痕量物质的富集分离技术(专题,分析化学)

1、痕量物质的富集分离方法简介v固相萃取v分子印迹v薄层层析v固定化金属亲和色谱v浊点萃取v双水相萃取v微波辅助萃取固相萃取法固相萃取（固相萃取（SPE）v1979 年, St Onge 等人首次提出固相萃取(Solid - Phase Extraction) 的定义。所谓固相萃取法是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理，使液体样品通过吸附剂，保留其中某一组分，再选用适当溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱,从而达到快速分离净化与浓缩的目的。简要过程简要过程v样品(包括分离物和干扰物) 通过吸附剂。v吸附剂选择性保留分离物和部分干扰物，其他干扰物通过吸附剂。v用适当的溶剂淋洗吸附剂，使先

2、前保留的干扰物被淋洗掉，分离物保留在吸附剂床上。v纯化、浓缩的分离物从吸附剂上淋洗下来。固相萃取的特点固相萃取的特点v萃取过程简单快速,只需510min，是液液的10% v所需有机溶剂也只有液- 液萃取法的10 % v吸附剂和溶剂可以灵活选择v不出现乳化现象,提高了分离效率。v重现好,有些待测物回收率可达99 %以上。v易于自动化操作，易于与其他仪器联用 v处理过的样品易于贮藏、运输、便于实验室间进行质控。Method for Trace Level Analysis of C8, C9, C10, C11, and C13 Perfluorocarbon Carboxylic Acids i

3、n WaterKaren Risha, John Flaherty,* Roice Wille, Warren Buck, Francesco Morandi, andTsuguhide IsemuraAnal. Chem. 2005, 77, 1503-1508前言前言全氟代磺酸盐与全氟代羧酸被用于制造含氟聚合物中，但是它们稳定性很强，自然界中很难降解。因此关于它们的痕量分析在降解研究中十分重要。本文提出了SPE-LC-MS/MS的分析方法，检测限25ng/L。实验方法实验方法标准：9-氢十六氟代壬酸样品准备样品准备样品在冰箱中26条件下保存两周之内测试，测试前需要平衡到室温，并且通过离心分

4、离除去可见的固体颗粒。样品准备样品准备在50mL的聚丙烯离心管中加大约40mL样品，加入内标（9-氢十六氟代壬酸），使浓度为250ng/mL，这个值可以变化，但须保证标准和样品中浓度相同，然后均匀混合。对于自来水样品，还需加200L 250mg/mL的硫代硫酸钠除去氯。固相萃取固相萃取采用Waters公司的C18固相萃取管，使用前先通过10mL甲醇，5mL水活化，流速大约2滴每秒。萃取时40mL试样，以1滴每秒的速度流过，去除洗出液，用5mL 40%的甲醇淋洗，同样去除洗出液，最后用5mL 100%的甲醇淋洗，收集洗出液。无论是样品还是标准均浓缩了8倍。色谱条件色谱条件C8柱，2.1*50mm

5、，4m，柱温35，进样量，流动相A 2mM醋酸铵，流动相B 甲醇，采用梯度洗脱的方式。结果与讨论结果与讨论v选择性：检测限：25ng/L（条件：回收率在80%120%之间），无明显干扰v线性：252500ng/L所有被分析物线性相关度（R20.985），回收率偏差 Ni(II) Co(II) Zn(II) Cd(II) Pb(II)v同时，普通的二氧化硅球表面印迹的MIP凝胶也有发展，主要通过硅球表面修饰以及选用新的功能单体vMIP在金属离子的识别及吸附分离领域有着广泛的使用前景薄板层析TLCThin layer chromatography 概要v引言引言v原理原理v应用应用 1 传统中药中

6、糖的分析传统中药中糖的分析 2低分子量化合物快速成像低分子量化合物快速成像 3 TLC-MALDI-TOFMS分析粗型脂多糖分析粗型脂多糖 （LPSs）和）和Lipid A 4 TLC-VC-MALDI MS分析神经节苷脂分析神经节苷脂 5 TLC板荧光成像分析神经节苷脂板荧光成像分析神经节苷脂v进展进展 引言引言历史：历史：v薄层层析法薄层层析法TLC：50 年代后在纸层析和柱层析的基础上发展起来年代后在纸层析和柱层析的基础上发展起来v1951年年J.G.kirchner首先对其进行了系统的研究首先对其进行了系统的研究v1958年年E.Stahl对薄层层析用的吸附剂和涂层工具进行改进并使之标

7、准化，对薄层层析用的吸附剂和涂层工具进行改进并使之标准化，克服了技术上的困难，使克服了技术上的困难，使TLC获得迅速发展获得迅速发展定义：定义：vTLC是把固定相吸附剂铺在玻璃板上铺成均匀的薄层，把试液点在层析板是把固定相吸附剂铺在玻璃板上铺成均匀的薄层，把试液点在层析板（即薄层）的一端试样中各组分就被吸附剂所吸附，由于薄层的毛细管作（即薄层）的一端试样中各组分就被吸附剂所吸附，由于薄层的毛细管作用，展开剂沿着吸附薄层上升，试样溶解在展开剂中，在固定相和流动相用，展开剂沿着吸附薄层上升，试样溶解在展开剂中，在固定相和流动相之间不断的发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。之间不断的发生溶解、

8、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。优点：优点：v快速，做一次薄层层析只需快速，做一次薄层层析只需10-60min；v分离效率高；灵敏度可达分离效率高；灵敏度可达0.01g；v层析后可用各种方法显色，甚至可喷强腐蚀性的浓硫酸，可高温灼热；层析后可用各种方法显色，甚至可喷强腐蚀性的浓硫酸，可高温灼热；v应用面广，可以进行定性及定量测定应用面广，可以进行定性及定量测定v对于各种试剂，可选用不同的吸附剂和展开剂对于各种试剂，可选用不同的吸附剂和展开剂v可做吸附层析、分配层析以及离子交换层析。可做吸附层析、分配层析以及离子交换层析。 原理原理v展开剂在薄层中的流速与展开剂的表面张力、粘度及吸附剂的种类、展

9、开剂在薄层中的流速与展开剂的表面张力、粘度及吸附剂的种类、粒度、均匀度等等因素有关，即和层析系统（固定相和流动相）有关，粒度、均匀度等等因素有关，即和层析系统（固定相和流动相）有关，也和展开距离有关。也和展开距离有关。 v塔板理论亦可应用于塔板理论亦可应用于TLC中，将塔板高度和展开距离联系起来。中，将塔板高度和展开距离联系起来。 vTLC中层析效率同样可用分离度表示。中层析效率同样可用分离度表示。 Rs=2(x2-x1)/(w1+w2)。 当当Rf=0.33时，时，Rs值最大，分离最好。值最大，分离最好。 v选择合适的吸附剂和展开剂是选择合适的吸附剂和展开剂是TLC分离能否获得成功的关键。分

10、离能否获得成功的关键。原理原理v吸附剂吸附剂 ：最常用的是氧化铝和硅胶。：最常用的是氧化铝和硅胶。 v展开剂展开剂 ：可用单一的溶剂并且还常常把各种溶剂按不同比例混合配：可用单一的溶剂并且还常常把各种溶剂按不同比例混合配 成混合溶剂以作展开剂。成混合溶剂以作展开剂。 v铺层：干法铺层铺层：干法铺层-简单快速、随铺随用，但不能保存，易被吹散。分简单快速、随铺随用，但不能保存，易被吹散。分 离效果差。层析展开较快。离效果差。层析展开较快。 湿法铺层湿法铺层-常用有倾倒法、刮层法、涂铺器铺层法。常用有倾倒法、刮层法、涂铺器铺层法。 v点样：需用易于挥发、极性和展开剂相似的溶剂溶解试样以得到点样：需用

11、易于挥发、极性和展开剂相似的溶剂溶解试样以得到 0.5-1%的试液。可用毛细管或微量注射器把试样点成小圆的试液。可用毛细管或微量注射器把试样点成小圆 点或长条。力求快速点或长条。力求快速v展开：上行法展开：上行法-常用常用 干板近水平方向展开干板近水平方向展开 硬板采用近垂直方向展开硬板采用近垂直方向展开 下行法下行法-比上行法快，但分离效果较差。比上行法快，但分离效果较差。 应用应用1 传统中药中糖的分析传统中药中糖的分析v糖广泛存在于中草药中，干重占整个植物的糖广泛存在于中草药中，干重占整个植物的80-90% v中药中多糖的分析在制药上有非常重要的意义中药中多糖的分析在制药上有非常重要的意

12、义 vTLC可以用来纯化测量和从寡糖、多糖中确认单糖可以用来纯化测量和从寡糖、多糖中确认单糖 应用应用2低分子量化合物快速成像低分子量化合物快速成像vTLC-MALDI-TOFMS对微量分析展开以及原位操作有高速度和选择性。对于对微量分析展开以及原位操作有高速度和选择性。对于低分子量分析物，基质的背景离子常引起严重的干扰。低分子量分析物，基质的背景离子常引起严重的干扰。v使用使用UV吸收质子给体离子液体（吸收质子给体离子液体（Et3N-CHCA）作为基质分析低分子量物）作为基质分析低分子量物质如生物碱质如生物碱Arborescidine A、B、C，麻醉剂，麻醉剂Levobupivacaine

13、、Mepivacaine和抗体和抗体Tetracycline。应用应用3 TLC-MALDI-TOFMS分析粗型脂分析粗型脂多糖多糖LPSs）和）和Lipid A 内毒素内毒素LPSs的混合物，其脂结构域称为的混合物，其脂结构域称为Lipid A，与多，与多种生物活动相关，没有种生物活动相关，没有O链的链的LPSs称为粗型称为粗型LPS 使用使用TLC，选用合适的溶剂在硅胶上选择性的萃取分离，选用合适的溶剂在硅胶上选择性的萃取分离完整细胞的完整细胞的LPS组分，所得分子物种的谱带在无损伤组分，所得分子物种的谱带在无损伤成像后从板上刮下来直接和基质混合，用成像后从板上刮下来直接和基质混合，用 M

14、ALDI-TOFMS进行分析进行分析 基质加入柠檬酸极大改善谱图基质加入柠檬酸极大改善谱图 TLC直接从细胞中萃取分离出直接从细胞中萃取分离出LPSs并进行表征，快速、并进行表征，快速、灵敏，可用于结构和血清分析。灵敏，可用于结构和血清分析。应用应用4 TLC-VC-MALDI MS分析神经节苷脂分析神经节苷脂v神经节苷脂广泛存在于动物细胞外膜表面，代谢、生物合成、生理性质均引起神经节苷脂广泛存在于动物细胞外膜表面，代谢、生物合成、生理性质均引起人们注意。其中人们注意。其中TLC是分析这类糖脂混合物以及其生物行为的标准工具是分析这类糖脂混合物以及其生物行为的标准工具17-18。TLC和和MS偶

15、联起来可以满足结构分析偶联起来可以满足结构分析 v使用使用1-10mbar达到振动冷却（达到振动冷却（vibrational cooling）即用）即用TLC-VC-MALDI-FTMS分析神经节苷脂分析神经节苷脂 TLC-VC-MALDI-FTMS联用样品处理简单，可以二维成像联用样品处理简单，可以二维成像 傅里叶变换有高分辨率和准确度，可以更好的分析结构细节傅里叶变换有高分辨率和准确度，可以更好的分析结构细节 外置离子源可规避外置离子源可规避TLC板的不规则表面引起的分辨率和准确度的降低板的不规则表面引起的分辨率和准确度的降低 TLC板还可直接与板还可直接与MALDI相连，不需对分析物进行

16、再次萃取。相连，不需对分析物进行再次萃取。应用应用5 TLC板荧光成像分析神经节苷脂板荧光成像分析神经节苷脂vTomohiro Hayakawa等人利用等人利用100C以下仅有唾液酸发荧光的以下仅有唾液酸发荧光的特征，通过荧光成像定量测定神经节苷脂特征，通过荧光成像定量测定神经节苷脂v神经节苷脂上唾液酸浓度与荧光强度的线性范围神经节苷脂上唾液酸浓度与荧光强度的线性范围47pM-4.5nMvTLC板上的荧光成像分析可以测量更宽范围的神经节苷脂板上的荧光成像分析可以测量更宽范围的神经节苷脂v通过调整加热温度，可分析糖脂类物质。该方法简单、低廉、重通过调整加热温度，可分析糖脂类物质。该方法简单、低廉

17、、重现性好、不需特殊试剂、不需荧光标记，可以定量测定。现性好、不需特殊试剂、不需荧光标记，可以定量测定。 进展进展 v解析电喷雾电离（解析电喷雾电离（DESI）是新的大气压解析电离方法）是新的大气压解析电离方法vDESI主要应用于表面分析，主要应用于表面分析，TLC可以通过可以通过DESI和和MS偶联偶联小小 结结vTLC省时、省原料，可以同时分析多种样品。耗资少，所需仪器省时、省原料，可以同时分析多种样品。耗资少，所需仪器少，所需操作培训少，它是一种平面的分离手段，极易和少，所需操作培训少，它是一种平面的分离手段，极易和MALDI-MS联用，甚至可以在原位分析多种物质，也有许多尝试联用，甚至

18、可以在原位分析多种物质，也有许多尝试应用不同的电离源来进行结构和定量测定，在许多领域都有潜在应用不同的电离源来进行结构和定量测定，在许多领域都有潜在的应用前景。的应用前景。 固定化金属亲和色谱分离核酸Biotechnol. Prog. 2003, 19,982-986 Nucleic Acid Separations Utilizing Immobilized Metal Affinity Chromatography Jason C. Murphy, David L. Jewell, Kristopher I. White, George E. Fox, and Richard C. Wil

19、lson1 前言2 实验与结果平衡等温吸附曲线动力吸附测定PCR产物纯化碱基对错配检测3 结论1 前言v固定化金属亲和色谱（Immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是1975年由Porath等人提出。v目前IMAC技术广泛应用于蛋白质的纯化，因为发现金属离子可以与蛋白质组氨基酸残基形成亲和力高的鳌合物以达到分离目的。v然而，金属离子与核苷酸的相互作用仍是一个广泛研究中的领域，应用IMAC柱分离核苷酸受到一定的限制。v本文假定Cu(II)或Ni(II)离子结合的IDA (iminodiacetic acid, 亚氨乙酰乙酸) 色谱吸附剂可以

20、选择性的与核苷酸嘌呤中的咪唑基团相结合，以达到色谱分离。v实验发现，核苷酸碱基可以与螯合金属离子特异性结合，通过这一特点，可以应用IMAC柱纯化分离质粒DNA和RNA，纯化PCR反应产物，以及检测DNA杂交错配。2.1 平衡等温吸附曲线实验步骤： a. 在吸附剂上固定金属离子 b. 均匀混合IMAC结合缓冲溶液，核苷酸溶液与吸附剂 浊液，待平衡后，离心分离2 min c. 取出悬浮液，在260 nm波长处以分光光度法测其中 核苷酸的残留浓度实验结果：RNA吸附。Zn(II)结合IDA凝胶溶液能与RNA以及单链 DNA有效结合，但是对于质粒（环形或双 链）DNA无明显的结合作用。金属离子的作用。

21、 Cu(II), Ni(II), Zn(II), Co(II)单体聚合物。A20，G20，C20，T20，A20/T20Cu(II)结合结合IDA凝胶溶液具有最佳的吸附能力凝胶溶液具有最佳的吸附能力IMAC对于嘌呤的吸附大于对嘧啶的吸附且磷酸骨架对吸附亲和性贡献不显著2.2 动力吸附测定实验步骤： a. 往色谱柱（1 cm15 cm）中填充15 mL螯合凝胶 b. 用去离子水平衡柱，再用金属氯化物冲洗以饱和柱 c. 再用水以及IMAC缓冲液平衡柱 d. 质粒样品连续流动进入色谱柱直至饱和 e. 待分离结束，以EDTA溶液冲洗柱使其再生实验结果：RNA无金属离子有金属离子金属离子的存在与否严重影

22、响了吸附剂与核苷酸的相互作用。RNA以及受损的质粒DNA成功的与完整的环形质粒DNA分离。IMAC柱对于分离损伤性DNA相对其他方法来说具有更好的分离效率。2.3 PCR产物纯化实验步骤： a. PCR反应 Taq 聚合酶，MgCl2反应缓冲液，dNTPs 25次循环：94 DNA解旋变性 （45 s） 55 前体与单链粘和 （30 s） 72 聚合延伸 （3 min） b. 往色谱柱内填充Cu(II)键合凝胶溶液，PCR直接在柱 内反应，然后淋洗分离。IMAC柱保留了PCR反应前体和一些不完全反应产物，色谱柱中流出的是双链DNA产物以及质粒DNA模板。同时，IMAC柱也保留了部分PCR反应产

23、物，但Pfu聚合酶反应得到的产物在柱上的保留比Taq聚合酶反应得到的产物保留作用要小。实验结果：2.4 碱基对错配检测实验步骤： a. 将20个单体的寡聚核苷酸混合于柱内缓冲溶液中，在 42 使其杂交10 min，保证每条双链DNA只在第10 位有一对碱基对错配 b. 然后以IMAC缓冲液连续过柱，并以0-14 mM，1 mL/min的梯度加入咪唑溶液进行洗脱 c. 待分离结束，以EDTA溶液冲洗柱使其再生IMAC柱对错配碱基有较好的分辨能力，而且由于洗脱顺序与之前对单体聚合物的等温吸附曲线结果比较吻合，所以进一步说明吸附剂与核苷酸的作用来自于金属离子与不同碱基之间的相互作用。A G C T

24、? 实验结果：3 结论v通过实验发现，IMAC色谱技术可以通过与核苷酸碱基的特性结合分离寡聚核苷酸，纯化质粒DNA和RNA，纯化PCR反应产物，并可以检测核苷酸碱基错配。v这一技术有很好的应用前景，通过继续研究pH值，配体结构，金属离子，以及洗脱液组成与浓度等多种因素对分离效果的影响，可以应用于不同体系下的核苷酸分析。v此外，也可将该技术进一步应用到毛细管电泳中。浊点萃取Cloud point extraction基本原理v临界胶束浓度（critical micelle concentration） 胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示，这是体系特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂

25、、温度和压力等因素有关。v增溶作用 表面活性剂在水溶液中浓度达到临界胶束浓度而形成胶束后，能使不溶或微溶于水的有机物的溶解度显著增大，形成澄清的透明溶液。浊点现象v浊点现象 一个均一的表面活性剂水溶液在外界条件(如温 度) 变化时, 因为引发相分离而突然出现浑浊的现象叫浊点现象, 此时的温度叫做浊点温度（CP）。表面活性剂胶束溶液的相图(温度vs. 浓度) : (A ) 非离子型(B) 两性离子型基本原理温度引发表面活性剂相分离现象u 分相分相： 表面活性剂相 疏水性物质 水相（胶束浓度等于CMC） 亲水性物质u 浊点萃取 利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水 性物质分离的萃取方法浊点萃取过程

26、样品在适当温度下平衡离心分离表面活性剂添加剂表面活性剂稀释或净化分析v 表面活性剂的类型及性质 选择表面活性剂时主要考虑其两个性质: 浊点温度, 尤其对于热敏感的分析物要注意操作温度 对稳定性的影响; 疏水性, 疏水性增强有利于较低浊点温度，提高萃取率但 同时可能造成生物大分子如蛋白质变性。 常用的表面活性剂： 聚氧乙烯脂肪醇(CnEm )，对叔辛基苯基聚己二醇醚(OPEm)， 正烷基苯基聚己二醇醚(NPEm)， 两性离子表面活性剂(R1 (CH3) 2N + (CH2) 3OSO-）影响浊点萃取的因素v表面活性剂浓度 表面活性剂浓度增加, 萃取率E随之增加达到最大值。v 平衡温度 对于非离子

27、表面活性剂，平衡温度比浊点温度高出1015oC时，具有较好的萃取率。v 离心时间 离心时间加长，萃取率和分配比都增大。 对于CP高的体系，室温下过长的离心时间会引 起相逆转，使萃取效率降低。 影响浊点萃取的因素vpH值 被萃取物带电后，疏水性降低，与胶束的结合不如中性时强，因此离子型物质的萃取率较低。 l 体系的pH 应控制在被萃取物处于电中性状态。l在萃取生物大分子如蛋白质时，体系的pH 应控制在等电点附近，此时蛋白质具有较强的疏水性，易被萃取。v 添加剂 改变表面活性剂的浊点温度，引发表面活性剂相分离 。影响浊点萃取的因素浊点萃取的应用（1）金属离子的萃取金属螯合物具有微溶于水的特性，容易

28、与表面活性剂的疏水基相结合而沉积下来达到富集的目的。浊点萃取的效率取决于配体的疏水性以及螯合物的形式。Experimental schemes of CPE（2）生物大分子的萃取lCPE是根据蛋白质疏水性进行分离的lCPE可用于分离膜蛋白、酶、动物、 植物及细菌的受体lCPE 法分离纯化蛋白质已经可 以实现大规模操作（3）有机物的分离和萃取（4）环境化学分析浊点萃取的应用CPE与其它技术联用v CPE 可以作为高效液相色谱(HPLC)、流动注射分析(F IA )、毛细管电泳(CE) 等仪器分析的样品前处理方法, 提高检出灵敏度vCPE可与酶联免疫吸附分析连用v浊点萃取法与分光光度法的联用浊点萃

29、取法与分光光度法的联用v浊点萃取与火焰原子吸收光谱法联用浊点萃取与火焰原子吸收光谱法联用v操作步骤简单,无须使用专门仪器;v应用范围广,萃取效率高;v不使用挥发性有机溶剂,经济,安全,不影响环境;v具有生物活性的化合物在萃取过程中不易变性;v表面活性剂易于处理;v作为分离纯化方法,易于大规模生产;CPE方法的优点展望vCPE的机理目前还不十分清楚, 仍然需要研究一种理论来描述和预测这种通过胶束和目标分析物间的相互作用力进行分离的体系v制备及工业级CPE 法分离后生物大分子与表面活性剂的分离仍需改进v浊点萃取与其他仪器分析方法的在线联用研究仍需深入双 水 相 萃 取 双水相定义 将两种不同的水溶

30、性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相容的两相，这就是双水相。 双水相的形成主要是由于高聚物之间的不相容性，即空间阻碍作用，使其相互无法渗透，不能形成均一相而分离。 疏水程度差异越大，分离倾向越大。 几种常见的体系l非离子型聚合物/非离子型聚合物 聚丙二醇甲基聚丙二醇l非离子型聚合物/无机盐 聚丙二醇硫酸钾l高分子电解质/非离子型聚合物 硫酸葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇l高分子电解质/高分子电解质 硫酸葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠盐 双水相萃取的原理 双水相萃取与水-有机相萃取相似，是依据物质在 两相间的分配系数（K）不同来进行选择性分配的。 当物质进入双水相体系后，由于

31、表面性质，电荷作 用和各种力（如疏水键，氢键，离子键）的存在和环 境因素的影响，而使其分配系数不同。 双水相萃取的原理 细胞粒子、噬菌体： 100 或0.01 蛋白质等生物大分子：0.1-10 小分子盐： 1 双水相体系对生物物质的分配具有很大的选择性 发展历史l 1896年，Beijerinck将明胶与琼脂混合时，得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相，上相含大部分明胶，下相含大部分琼脂，两相的主要成分都是水。l 1956年，瑞典大学的Alertson首次利用双水相分离生物分子，它利用色谱法从单细胞藻类中分离淀粉核。l 1979年，德国人Kula和Kroner等将双水相体系应用于从细胞匀浆液

32、中提取酶和蛋白质，大大改善了胞内酶的提取效果。 工艺流程ATPE匀浆液ATPE 上相（产物） 下相（废料） 上相（PEG,杂蛋白） 下相（目的产物）PEG+盐分离器分离器PEG循环+ 盐 双水相萃取体系特点l含水量高，接近生理环境，生物分子不易失活；l不经过滤直接提取细胞破碎匀浆内蛋白质；l界面张力小，有利于强化相际间的质量传递；l分相时间短，自然分相5-15分钟；l无有机溶剂残留，对人体无害；l易于工程放大和连续操作；l操作条件温和，常温常压进行 影响物质分配平衡的因素v聚合物的分子量 分子量越小，疏水性越小，蛋白质的溶解越多vpH 值 pH与蛋白质等电点相差越大，其在两相中分配越不均匀v离

33、子环境 粒子因迁移而在界面积累，改变界面电势，蛋白质等 荷电分子转入某相。v温 度 分配系数对温度不敏感 应用 双水相萃取技术已实现了细胞器、细胞膜、病 毒等多种生物体和生物组织以及蛋白质、酶、核酸、 多糖、生长素等大分子生物物质的分离与纯化,取得 了较好的成效。近年来,双水相萃取技术的分离对象 进一步扩大,已包括了抗生素、氨基酸、重金属离子 和植物有效成分中的小分子物质。生物粒子及大分子生物 从微生物全细胞组织匀浆中粒子 分离小包核体 （IB） PEG/磷酸盐蛋白质从奶酪中分离乳球蛋白 PEG/ 磷酸盐酶 从发酵液中提取葡萄糖苷酶 PEG/ 硫酸铵核酸 RNA 的分离 PEG/ 葡聚糖多糖

34、牛膝高分子物质中多糖成分 的纯化 PEG/ 磷酸盐小分子 抗生素 从发酵液中提取青霉素 PEG/ 硫酸铵色 素 从大肠杆菌中提取细胞色素b5 PEG/ 硫酸盐抗 体 从禽卵黄中提取IgG抗体 PEG/ 磷酸盐植物有 从黄芩中提取黄芩甙 PEG/ 磷酸盐效成分重金属 从金属中定量萃取金() PEG/氯化钠/ 氢溴酸 发展趋势1.双水相萃取相关理论的发展 至今尚无完善的理论来解释生物大分子在体系中的分配机理。 生物物质在双水相系统中分配时是一个由聚合物、聚合物(或无机盐) 、生物分子和水等构成的四元系统。系统中的组分性质千差万别,从晶体到无定形聚合物、从非极性到极性、从电解质到非电解质、从无机小分

35、子到有机高分子甚至生物大分子,这些都不可避免地造成理论计算的复杂性。 发展趋势2.新型双水相系统的开发 非离子型聚合物/ 非离子型聚合物 （变性作用低，价格较高，粘度大） 非离子型聚合物/ 无机盐 （成本低,粘度小,高浓度的盐废水不环保） 开发廉价的，高聚物易回收的，具有新功能的体系 发展趋势2.新型双水相系统的开发 温敏性双水相体系 常温为均相，高于某一温度为两相 表面活性剂体系 正，负离子表面活性剂的混合水溶液呈两相 发展趋势 3.亲和双水相萃取技术 亲和双水相萃取技术是在组成相系统的聚合物(如PEG、葡聚糖等) 上耦联一定的亲和配基，以提高效率和实用性。抗体配基： IgG,重组蛋白质的纯度提高26倍；金属配基： 价廉、再生容易，最有效的配基：Cu+ 微波辅助萃取Microwave Assisted Extraction主要内容v微波辅助萃取原理v微波辅助萃取系统密闭系统开放系统动态系统v影响微波辅助萃取的因素v微波辅助萃取的应用天然成分的提取其他技术v小结与展望微波辅助萃取的原理v微波：0.3300GHz；工业用2.45GHzv1986年，Ge