第一章氨基酸修饰右旋糖酐纳米材料的研究

1、第一章氨基酸修饰右旋糖酐纳米材料的研究1 前言由多官能团化右旋糖酐衍生物为基材制备而成的空腔纳米球一直是科研工作人员专注的一个热点。这种纳米微球在药物控制释放、人工细胞、催化剂和电子材料等方面都有广泛的应用17-19。在生物医药领域，制备的微纳米材料必须对人体无毒，具有较好的生物相容性以及高度靶向性。因此，这些材料通常是由生物聚合物原料制备而成的，譬如，多糖或者带有大量疏水基的葡聚糖衍生物20,21。制备含有空腔的微纳米球的方法有很多种。基于核-壳结构的模板合成得到了较好的发展，这种方法能够合成出不同壳核组成的空心微球。通常情况下，研究人员将一系列材料（聚合物、无机物、生物材料、金属材料）层层

2、包裹后作为核心部分的二氧化硅胶体或者聚苯乙烯乳胶，从而制备得到带有核-壳结构的空心纳米球22,23。除了模板辅助合成，还可以通过让嵌段式聚合物自组装来制备空心微纳米球24,25。特殊的分子链是制备具备特定微观形态和稳定性空心微纳米球的必要条件。这些聚合物的两性特征同样是保证成功自组装规则的微纳米球不可缺少的条件。本研究中，拟将新型官能团化右旋糖酐通过普遍自组装方法制备得到空心微纳米球。右旋糖酐是一种非常有价值的生物聚合物，广泛应用于医学和药学领域，比如替代血浆或预防蛋白质调理素作用的包衣材料26。然而，右旋糖酐上的大量未修饰的羟基的存在，使分子间趋向于重组超分子作用从而产生聚集，甚至于造成微纳

3、米颗粒的塌陷。因此，对右旋糖酐上的大部分羟基进行化学修饰是非常有必要的27,28。本研究过程中，通过将右旋糖酐、丙酸酐和各种氨基酸原料于两步酯化反应之后，合成得到官能团化右旋糖酐衍生物，并研究其自组装为微纳米颗粒的过程。2 实验部分2.1 原料所有的溶剂和试剂都是分析纯。氨基酸原料，CDI（N,N-羰基二咪唑）和右旋糖酐（Mw 33666 g mol1）购买自上海华茂药业有限公司。渗析袋来自北京欣慧泽奥科技有限公司。所有的化学药品都是直接使用的，没有经过进一步处理。2.2 仪器测试1H NMR(300 MHz), 13C NMR(75 MHz)由Bruker spectrometer核磁共振仪

4、测定，以TMS为内标。FTIR(KBr)由Bruker EQUINOX 55傅里叶红外分光光度仪测定。扫描电镜图片由Nova NanoSEM 200扫描电镜仪拍摄。pH计型号为Mettier delta 320。2.3 合成 右旋糖酐丙酸酯的合成右旋糖酐丙酸酯的合成采用Liebert等人在2005年报道的方法3(反应方程式见Scheme 1-1-1)。称取2.0 g右旋糖酐溶于20 mL mL丙酸酐，10 L三乙胺加入到上述溶液中。将反应液在搅拌条件下加热到80 反应5 h。反应结束后，待反应液冷却到室温，倒入盛有300 mL冰异丙醇的烧杯中析出产物。抽滤，用95 %乙醇洗涤两次，在60 的真

5、空干燥箱中烘干得到固体右旋糖酐丙酸酯。M1： g %)；1H NMR (300 MHz，DMSO-d6)：-3.5 (H-葡萄糖单元)，2.3 (CH2-丙酸酯)， ppm (CH3-丙酸酯)；13C NMR (75 MHz，DMSO-d6)： = 173.6 (O-CO)，98.5 (C1)，73.4-68.3 (C2-C5)， 63.8 (C6)，27.1 (CH2-丙酸酯)， ppm(CH3-丙酸酯)；FTIR (KBr)：3430 (OH)，2927 (CH)，1750 (C=O 酯键)，1155 (C-O)，1026 cm1 (C-O)。 右旋糖酐丙酸酐氨基酸酯的合成称取3.5 mm

6、ol右旋糖酐丙酸酯溶于10 mL DMSO溶液中。待溶解完全后，称取13.5 mmol的氨基酸和13.5 mmol的CDI加入到反应液中。将反应液于80 搅拌反应24 h。反应结束后，待反应液冷却至室温，再倒入盛有400 mL异丙醇（或水）的烧杯中析出产物，抽滤，用50 mL乙醇（或水）洗涤两次，并在60 的真空干燥箱中烘干得到固体产物。右旋糖酐丙酸酐色氨酸酯（M2）。产物：0.75 g (49.4%)；1H NMR (300 MHz，DMSO-d6)： = 10.8 (NH)，6.6 (H-吲哚环)，5.4-3.5 (H-葡萄糖单元)，2.3 (CH2-丙酸酯)，2.1 (NH2)， ppm

7、 (CH3-丙酸酯)；13C NMR (75 MHz，DMSO-d6)： = 173.6 (O-CO)，167.2 (O-CO-色氨酸酯)，109.2 (C-吲哚环)，-68.3 (C-葡萄糖单元)，55.7 (CH-色氨酸酯)，30.4 (CH2-丙酸酯)，9.2ppm (CH3-丙酸酯)；FTIR (KBr)：3394 (OH，NH)，2927 (C-H)，1750 (C=O 酯键)，1657 (C=O 酯键)，1091 (C-O)，1017cm1 (C-O)。M1 M2Scheme 1-1-1右旋糖酐丙酸酐缬氨酸酯（M3）。产物：0.21 g (16.1%)；1H NMR (300 MH

8、z，DMSO-d6)：=(NH2)，(H-葡萄糖单元)，2.5 (CH2-丙酸酯)，2.3 (CH3-CH-CH3)，2.1 (NH2)， ppm (CH3-)。M3右旋糖酐丙酸酐天冬氨酸酯（M4）。产物：1.32 g ( %)；1H NMR (300 MHz，DMSO-d6)：=8.0 (HO-C=O)，7.2(NH2-)，5.4-3.5 (H-葡萄糖单元)，2.5 (-CH-C=O)，2.4 (-CH2-)， ppm (CH3-丙酸酯)。M4右旋糖酐丙酸酐精氨酸酯（M5）。产物：2.00 g ( %)；1H NMR (300 MHz，DMSO-d6)： = (NH2-CH)，7.4 (NH

9、=C)，7.0 (NH2-C=)，5.4-3.5 (H-葡萄糖单元)，3.0 (CH-C=O)，2.6 (N-CH2-C)，2.3 (CH2-丙酸酯)，2.0 (-NH-)，1.6，1.4 (-CH2-)， ppm (CH3-丙酸酯)。M5上述制备的右旋糖酐丙酸酐氨基酸酯当中，大部分化合物的水溶性比较好，右旋糖酐丙酸酐色氨酸酯（DPT）水溶性较差。自组装过程中为了选择以水为不良溶剂，本研究拟右旋糖酐丙酸酐色氨酸酯（DPT）为原料，将其溶于良溶剂，通过渗析方法制备微纳米球，并研究微纳米球形态的影响因素，稳定性等内容。2.4 右旋糖酐酯纳米球的制备称取40 mg DPT溶于二甲基亚砜（DMSO），

10、10 mL N，N-二甲基乙酰胺（DMAc）或者N，N-二甲基甲酰胺（DMF）。将上述溶液装在自制的生物渗透膜中，再将整个渗透膜置于200 mL去离子水中，让渗透膜内的溶剂充分渗析7天。7天后，使用高速冷冻离心机收集去离子水中渗析出来的产物。产物在室温下充分晾干，取少量样品测试扫描电镜（SEM）。2.5 纳米微球的物理化学性质研究根据Masson等人29的研究方法，对制备得到的空心纳米球在去离子水中保存时的物理性质和化学性质变化进行了研究。纳米球颗粒的完整性主要通过SEM图来观察，从SEM图中研究它的形态和粒径变化。而研究浑浊液的pH值变化可以分析纳米球的降解过程。3 结果与讨论3.1 右旋糖

11、酐酯纳米球的表征 空心纳米球的形态由Fig. 1-1-1发现，由右旋糖酐丙酸酐色氨酸酯渗析制备得到的纳米球带有空腔(80 - 500 nm)。而且，在Fig. 1-1-1上也出现了一些被破坏的纳米球，从这些纳米球中可以发现，空心纳米球的壁厚在15 - 110 nm之间。此外，无论空心纳米球的内层还是外层都是非常光滑的。这些在水中自组装形成的空心纳米球包括一个疏水内层和一个亲水外壳。在整个渗析过程中，右旋糖酐丙酸酐色氨酸酯能够顺利自组装成空心纳米球，最根本的原因还是因为它本身的两亲性质。由右旋糖酐与具有生物相容性的丙酸酐及色氨酸通过两步酯化反应生成的高度官能团化的右旋糖酐丙酸酐色氨酸酯，可以调节

12、自身的亲水-疏水平衡以及溶解性能30-32。这些空心纳米球核心的低极性区域可以用来包裹疏水性药物，提高疏水性药物在人体内的靶向释放。Fig. 1-1-1 SEM images of DPT hollow nanospheres prepared by dialysis of DMAc against water.值得一提的是，右旋糖酐衍生物的这种自组装成空心纳米球的能力并不是取决于某些特殊的取代基，而是取决于因各个官能团之间内在的极性差别而引起的某一种平衡。但是，在实验中引入不同的官能团以及引入该官能团后反应产物的取代度不同，也将导致制备的纳米球在粒径和形态方面的不同。因此，带有呋喃甲基，谷氨

13、酰基，丙基和乙酰基等官能团的多官能团化右旋糖酐溶于DMAc后在去离子水中渗析只能得到没有空腔的自组装纳米球28。 溶剂对纳米球形成的影响除了右旋糖酐的不同的官能团之外，有机溶剂对纳米球形成的粒径和形态也有很大的影响。因为纳米球的制备，主要是在渗析过程中通过有机溶剂与去离子水的缓慢交换中完成的31。针对于有机溶剂，我们展开了一系列研究来确定其对纳米球的粒径和形态的影响。在实验中，我们选取了六种不同极性和粘度的溶剂作为研究对象，它们分别是DMF(0.82 cp)，DMAc(0.92 cp)，N-甲基-1-吡咯烷酮(1.65 cp)，DMSO(2.24 cp), 呋喃甲醇(4.62 cp)和1,2-

14、丙二醇(43.0 cp)。这六种有机溶剂的粘度范围从0.82 cp到43 cp，能够充分的反映出极性或者粘度对纳米微球的粒径和形态的影响。Fig. 1-1-2中展示的就是将右旋糖酐丙酸酐色氨酸酯溶于不同有机溶剂后在去离子水中渗析2天得到的纳米球的扫描电镜图片。Fig. 1-1-2 SEM images of DPT nanospheres prepared by dialysis of (a) DMAc against water, (b) DMF against water, (c) N-methyl-2-pyrrolidone against water, (d) DMSO against

15、 water, (e) furfuryl alcohol against water and (f) 1,2-dihydroxypropane against water.在呋喃甲醇中制备得到的DPT纳米球的粒径是57 - 257 nm，DMSO中制备的纳米球的粒径是61 - 292 nm，N-甲基-2-吡咯烷酮中的是83 - 348 nm，DMAc中的是103 - 349 nm， DMF中的262 - 670 nm。在这五种有机溶剂中，制备的纳米球的形态是表面光滑的圆形。因此，这些溶剂都比较适合于制备右旋糖酐衍生物纳米球。尤其是DMSO，在所选定的六种有机溶剂中，它的毒性最小，更加适合应用药

16、物载体。对比不同溶剂中制备得到的纳米颗粒发现，呋喃甲醇和DMSO中制备的纳米球在粒径方面远远小于DMAc中或DMF中制备的纳米球。结合有机溶剂的粘度，我们可以得出，随着粘度的增大，相应的纳米球在粒径方面有减小的趋势。这种现象说明，增大有机溶剂的粘度，会减慢DPT从有机溶剂中往去离子水中渗透的速度，从而减慢整个自组装的过程。而自组装过程的减慢，导致了制备的纳米球在粒径上减小，在形态上变得规整。例如，DMSO的粘度是2.24 cp，呋喃甲醇的粘度是4.62 cp，两者的粘度都远远大于水的粘度，两者都相对降低了DPT向去离子水渗透的能力。因此，在这两种溶剂下自组装得到了粒径相对较小的纳米球。但是，并

17、不是有机溶剂的粘度越大，制备得到的纳米球的粒径就会越小。我们选择了粘度为43 cp的1,2-丙二醇来进行纳米球自组装实验。由于渗析的速度非常缓慢，在渗析了14天之后，我们才得到了自组装纳米球。这些纳米球的粒径分布非常散乱，如Fig. 1-1-2(f)所示。大部分的粒径为71 - 153 nm，但是也有粒径超过540 nm的纳米球。导致这种现象的产生，可能是因为氢键的相互作用而致使已经自组装的纳米球相互聚集。这可能是DPT在整个渗析过程中，渗透速度比较缓慢的另一个原因。除了纳米球粒径上的区别以外，有机溶剂同样对纳米球的形态有很大的影响33,34。有趣的是，DPT只有溶解在DMAc中，才能通过渗析

18、的方法自组装成空心纳米球，在其它五种溶剂中，皆无法制备带有空腔的纳米球。由此可见，DMAc最适合于制备空心纳米球。至于造成这种现象的原因，仍在进一步的研究当中。 纳米球稳定性的研究同时研究了空心纳米球在水介质中保存时所表现出来的物理和化学稳定性。通过对形态和载体颗粒大小来评价纳米球的完整性。另外，我们还利用悬浊液的pH值来分析纳米球降解的程度。Fig. 1-1-3(a)所示的是，空心纳米球在25 的去离子水中保存了30天后的微观形态。图中，空心纳米球(平均粒径86 - 445 nm)保持了较好的形态，空腔也保持完好。这些空心纳米球表现出了非常令人满意的形态稳定性。纳米球能表现出这样的稳定性，是

19、因为我们将右旋糖酐上大部分羟基进行化学修饰，直接避免了羟基之间形成氢键体系而破坏纳米球的稳定性。同时，对羟基的化学修饰也避免了大量未修饰羟基进一步形成多糖的超分子相互作用而导致分子的相互聚集，以及由这种分子聚集引起的纳米球颗粒的塌陷35。Fig. 1-1-3 SEM images of DPT hollow nanospheres stored in deionized water at 25 for 30 days (a), 60 days (b), and 120 days (c).Fig. 1-1-3(b)所示的是，空心纳米球在25 的去离子水中保存了60天后的微观形态。从图中可以看出，

20、部分空心纳米球的形态已经发生塌陷。纳米球的塌陷可是由于残存的羟基逐渐再形成超分子相互作用而造起的。而这些残存的羟基不仅包括官能团化右旋糖酐上的一些未修饰成功的羟基，也包括酯水解反应后一直游离在体系中的羟基28。因此，以氢键为基础的超分子结构导致了亚稳定的纳米球结构，而随着时间的延续，亚稳定的纳米结构导致了越来越多的超分子相互作用的形成36。从Fig. 1-1-3(c)中，我们发现，当空心纳米球在25 的去离子水中储存4个月后，这些纳米球的形态完全塌陷成块状、片状以及其他大小不一的不规则的形状。这些现象表明，DPT空心纳米球在水中的降解可能遵循两个主要步骤：表层腐蚀和整体腐蚀37。在保存过程的最

21、初，聚合物就有少量的降解，即表面腐蚀。表面腐蚀，就是水介质在基体中发生扩散，并且这种水解性的扩散还没有完全覆盖到整个聚合物基体，这样就使得在保存过程的前30天中，空心纳米球保持着良好的形态。在接下来的保存过程中，微孔的形成以及水介质侵蚀DPT而导致的酯水解反应的加剧，两者共同导致了大量的自由羟基产生。这些自由的羟基再形成强烈的超分子相互作用，反过来又加剧了空心纳米球的降解。当保存4个月后，从最初的DPT分子链上分裂出了许多带有不同分子质量的分子链，这就导致了基体质量的大量损失，最终导致聚合物的崩解38。而Fig. 1-1-3(c)中展现出来的空心纳米球降解后出现的块状，瓦片状以及一些其它不规则

22、的形状，则是由聚合物分子质量的高度多分散性造成的。另外，我们也研究了在保存过程中pH值的变化，并以此来进一步研究整个降解过程。Fig. 1-1-4记录了空心纳米球储存在25 或37 去离子水中的pH值的变化。25 下，悬浊液的最初pH值为6.95。17周以后，pH值最终降到4.87。而在37 下，前四周的pH变化较大，这一点与在25 下的情况存在着较大的区别。由此可知，温度可能会加快介质的酸化。尽管前4周的pH值变化远比后来的13周要来的明显，但是空心纳米球在四周后仍然保持着完好的形态，如Fig. 1-1-3(a)所示。此外，由于空心纳米球具有良好的吸附能力，有许多游离的DPT分子被吸附在空腔

23、的内壁和外层，这些游离的DPT分子比起均匀有序的分布在自组装纳米球上的DPT分子更加容易被水解39。因此，我们可以推测得出，前四周pH值发生较大的改变主要是因为被空心纳米球吸附的游离DPT分子发生了水解，而不是空心纳米球的降解。Fig. 1-1-4. Evolution of pH of DPT hollow nanospheres in deionized water, stored at 25 or 37 .在接下来的13周时间里，两种温度下的去离子水介质的pH值不再发生明显的变化。当保存时间超过13周，水介质的pH值变化已经非常小，也就意味着聚合物的降解速率很慢。而且，在保存过程的最后时期，两种温度下的水介质的pH值趋于相同。这种现象与上述的SEM图片展示的结论是一致的。聚合物在水介质中的降解会引起介质的酸化。这种现象类似于聚-己内酯纳米球29,40和聚（D, L -丙交酯）41纳米球在水介质中降解。对空心纳米球降解过程的研究表明，这些空心纳米球能够在去离子水中稳定地保存2个月。因此，这些相对稳定的空心纳米球适合于制备成