分子生物学与生物化学实验操作设计与技能(6-1)(1)

1、分子生物学与生物化学实验分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能操作、设计与技能转化技术转化技术( (二二) ) 李刚 副教授 PEG 法3农杆菌介导转化法1电击法4基因枪法2花粉管通道法7显微注射法5碳化硅纤维法8脂质体法6超声波法9激光微束法10农杆菌介导的遗传转化机理农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌,用于基因操作的主要有两类：根癌农杆菌（A. tumefaeiens）和发根农杆菌（A. rihizogenes）。他们分别含有Ti质粒和致根Ri质粒，目前对Ti质粒的研究较详细而且应用广泛。Ti质粒根癌农杆菌在感染植物时，能将其环状Ti质粒上的一段DNA插入到被感染植物基因组中，并能稳定遗传给

2、后代，导纳细菌本身不进入被感染的植物细胞，由此发展出农杆菌Ti质粒为载体的植物遗传转化系统。这是自然界存在的一个天然的遗传转化系统。这是自然界存在的一个天然的遗传转化系统。农杆菌转化的主要过程为（1 1）细菌在植物敏感细胞上吸附；（）细菌在植物敏感细胞上吸附；（2 2）农杆菌中的）农杆菌中的TiTi质粒上的质粒上的VirVir区基因被激活；区基因被激活；（3）T TDNADNA切割和切割和T TDNADNA复合物形成；（复合物形成；（4 4）T TDNADNA复合物由农杆菌进入植物细胞；（复合物由农杆菌进入植物细胞；（5 5）T TDNADNA整合到植物染色体上并且进整合到植物染色体上并且进行

3、表达。行表达。自然状况下，普通农杆菌能够感染双子叶植物自然状况下，普通农杆菌能够感染双子叶植物、裸子植物和少数几种单子叶植物。近年来，农杆菌在真菌、裸子植物和单子叶植物转化方面取得了可喜的进展，其中以单子叶植物，尤其是禾谷类作物的成功转化最引人注目。其中以单子叶植物，尤其是禾谷类作物的成功转化最引人注目。实现农杆菌对单子叶植物成功转化的关键因素实现农杆菌对单子叶植物成功转化的关键因素包括（1）选择活跃分裂的功能细胞；（2 2）添加酚类化合物，促进）添加酚类化合物，促进VirVir基因的活化基因的活化；（3）合适的农杆菌菌株（载体），如LBA4404，EHA101及C58等；（4）选择合适的基因

4、型、培养基、适宜的菌液浓度、细菌的生长状态等均是转化能否成功的关键所在。基因枪法 又称微弹轰击法。其基本原理是：将外源将外源DNADNA包被在微小的包被在微小的金粒子或钨粒子表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入金粒子或钨粒子表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源受体细胞或组织。微粒上的外源DNADNA进入细胞后，整合到植进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。 现在基因枪法已成为继农杆菌介导法之后第二大植物遗传转化方法，因为其具有以下优点： 受体类型广泛；无物种限制，操作简便快速；可控度高，转受体类型

5、广泛；无物种限制，操作简便快速；可控度高，转入组织的深度可用轰击压力和空间距离来控制；可同时用几入组织的深度可用轰击压力和空间距离来控制；可同时用几个质粒进行共转化。个质粒进行共转化。 缺点：转化频率低、价格昂贵、整合过程中易发生重排和高整合过程中易发生重排和高拷贝插入现象及后代遗传不稳定等缺点拷贝插入现象及后代遗传不稳定等缺点。PEG法 PEGPEG即聚乙二醇，是一种多聚化合物，能够促能够促进植物原生质体直接吸收外源质粒进植物原生质体直接吸收外源质粒DNADNA。PEG通过电荷之间的相互作用与DNA形成紧密复合物，原生质体通过内吞作用吸收外源复合物原生质体通过内吞作用吸收外源复合物到细胞内到

6、细胞内。PEG介导基因转化法由Davey等于1980年首创，PEG法对禾本科作物有重要作用，应用PEG法已成功转化了小麦、水稻、玉米、高梁等多种单子叶禾谷类作物的原生质体。由于原生质体不易形成再生植株由于原生质体不易形成再生植株，且PEG法转化率低，因此PEG法至今尚未普遍应用。电击法（Electroporation） 电击法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电击穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。李宝健等于李宝健等于19851985年首次将其应用于植物细胞的基因转化年首次将其应用于植物细胞的基因转化，现已被广泛应用于单子叶、双子叶植物中，特特别对禾谷类作物更有发展潜力。

7、别对禾谷类作物更有发展潜力。显微注射法 是利用显微注射仪显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞质或细胞核中。受体细胞的固定是显微注受体细胞的固定是显微注射中的一个重要问题。射中的一个重要问题。显微注射用的微针极细，针尖直径以0.5m左右为宜，一次注入细胞质中的DNA量约为105ml.该方法转化效率高，适用于各种材料。在多种植物的原生质体转化率高达60以上，如烟草、油菜、苜蓿等。脂质体法 是根据生物膜的结构特性，利用脂类化学物脂类化学物质人工合成细胞膜质人工合成细胞膜，然后用其将外源基因包然后用其将外源基因包裹形成球体，通过植物原生质体的吞噬或融裹形成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用，将外

8、源合作用，将外源DNADNA转入受体细胞。转入受体细胞。朱祯等（1990）首次利用这一技术将人的-干扰素cDNA导入水稻原生质体获得转基因植株。花粉管通道法 此法是由我国的周光宇等（1983）建立并发展起来的。主要原理是授粉后使外源授粉后使外源DNADNA能沿着花粉管渗能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，可用于任何开花胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，可用于任何开花植物。植物。1983年周光宇等利用此法将外源DNA成功导入棉花.目前该技术已在小麦、棉花、蔬菜作物中有报道。花粉管通道法是一种直接简便的转化

9、方法，不需要组织培养的继代，从而排除了植株再生的障碍，是一种应用广泛的外源DNA直接导入技术。碳化硅纤维法 应用直径为0.6m、长度为10-80 m的碳化纤维，使附着于纤维或细胞壁上的质粒DNA借助于在涡旋引起的相互碰撞过程中纤维对细胞纤维对细胞的穿刺作用而导入细胞的穿刺作用而导入细胞。该方法简单、快速、成本低，且受体类型广泛。超声波法 是一种新的外源DNA导入方法，其基本原理是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源胞膜造成通道，使外源DNADNA进入细胞。进入细胞。贾士荣等于1991年发展了这一新的转化方法。该方法操作简便，设备便宜，

10、不受宿主范围限制，转化效率高，不足之处在于易使外源不足之处在于易使外源DNADNA分子分子发生断裂。发生断裂。激光微束法 激光微束法是新兴的转化技术。其基本原理是将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射培养细微米级的微束照射培养细胞后，在细胞膜上可形成能自我愈合的小孔，使加胞后，在细胞膜上可形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源入细胞培养基里的外源DNADNA流入细胞，实现基因的流入细胞，实现基因的转移。转移。Kuruta（1986）首先将此方法应用于植物的遗传转化，用此法现已获得油菜、水稻、小麦等转化植株。该方法所需仪器设备昂贵，转化率较低，设备昂贵，转化率较低，稳定性、安全性等方

11、面不及电击法和基因枪法。稳定性、安全性等方面不及电击法和基因枪法。农杆菌转化法步骤1、农杆菌的准备：取5 ml YEP 培养基于灭菌的50ml离心管中，加入Kan50mg/L,取单菌落于单菌落于25252929 C C、250r/min250r/min振荡培养振荡培养30h30h。将以上菌液在2800r/min离心15min，去上清液，用冷藏的YEP液体培养基（加入AS 100M，Kan50mg/L,Rif25mg/L）20ml稀释ODOD600600=0.8-1.0=0.8-1.0待用待用。2、共培养转化： 将继代增殖47d的生长健壮（结构紧密、质地均一）的水稻水稻盾片愈伤组织移入无菌培养皿

12、，倒入农杆菌菌液，浸泡盾片愈伤组织移入无菌培养皿，倒入农杆菌菌液，浸泡202030min30min。随后将愈伤组织块用无菌滤纸吸干，转移到NBco培养基上,于于25-28 25-28 C C暗培养暗培养2-3d2-3d。共培养结束后，用无菌蒸馏水反复洗涤多次无菌蒸馏水反复洗涤多次（10次以上），再用含Tou500mg/L和cb200mg/L的无菌水（或NBwa）充分洗涤（振荡24h）。无菌滤纸吸干，在无菌滤纸上干燥数小时，转入转入NB2NB2预培养预培养1 1 星期。星期。Kan：Kanamycin，卡那霉素；AS：acetosyringone，乙酰丁香酮；Rif:fifampicin,利福平

13、；Tou：头孢霉素；cb:羧苄青霉素。YEP：950ml去离子水中加10g tryptone,10g 酵母提取物，NaCl 5g,pH7.0-7.2,定容至1L，高压灭菌。NBco:NB2,乙酰丁香酮 100 M；NB2：NB成分，2，4D。NB培养基见植物基因工程操作手册。Nbwa:NB成分，头孢霉素500m g/L和羧苄青霉素200mg/L。基因枪轰击法转化步骤 将增殖并经甘露醇高渗处理将增殖并经甘露醇高渗处理6h6h的愈伤组织放于培养皿的愈伤组织放于培养皿（d=9cmd=9cm）中心）中心，约每皿3030块块愈伤组织。采用Bio Rad PDS-1000/He 基因枪装置。取金粉悬液金粉悬液（60mg 金粉用无水乙醇消毒，悬浮于1ml无菌水中）50 50 L L 、加入5 5 g g质粒质粒DNADNA、 2.5M CaCl2 50 l、0.1M 亚精胺溶液20 l，充分混匀充分混匀，离心，无水乙醇清洗