL)- Ala L - Ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -D - AlaAminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶固定化

54、酶的运用固定化酶的运用01 概 述世界上第一种工业化消费的固定化酶。世界上第一种工业化消费的固定化酶。19691969年，年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分别得到日本田边制药公司将从米曲霉中提取分别得到的氨基酰化酶，用的氨基酰化酶，用DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶为载体经葡聚糖凝胶为载体经过离子键结合法制成固定化酶，将过离子键结合法制成固定化酶，将L-L-乙酰氨基乙酰氨基酸水解生成酸水解生成L-L-氨基酸，用来拆分氨基酸，用来拆分DL-DL-乙酰氨基乙酰氨基酸，延续消费酸，延续消费L-L-氨基酸。剩余的氨基酸。剩余的D-D-乙酰氨基酸乙酰氨基酸经过消旋化，生成经过消旋化，生成DL-DL-乙

55、酰氨基酸，再进展拆乙酰氨基酸，再进展拆分。消费本钱仅为用游离酶消费本钱的分。消费本钱仅为用游离酶消费本钱的6060左左右。右。 泵泵储罐反响产物离心机离心机消消旋旋反反响响器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala固定化酶在工业消费上的运用固定化酶的运用固定化酶的运用01 概 述高果糖浆的消费高果糖浆的消费淀粉液化液淀粉酶糖化酶糖化液喷雾干燥氢化还原结晶异构酶粉状葡萄糖山梨醇结晶葡萄糖果葡糖浆果糖42%葡萄糖55%低聚糖分离混合高果糖浆果糖浆果糖80-90%果糖55%葡萄糖39%低聚糖世界上消费规模最大的一种固定化酶。将培育好的含葡萄糖异构酶的放线

56、菌细胞用6065热处置15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于延续消费果葡糖浆。 青霉素酰化酶转化流程图青霉素酰化酶转化流程图酶传感器酶传感器l酶传感器是由固定化酶与传感元件两部分组成的，其中酶是与适当的载体结合构成的不溶于水的固定化酶膜。l最常用的酶传感器是酶电极，即将固定化酶膜与转换电极做在一同，当酶膜与被测物发生催化反响而生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。酶电极酶电极l酶电极是由固定化酶与各种电极亲密结合的传感安装。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶电极并把它用于葡萄糖的定

57、量分析。l酶电极普通可根据电极检测物理量的不同分为电流型和电压型，前者普通有氧电极、H2O2电极等，后者有NH3、CO2、H2电极等。l较典型的一种酶电极为葡萄糖酶电极。 葡萄糖电极 半透膜酶胶层感应电极酶电极表示图D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5内酯H2O固定化酶的运用固定化酶的运用01 概 述葡萄糖醌H2O葡萄糖酸氢醌葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶氢醌 醌2H2ePt铂电极固定化酶的运用固定化酶的运用01 概 述2脲电极Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲酶产生的2NH4+为阳离子电极感应。此外还有：氨基酸电极醇电极尿酸电极乳酸电极青霉素电极亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸复原酶产生NH3固

58、定化酶的运固定化酶的运用用01 概 述一些常见的酶电极一些常见的酶电极底 物酶电 极5腺苷酸5腺苷酸脱氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脱氢酶Pt过氧化物过氧化氢酶Pt (O2)磷酸葡萄硫酸酯酶+葡萄糖氧化酶Pt (O2)D-氨基酸D氨基酸氧化酶NH4+L-氨基酸L氨基酸氧化酶NH3蔗糖蔗糖酶+葡萄糖氧化酶Pt (H2O2)琥珀酸琥珀酸脱氢酶Pt (O2)硫酸酯芳基硫酸酯酶Pt硫氰酸硫氰酸酶CN硝酸盐硝酸盐还原酶/ 亚硝酸盐还原酶NH4+亚硝酸盐亚硝酸盐还原酶NH3（气体）草酸草酸脱羧酶CO2（气体）青霉素青霉素酶pH乳酸乳酸脱氢酶；细胞色素bPt，Fe（CN）-4L氨基酸脱羧酶CO2L精氨酸精氨酸酶N

59、H4+L天冬酰胺天冬酰胺酶NH4+固定化酶催化反响过程动力学固定化酶催化反响过程动力学概述概述固定化后酶性量变化及动力学影响要固定化后酶性量变化及动力学影响要素素外分散限制效应外分散限制效应内分散限制效应内分散限制效应分散影响下的表观动力学参数分散影响下的表观动力学参数评价固定化酶的目的：评价固定化酶的目的：l1 酶活定义酶活定义IU)：在特定条件下，每一分钟催化：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活个酶活单位。单位。l 计量单位计量单位l2. 酶比活定义游离：每毫克酶蛋白或酶酶比活定义游离：每毫克酶蛋白或酶RNADNA)所

60、具有的酶活力单位所具有的酶活力单位l 质量的表达质量的表达评价固定化酶的目的：评价固定化酶的目的：l1. 固定化酶的比活：每克干固定化酶所具有的酶活固定化酶的比活：每克干固定化酶所具有的酶活力单位。力单位。 或：单位面积或：单位面积cm2的酶活力的酶活力单位表示酶膜、酶管、酶板。单位表示酶膜、酶管、酶板。l2. 操作半衰期：衡量稳定性的目的。操作半衰期：衡量稳定性的目的。l 延续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所延续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需求的时间需求的时间t1/2l酶活力表现率：实测固定化酶总活力与被固定化了的酶酶活力表现率：实测固定化酶总活力与被固定化了的酶在溶