生物化学复习-蛋白质3-5-1-7

1、第六节、蛋白质分子结构与功能的关系第六节、蛋白质分子结构与功能的关系 蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。定的化学结构，还需要一定的空间构象。一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系（一）同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化（一）同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化 蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在

2、亲缘关系上的远近。关系上的远近。同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。如功能的蛋白质称同源蛋白质。如血红蛋白在血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分组分 。 同源蛋白质的特点：同源蛋白质的特点： A.不同种属来源的同源蛋白质具有相同长度不同种属来源的同源蛋白质具有相同长度或接近相同长度的多肽链。或接近相同长度的多肽链。B.顺序同源现象：同源蛋白质的氨基酸序列具顺序同源现象：同源蛋白质的氨基酸序列具有明

3、显的相似性，这种相似性称序列同源性，有明显的相似性，这种相似性称序列同源性，或顺序同源现象。或顺序同源现象。lC.不变残基和可变残基：不变残基和可变残基：l同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基不变残基，不变残基高度保守，是必需的。不变残基高度保守，是必需的。l除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称种属有很大变化，称可变残基可变残基，可变残基中，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能

4、。 l通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，同源蛋白质的氨基酸顺序差异就越大越远，同源蛋白质的氨基酸顺序差异就越大l25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。l60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。l亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。l亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。l物种的亲缘关系越近，物种的亲缘关系越近，细胞色素细胞色素c的一级结构越的一级结构越相似，据此可绘制系统相似，据此可绘制系统进化树，进行系统进化进化树，进行系统进化分析分析2. 胰岛素胰

5、岛素 不同生物的胰岛素不同生物的胰岛素AA序列中，有序列中，有24个氨基酸个氨基酸残基位置始终不变，残基位置始终不变，A, B链上链上6个个Cys 不变不变（重要性），其余（重要性），其余18 个氨基酸多数为个氨基酸多数为非极非极性侧链性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。用。其它氨基酸其它氨基酸 对稳定蛋白质的空间结构作用不大，对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。尿病。 （二）（二）蛋白质一级结构的个体差

6、异蛋白质一级结构的个体差异分子病分子病 基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。失。镰状细胞贫血（镰状细胞贫血（sick-cell anemia）是最早被）是最早被认识的一种分子病。它是由于基因突变导致血红认识的一种分子病。它是由于基因突变导致血红蛋白分子中氨基酸残基被更换所造成的。蛋白分子中氨基酸残基被更换所造成的。-链链 1 2 3 4 5 6 7 8Hb-A Val-His-Leu-Th

7、r-Pro-Glu-Glu-LysHb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys从患者红从患者红细胞中鉴细胞中鉴定出特异定出特异的镰刀型的镰刀型或月牙型或月牙型细胞。细胞。正常红细胞正常红细胞镰刀状红细胞镰刀状红细胞（三）一级结构的部分切除与蛋白质（三）一级结构的部分切除与蛋白质的激活的激活 一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原

8、、激素前体等。酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。胰岛素原的激活胰岛素原的激活 胰岛素在胰岛的胰岛素在胰岛的细胞内质网的核糖体上细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原在合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被肽被信号肽酶信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运至高尔切除，生成胰岛素原，被运至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除C C肽，肽，得到活性胰岛素。得到活性胰岛素。 二、二、 蛋白质构象与功能的关系蛋白质构象与功能的关系别（变）构现象：别（变）

9、构现象：蛋白质与配体结合改变蛋白蛋白质与配体结合改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质生物学活性的现象。质的构象，进而改变蛋白质生物学活性的现象。别构蛋白多是寡聚蛋白。因别构而产生的效应别构蛋白多是寡聚蛋白。因别构而产生的效应称称别构效应别构效应。在蛋白质与其他分子的相互作用中，能被它可在蛋白质与其他分子的相互作用中，能被它可逆结合的其他分子称为逆结合的其他分子称为配体配体。1. 肌红蛋白的三级结构由一条多肽链和一个辅基血红素构成，Mr为16.6KD，153个氨基酸残基。Kendrew J及其同事于1963年完成肌红蛋白的X-晶体学分析，最终分辨率为0.14nml肌红蛋白- 血红蛋白家族中铁是由称为

10、原卟啉 （protoporphyrin ）的有机分子固定的。l原卟啉由4个吡咯环l原卟啉 只有结合亚铁态铁才能结合氧氧合肌红蛋白中血红素铁离子的6个配体l4个是卟啉环中央的4个N原子，第5个是环面上方的His93（F8），第6个是下方的O2肌红蛋白在进化中形成的多肽微环肌红蛋白在进化中形成的多肽微环境至少有三个作用：境至少有三个作用：固定血红素基；保护血红素铁免遭氧化；固定血红素基；保护血红素铁免遭氧化；为为O2分子提供一个合适的结合部位分子提供一个合适的结合部位l铁原子的位置与卟啉环平面的关系发生关键性改变去氧肌红蛋白中Fe（II）离子有5个配位体，位于离卟啉环平面上方（HisF8一侧）0.

11、055nm处。与O2结合时， Fe（II）离子离卟啉环平面只有0.026nm.是血红蛋白具有别构性质的基本原因His64(E7)MbO2Mb+O2K = MbO2 / MbO2 (1)Y=MbO2/Mb+MbO2 (2)Y=O2 / O2+K将（1）改写为： MbO2 = MbO2 / K 并代入（2）得： l当当Y=1Y=1时，所有肌红蛋白的氧合位置均被占据，即肌红蛋白时，所有肌红蛋白的氧合位置均被占据，即肌红蛋白被氧饱和被氧饱和,K=0,K=0lY=0.5Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，时，肌红蛋白的一半被饱和，PO2=KPO2=K，解离常数，解离常数K K称为称为P50P50， P(

12、O2)=K= P50或P0.5 P50定义为肌红蛋白一半被氧饱和时的氧分压 肌红蛋白的氧合曲线呈双曲线型，表明对肌红蛋白的氧合曲线呈双曲线型，表明对O2O2的亲和力较大，的亲和力较大， P50 为2torr2torr，适于储氧（线粒体，适于储氧（线粒体O2O2：0 010torr10torr；静脉血；静脉血15torr15torr或更高）。或更高）。 肌红蛋白也利于胞内的肌红蛋白也利于胞内的O2O2从内表面向线粒体的转运从内表面向线粒体的转运 ( (内表面内表面10torr, 80%10torr, 80%饱和饱和, ,线粒体线粒体 1 torr, 25% 1 torr, 25% 饱和饱和) )

13、LogY/(1-Y)=log p(O2) logKY=O2 / O2+K =p(O2)/p(O2)+KY K= p(O2) Y p(O2) = p(O2)(1Y)Y/ (1Y)= p(O2)/ Kl在从肺部经心脏到达外周组织的动脉血中Hb约为96氧饱和度。在回到心脏的静脉血中Hb仅为64氧饱和度。因此每100ml血经过组织约释放Hb携带的1/3氧或相当于大气压和体温下6.5ml氧气l血红蛋白的结构、氧合过程中的构象变化、氧结合曲线和别构效应（协同性）l 血红蛋白的构象（三维结构）MbHb Hb l两个二聚体的偏心枢轴旋移15并平移0.08nm 去氧血红蛋白氧合血红蛋白l近侧His（F8）与Fe

14、原子一起被拉动，Fe-N键变成垂直于血红素平面l共8个盐桥，氧合时伴盐桥断裂P (O2)/torr氧饱和分数（Y）P50=26torr肺泡中P(O2)工作肌肉毛细血管中P(O2)l由Y对P (O2)作图Y=P4(O2)P4(O2) + KP(O2)/torrY完全协同，n=4实验观察到亚基间结合氧时无相互作用l由此方程导出Y=P4(O2)P4(O2) + KYPn(O2)K=1Y两边取对数，得log(Y/(1-Y)=nlogP(O2)-logK对logP(O2)Y1Ylog(作图Hill系数是协同性程度的一种量度 n=1表示配体结合是非协同性的; n1表示配体结合是正协同性的; n1表示配体结

15、合是负协同性的。50% 饱和度时, logK=n(logP50) 或 K=(P50)n血红蛋白氧合协同性使它更有效的起着运输氧气的作用P (O2)/torr氧饱和分数（Y）P50=26torr肺泡中P(O2)工作肌肉毛细血管中P(O2)Y=0.97Y=0.25lH+、CO2和BPG在血红蛋白上都有各自的结合部位，这种在空间上相隔部位间的相互作用一种别构效应(1)、 H+和CO2促进O2的释放（Bohr效应）碳酸酐酶在红细胞中特别丰富 HbO2 + H+ +CO2 HbH+CO2 + O2 图6-17 在不同pH下Mb和Hb的氧饱和分数曲线氧饱和分数（Y）组织中血液中实验中P(O2)/torrl

16、反应是可逆的，产生的H+贡献于Bohr效应。氨基甲酸也可形成额外的盐桥，有助于稳定T态，促进氧的释放l正常人的红细胞约含有4.5mmol/L BPG，约与血红蛋白等摩尔数。Hb四聚体分子中只有一个BPG结合部位。位于四个亚基缔合形成的中央空穴内。而氧合血红蛋白（R态）中，中央空穴变得太小，容纳不了BPG，因为O2的结合引起构象变化，扰乱了BPG的结合部位。l可表示如下：BPG降低血红蛋白对氧的亲和力BPG与每个与每个b b链链的的Lys b82, b82, His b2, b2, His b143 b143, , N-末端末端 Val b1 b1等残基的正电等残基的正电荷静电作用荷静电作用P(

17、O2)/torr氧饱和分数（Y）组织中肺中（4500m）肺中 (海平面）BPG进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在肺部，肺部，PO2超过超过100torr，血红蛋白几乎全被，血红蛋白几乎全被O2饱和饱和, BPG是否存在与氧和关系不大。在是否存在与氧和关系不大。在组织中，组织中，PO2低（低（30torr)，BPG能降低血红能降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。（1）高山适应和肺气肿的生理补偿变化；）高山适应和肺气肿的生理补偿变化；BPG升高。升高。（2）血库储血时加入肌苷可防止）血库储血时加入肌苷可防止BPG的降

18、解。的降解。l氧的S形曲线结合，Bohr效应以及BPG效应物的调节使得血红蛋白的输氧能力达到最高效率(协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率白的输氧能力达到最高效率 )l血红蛋白使体内的pH维持在一个较稳定的水平l血红蛋白的别构效应充分反映了它的生物学适应性，结构与功能的高度统一性。1. 胎儿血红蛋白（胎儿血红蛋白（HbF)在相当于成人血红蛋在相当于成人血红蛋白白 (HbA)b b 链链143残基位置含有残基位置含有Ser， 而成年而成年人人b b 链的这个位置是具有阳离子的链的这个位置是具有阳离子的His残基。残基。残基残基143面向

19、面向b b 亚基之间的中央空隙。亚基之间的中央空隙。（1 1）为什么）为什么 2 , 3-2 , 3-二磷酸甘油酸（二磷酸甘油酸（2, 3-2, 3-BPG)同脱氧同脱氧HbA的结合比同脱氧的结合比同脱氧HbF更紧？更紧？ （2） HbF 对对2 , 3-二磷酸甘油酸的低亲和力二磷酸甘油酸的低亲和力如何影响到如何影响到HbF 对氧的亲和力？对氧的亲和力？ （3） HbF 的的P50 是是18托（托（Torr) , HbA的的P50 是是26托（托（Torr) ，基于这两个数值如何解释，基于这两个数值如何解释氧从母亲血液有效转运到胎儿？氧从母亲血液有效转运到胎儿？链的143位为丝氨酸，而链的14

20、3位为组氨酸 解析与要点解析与要点 ：（1） 2 , 3-二磷酸甘油酸的阴离子基团处在脱氧血二磷酸甘油酸的阴离子基团处在脱氧血红蛋白两条红蛋白两条b b 链的链的Lys b82b82、H His b b143、 His b b2和和N-末端末端Val b1 b1 氨基的阳离子形成氢键和盐键的距离范氨基的阳离子形成氢键和盐键的距离范围内，它可与中心空隙带正电荷的侧链结合，而脱围内，它可与中心空隙带正电荷的侧链结合，而脱氧氧HbF b b 链链143残基位置含有残基位置含有Ser，缺少带正电荷的，缺少带正电荷的侧链，减低了对侧链，减低了对2 , 3-二磷酸甘油酸的亲和力二磷酸甘油酸的亲和力 （2）

21、 2 , 3-二磷酸甘油酸稳定脱氧血红蛋白的构象，二磷酸甘油酸稳定脱氧血红蛋白的构象， HbF 与与2 , 3-二磷酸甘油酸的结合力低，因而增加了二磷酸甘油酸的结合力低，因而增加了对氧的亲和力。对氧的亲和力。 （3）在）在20 40 torr 氧分压下，氧分压下， HbF对氧的亲和力对氧的亲和力大于大于HbA 允许氧由母亲血向胎儿有效转移。允许氧由母亲血向胎儿有效转移。l2.在体外，用下列方法处理对血红蛋白与氧的亲和力有什么影响？l(1)pH值从7.0增加到7.4l(2)CO2分压从1000Pa增加到4000Pal(3)O2分压从6000Pa下降到2000Pal(4)2,3-二磷酸甘油酸的浓度

22、从810-4 mol/L下降到210-4 mol/Ll(5) a2b2解聚成单个亚基l解答： (1)pH值增加，Hb与氧的亲和力增加l(2)CO2分压增加，Hb与氧的亲和力降低l(3)O2分压下降，Hb与氧的亲和力降低l(4)2,3-DPG浓度下降，Hb与氧的亲和力增加l(5) a2b2解聚成单个亚基， Hb与氧的亲和力增加l导致一个蛋白质中氨基酸改变的基因突变能产生所谓分子病，这是一种遗传病l与有缺陷的血红蛋白有关的疾病分为两类：一类称为血红蛋白病是由于或链发生了变化，例如镰刀状细胞贫血病等；另一类称为地中海贫血，是由于缺少了或链，例如-和-地中海贫血病l由于遗传基因突变导致血红蛋白分子中氨

23、基酸残基的替代所造成的l是一个反映出蛋白质的氨基酸序列在决定它的构象及其生物学功能方面的重大作用的典型例子。Hb A H2NVal-His-leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Hb S H2NVal-His-leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys- 1 2 3 4 5 6 7 8镰刀形镰刀形红细胞红细胞正常红正常红细胞细胞小小 结结蛋白质分子结构与功能的关系：蛋白质分子结构与功能的关系：（1）每种蛋白质分子都具有其特定的结构来完）每种蛋白质分子都具有其特定的结构来完成它特定的功能，甚至只有个别氨基酸的变化成它特定的功能，甚至只有个别氨基酸的变化就能引起功能的改变或丧失，结构

24、与功能之间就能引起功能的改变或丧失，结构与功能之间具有高度统一性。具有高度统一性。（2）蛋白质的构象与功能的关系十分密切。构）蛋白质的构象与功能的关系十分密切。构象改变时，功能也会发生改变；蛋白质构象的象改变时，功能也会发生改变；蛋白质构象的破坏，可引起功能的丧失。破坏，可引起功能的丧失。l（辽宁师范大学2005年）讨论蛋白质构象与功能的关系l蛋白质的功能发挥必须以特定构象为基础，两者密切相关。l（1）变性、复性，构象改变，生物学活性改变l(2) 酶原激活等例子都说明通过改变一级结构而改变空间结构，从而酶活改变（3）肌红蛋白与血红蛋白a、b 结构相似，具有相似的功能。其特定的结构维持了结合氧的

25、能力。 血红蛋白为四聚体，具有变构现象使得输氧能力高度有效。l（4）酶与底物结合过程中的诱导契合第七节第七节 蛋白质的性质蛋白质的性质 蛋白质是相对分子质量（蛋白质是相对分子质量（relative molecular mass, Mr）很大的生物大分子，其）很大的生物大分子，其Mr变化范围在变化范围在6 0001 000 000 或更大一些。或更大一些。（一）根据化学组成测定最低（一）根据化学组成测定最低Mr 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最

26、小公倍数。真实真实Mr = 最低最低 Mr n （n 是每个分子中元素原子的数目）是每个分子中元素原子的数目）举例：举例： 1、肌红蛋白、肌红蛋白 Fe：0.335% M Fe ：55.8 Mr：16 700 n = 1 2、血红蛋白、血红蛋白 Fe：0.335% M Fe ：55.8 最低最低Mr：16 700 别法别法Mr： 68 000 n= 4 真实真实Mr：16 700 466 800氨基酸的定量分析表明牛血清清蛋白含有氨基酸的定量分析表明牛血清清蛋白含有0.58%的色氨酸（色氨酸的相对分子质量为的色氨酸（色氨酸的相对分子质量为204）。）。（1）试计算牛血清清蛋白的最小相对分子质量

27、）试计算牛血清清蛋白的最小相对分子质量（假设每个蛋白分子只含有一个色氨酸残基）。（假设每个蛋白分子只含有一个色氨酸残基）。 （2）凝胶过滤测得的牛血清清蛋白的相对分子）凝胶过滤测得的牛血清清蛋白的相对分子质量为质量为70 000, 试问牛血清清蛋白分子含有几个试问牛血清清蛋白分子含有几个色氨酸残基？色氨酸残基？解：解： (1) 0.58:100=204:Mr, Mr=204x100/0.58=35172.41 (2) 70 000/35172.412l半透膜半透膜（semipermeab1e membrane）l渗透压（渗透压（osmotic pressure）l理想溶液中，溶液理想溶液中，溶

28、液的渗透压与溶质浓的渗透压与溶质浓度的关系可用范托度的关系可用范托夫（夫（vant Hoff）公）公式表示：式表示：渗透压渗透压半透膜半透膜溶剂溶剂蛋白质蛋白质溶液溶液 =nRT/V=(g/Mr)RT/V 即即 = ( g / V ) RT / Mr = c R T / Mrl式中式中中渗透压中渗透压(N/m2即即Pa)lV是溶液体积是溶液体积(m3)，n是溶液中溶质的摩尔数；是溶液中溶质的摩尔数；lg是溶质的质量是溶质的质量(g)；c是溶质的浓度是溶质的浓度(g/ m3)；lT是绝对温度是绝对温度(K)；lR是气体常数是气体常数 8.314J/(Kmol)；lMr是溶质的相对分子质量或称摩尔

29、质量是溶质的相对分子质量或称摩尔质量(g/mol)。l从上式看出，理想溶液中渗透压是浓度的线性函数，从上式看出，理想溶液中渗透压是浓度的线性函数，实际的高分子溶液与浓度之间不是简单的实际的高分子溶液与浓度之间不是简单的线性关系线性关系。在浓度不大时，它们的关系用下式表示：在浓度不大时，它们的关系用下式表示：l用稀释法（外延法）：利用渗透压的测定来计算蛋白质Mr时，实际上都是测定几个不同浓度的渗透压，以/c对c作图并外推到蛋白质浓度为0时所得截距，即 lim/c值，代入公式求出Mr.l对于相对分子质量10 000至100 000范围的蛋白质利用渗透压法估算其Mr，可以给出可靠的结果= RT(cM

30、r+ Kc2) c=RTMr+ KcMr=RTLim/cc 0l利用超速离心机测定蛋白质或其他生物大分子利用超速离心机测定蛋白质或其他生物大分子的相对分子质量，常用的有两种方法：的相对分子质量，常用的有两种方法：一种是沉降速率法（一种是沉降速率法（sedimentation velocity），），另一种是沉降平衡法（另一种是沉降平衡法（sedimentation equilibrium）。）。被认为是最准确可靠的方法被认为是最准确可靠的方法基本原理： 离心力（centrifugal force，Fc）： 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义

31、： F = ma = m2 2 r a 粒子旋转的加速度， m 沉降粒子的有效质量，粒子旋转的角速度， r粒子的旋转半径( cm )。 相对离心力（relative centrifugal force，RCF）: 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。 X X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n n为转子每分钟的转数（revolutions per m

32、inute,简写成r/min,或rpm）。22 沉降系数（sedimentation coefficient，s）： 1924年Svedberg对沉降系数下的定义为颗粒在单位离心力场中移动的速度。 若用2n/60表示，则 X1：离心前粒子离旋转轴的距离；X2：离心后粒子离旋转轴的距离。S：沉降系数，时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。 例如，动物原生质核糖体的沉降系数等于80S，它的含义就是：8010-13s。细胞及细胞的各组分的沉降系数有很大的差异，所以可以利用生物样品沉降系数的差异采用离心技术将他们彼此分开。 4.沉降系数与物质相

33、对分子质量: 根据Svedberg公式，由沉降系数可以计算出物质的相对分子质量： Mr=RTsMr=RTs20,W/D/D20,W20,W(1-(1-) Mr:相对分子质量； D20,W：以20的水为介质时颗粒的扩散系数； R:气体常数； T：绝对温度； s20,W：以20的水为介质时颗粒的沉降系数； ：偏微比容，等于溶质粒子密度的倒数； ：溶剂密度 l利用凝胶过滤（gel filtration）可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来。这种方法比较简便，不要求复杂的仪器就能相当精确地测出蛋白质的相对分子质量l如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质

34、具有与此球体相同的半径，称蛋白质分子的斯托克半径 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。 若以组分的洗脱体积(Ve)对组分相对分子质量的对数(lgMr)作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系。以此为标准曲线，可以通过测定某一未知组分的洗脱体积，而从标准曲线中查得其相对分子质量。在实际应用中多以相对洗脱体积Kav (Kav=Ve/Vt) 对lgMr作曲线，称为选择曲线，

35、曲线的斜率说明凝胶的特性。每一类型的化合物，如球蛋白类、右旋糖酐类、酶与清蛋白类等都有各自特定的选择曲线。测定时，未知相对分子质量的组分应位于直线部分为宜。若不在直线部分，可选用另一种凝胶重新试验。logMr洗脱体积（洗脱体积（mL）ABCCBA未未 知知洗洗脱脱体体积积与与Mr的的关关系系测定蛋白质相对分子质量一般用交联葡聚测定蛋白质相对分子质量一般用交联葡聚糖，糖，Sephadex。如如Sephadex G-75(300080 000), G-100(4000150 000)l电泳时，蛋白质颗粒在各种介质中的迁移率决电泳时，蛋白质颗粒在各种介质中的迁移率决定于它所带的定于它所带的净电荷净电

36、荷以及以及分子大小分子大小和和形状形状等因等因素素lSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳1967年年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDS）和少量巯基乙醇）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的，则蛋白质分子的电电泳迁移率泳迁移率（e1ectrophoretic mobility）主要取）主要取决于它的决于它的相对分子质量相对分子质量，而与原来所带的电荷，而与原来所带的电荷和分子形状无关和分子形状无关l在一定条件下，在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为与大多数蛋白质的结合比

37、为1.4克克SDSl克蛋白质，相当于每克蛋白质，相当于每两个氨基酸两个氨基酸残基结合一个残基结合一个SDS分子。分子。 SDS与蛋白质的结合：与蛋白质的结合：l第一第一，由于，由于SDS是阴离子，使多肽链覆盖上是阴离子，使多肽链覆盖上相同密度的相同密度的负电荷负电荷，该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因，该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的SDS-蛋白质复合体，电泳时都以同样的电荷蛋白质蛋白质复合体，电泳时都以同样的电荷蛋白质比向正极移动。比向正极移动。l第二第二，改变了蛋白质单体分子的，改变了

38、蛋白质单体分子的构象构象，SDS-蛋白质复蛋白质复合体在水溶液中的形状被认为是近似合体在水溶液中的形状被认为是近似雪茄烟形的长椭圆雪茄烟形的长椭圆棒棒，不同蛋白质的，不同蛋白质的SDS复合体的短轴长度（直径）都是复合体的短轴长度（直径）都是一样的约为一样的约为1.8nm，而长轴长度则随蛋白质的相对分子，而长轴长度则随蛋白质的相对分子质量成正比例变化质量成正比例变化la和和b 、 K1 和和 K2都是常数都是常数l以几种相对分子量已知的标准蛋白质的以几种相对分子量已知的标准蛋白质的Mr的的对数值对对数值对R作图，根据待测样品的作图，根据待测样品的R ，从，从其标准曲线上查出分子量其标准曲线上查出

39、分子量logMr =a - bR 或或logMr =K1 K2R R= 样品迁移距离样品迁移距离前沿（染料）迁移距离前沿（染料）迁移距离l对某一种蛋白质来说，在某一对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为称为蛋白质的蛋白质的等电点等电点 l没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点（isoionic point），等离子点是蛋白质的一个特征常数蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液

40、中带负电荷，在等电点碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。时为两性离子。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带电荷的正负性和多少不小不同的蛋白质所带电荷的正负性和多少不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。同，迁移率即异，在电泳时可以分开。 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。泳。1. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 （1）纸上电泳：用滤纸作支持物。）纸上电泳：用滤

41、纸作支持物。-+（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。聚丙烯酰胺）作支持物。1）圆盘电泳：在玻璃管中进行的凝胶电泳。）圆盘电泳：在玻璃管中进行的凝胶电泳。+ 2）平板电泳：在铺有凝胶的玻板上进）平板电泳：在铺有凝胶的玻板上进行的电泳。行的电泳。等电聚焦电泳等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。荷为零，在电场中不再移动。+5.06.07.0稳定稳定pH梯度梯度5.06.07.0稳定稳定pH梯度梯度通电通电+三、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的胶体性质 由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成由

42、于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-1-100nm100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层形成一层水化层水化层，同时这些颗粒带有，同时这些颗粒带有电荷电荷，因而蛋，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。白质溶液是相当稳定的亲水胶体。+ 蛋白质透析法蛋白质透析法: :利用蛋白质不能透过半透膜的的性质利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋

43、再置于流，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析渗出，大分子蛋白质留在袋中水中，小分子杂质被透析渗出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysisdialysis）。）。布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力具有吸附能力蛋白质溶液稳定的原因蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化）；）表面形成水膜（水化）； 2）带相同电荷。）带相同电荷。四、蛋白质的沉淀反应四、蛋白质的沉淀反应如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等

44、电点如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水消除相同电荷，除去水膜膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。沉淀。 加高浓度盐类（盐析、盐溶）加高浓度盐类（盐析、盐溶） 1. 加盐使蛋白质沉淀析出盐析加盐使蛋白质沉淀析出盐析 分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。 加有机溶剂加有机溶剂 加重金属盐加重金

45、属盐 加某些酸类和生物碱试剂加某些酸类和生物碱试剂 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。能沉淀生物碱，称生物碱试剂。 5. 加热变性沉淀加热变性沉淀制备有活性的蛋白质应注意的问题制备有活性的蛋白质应注意的问题 五、蛋白质变性与复性五、蛋白质变性与复性 蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。理性质和化学特性以及生物学功能的基础。 当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，其分子内部原有的高级构象发生变化，的影响，其分

46、子内部原有的高级构象发生变化，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为为变性变性（denaturationdenaturation）。）。 l天然蛋白质分子因环境的种种关系，天然蛋白质分子因环境的种种关系，从有序从有序而紧密的结构，变为无序而松散的结构而紧密的结构，变为无序而松散的结构，这，这就是就是变性变性。l他认为他认为天然蛋白质的紧密结构以及晶体结构天然蛋白质的紧密结构以及晶体结构是由分子中的次级键维系的，所以容易被物是由分子中的次级键维系的，所以容易被物理的

47、和化学的因素所破坏。理的和化学的因素所破坏。l这种观点基本上反映了这种观点基本上反映了蛋白质变性的本质。蛋白质变性的本质。1、生物活性丧失（、生物活性丧失（Inactivation）2、一些侧链基团暴露、一些侧链基团暴露3、蛋白质的物理化学性质改变、蛋白质的物理化学性质改变 易沉淀（热变性、酸变性等）易沉淀（热变性、酸变性等） 碱、脲、盐酸胍变性（溶解性很好）碱、脲、盐酸胍变性（溶解性很好） 粘度增加、扩散系数降低粘度增加、扩散系数降低 CD、紫外、荧光发射光谱等发生明显变化、紫外、荧光发射光谱等发生明显变化4、生物化学性质改变、生物化学性质改变 易被蛋白质水解易被蛋白质水解蛋白质变性过程将导

48、致蛋白质变性过程将导致变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固凝固。应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老老 蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程。种可逆过程。 变性蛋白质在除去变性因素后，可缓慢地重变性蛋白质在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为蛋白质的和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性复性（renaturationrenaturation）。）。1.（宁波大学（宁波大

49、学2005年）什么是蛋白质变性作用？年）什么是蛋白质变性作用？引起蛋白质变性的因素有哪些？引起蛋白质变性的因素有哪些？解析：主要明确蛋白质变性的本质：空间结构解析：主要明确蛋白质变性的本质：空间结构的破坏而引起的生物学活性、物理化学性质的的破坏而引起的生物学活性、物理化学性质的改变。改变。反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有此反应的有此反应的蛋白质或氨蛋白质或氨基酸基酸双缩脲反应双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红紫色或粉红色色二个以上肽键二个以上肽键所有蛋白质所有蛋白质米伦反应米伦反应H g ( N O 2 ) 2 、H g ( N O3)2及及HNO2混合物混合

50、物红色红色 Tyr黄色反应黄色反应浓浓HNO3及及NH3黄色、橘色黄色、橘色 Tyr、Phe乙醛酸反应乙醛酸反应(Hopking-Cole反反应应)乙醛酸试剂及浓乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色紫色 Trp坂口反应坂口反应(Sakaguchi反应反应)-萘酚、萘酚、NaClO红色红色胍基胍基Arg酚试剂反应酚试剂反应(Folin-Cioculteu反反应应)碱性碱性CuSO4及磷及磷钨酸钨酸-钼酸钼酸蓝色蓝色酚基、吲哚基酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮反应茚三酮茚三酮蓝色蓝色自由氨基及羧基自由氨基及羧基-氨基酸氨基酸 六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应OHN七、蛋白质的紫外吸收光谱七、蛋白

51、质的紫外吸收光谱 蛋白质在远紫外光蛋白质在远紫外光区（区（200-230nm200-230nm）有较）有较大的吸收，在大的吸收，在280nm280nm有有一特征吸收峰，可利一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质用这一特性对蛋白质进行定性定量分析。进行定性定量分析。蛋白质质量浓度蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm - 0.76A1cm280 260测定范围：测定范围：0.10.5mg/mll蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度（purity）或比活（specific activity），以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性（比活常以活力单位数/克蛋白质表示）。设法除去变性的

52、和不要的蛋白质，并且希望所得蛋白质的产量达到最高值。1.前处理 要选择合适的材料;合适的破碎方法;合适的提取液。2.粗分级分离 要方法简便，处理量大。常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。3.细分级分离 主要使用各种层析、电泳，方法要精心选择，巧妙配合。后期可用结晶法。l根据蛋白质在溶液中的下列性质分离纯化蛋白质的方法：分子大小溶解度电荷吸附性质对配体分子的生物学亲和力等（一）根据分子大小不同的纯化方法1.透析和超滤(1)透析 透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子

53、物质降到最小值为止。 原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。 磁力搅拌器磁棒透析液蛋白质溶液半透膜袋2.超滤： 利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。 超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩、不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。超滤法是一种温和、非变性的物理方法，比其它分离方法有效率更高、更灵活的优点。原理： 在外力作用下，超滤膜对大分子物质的截留主要是筛分作用，决定截留效果的主要是膜的表面活性

54、层上孔的大小与形状。除了筛分作用外，膜表面、微孔内的吸附和粒子在膜孔中的滞留也使大分子被截留。 现在已有各种市售的超滤膜装置可供选用，有加压、抽滤和离心等多种形式。滤膜也有多种规格，他们截留相对分子质量不同的蛋白质。使用中最需注意的问题是滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，使超滤速度减慢，能被截留物质的Mr变小。图 7-6 利用压力和离心力的超过滤滤膜抽气离心离心超滤的主要应用： 浓缩：使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过，从而达到浓缩的目的。 梯度分离：按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时，超滤是一种经济有效的方法，适用于分离相对分子质量相差10倍以上

55、的分子组分。在超滤过程中，虽然截留的大分子被浓缩，但滤过的溶质分子仍保持初始的浓度。 脱盐纯化：脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。通过溶剂交换，可最有效地去除溶液中的小分子物质，并逐渐分离纯化出大分子物质。具体方法为：在溶液进行超滤的同时，不断向溶液中补充溶剂，补充溶剂的速度与溶液滤过速度相同，使体系始终保持恒定，这种方法又称透析超滤法。l介质：蔗糖、氯化铯、聚蔗糖（Ficoll)、葡聚糖等滴加样品4%8%12%16%20%是根据分子大小分离混合物最有效的方法之一。（1）凝胶过滤的介质 凝胶的交联度或孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围（fractionation

56、range） 排阻极限（exc1usion limit）来表示分级分离范围的上限，它被定义为不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子的Mr，例如sephdex G-50的排阻极限是30 000。 凝胶的粒度与洗脱流速和分辨率有关。颗粒通常用筛眼数或目数（mesh size）或珠直径（um）表示。凝胶过滤层析的基本原理水化的凝胶颗粒凝胶过滤 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。

57、 样品中各组分的流出顺序，可用分配系数Ka来量度： Ka=(Ve-Vo)/ViKa=(Ve-Vo)/Vi 式中Ve：为洗脱体积(elution volume)，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积；Vo：外体积(outer volume)，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积。 Vi：内体积(inner volume)，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。 当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出。 若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出。 Ka在0-1之间的组分，

58、洗脱时Ka值小的先流出 ，Ka值大的后流出。 (二) 利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀和pH控制 利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。 单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱 。pH溶解度（蛋白mg/ml）NaCI该图说明：该图说明：（1）b b- -乳球蛋

59、乳球蛋白的溶解度在白的溶解度在其等电点其等电点 (pH5.25.3)时时达到最低值，达到最低值，在等电点两侧在等电点两侧的的pH下，其溶下，其溶解度迅速提高；解度迅速提高；（2）NaCl浓浓度对度对pH与溶解与溶解度的关系无多度的关系无多大影响大影响2.蛋白质的盐溶和盐析 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶； 原因：主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白分子彼此排斥，而蛋白分子与水分子间的相互作用却加强 当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，

60、不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出。离子强度（I）Log（溶解度）在等电时，中性盐（K2SO4)对一氧化碳血红蛋白的溶解度的影响 盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系。两者的关系可用下式表示： lglg（S/SoS/So）= -KsI= -KsI S为蛋白质在离子强度为I时的溶解度(g/L)；So为蛋白质在离子强度为0时的溶解度；Ks为盐析常数；I为离子强度。 在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一pH值的水溶液中的溶解度为一常数So。故上式可改写