第5章分子发光

1、121 1、分子荧光和磷光分析、分子荧光和磷光分析 3 图图1 单重态及三单重态及三重态激发示意图重态激发示意图 T1S1S04图图2 2 荧光和磷光体系能级图荧光和磷光体系能级图 5 6图图2 2 荧光和磷光体系能级图荧光和磷光体系能级图 能量以热的能量以热的形式发出形式发出1010-12-12s s7两个电子能级振动能级有重叠时两个电子能级振动能级有重叠时( (相同多重态间）相同多重态间）高能级高能级注意：注意：高激发单重态的高激发单重态的电子，通过内转移及振电子，通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动激发单重态的最低振动能级。能级。低能级低能级无辐射跃

2、迁无辐射跃迁8激发波长激发波长 1 1 2 2 荧光波长荧光波长 2 2 2 2 1 1 2 2注意：不论电子开始被激发至什么高注意：不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为能级，最终将只发射出波长为2 2的的荧光。荧光。振振动动弛弛豫豫内内部部转转移移辐射辐射1010-9-9 - 10 - 10-7-7s s荧光荧光9T1S1S010 自旋禁阻自旋禁阻 发光速度很慢发光速度很慢外光源照射停止后，磷光外光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间仍可持续一短时间。系间跨跃系间跨跃振动弛豫振动弛豫 辐射辐射磷光波长磷光波长 3 3 3 3 2 2磷光波长比荧光波长长磷光波长比荧光波长长101

3、04 410s10s磷光磷光11 1213 14 激发光激发光( (吸收吸收) )发射光发射光激发光谱激发光谱发射光谱发射光谱15 16 17萘的激发光谱、荧光萘的激发光谱、荧光和磷光光谱和磷光光谱 18 19 芘的苯溶液的吸收光谱和荧光发射光谱芘的苯溶液的吸收光谱和荧光发射光谱20 21 22 n n n n或或振动弛豫振动弛豫其他无辐射跃迁其他无辐射跃迁 有机化合物的荧光有机化合物的荧光的较大的摩尔较大的摩尔吸光系数吸光系数寿命比寿命比n n 短短23 容易实现容易实现 激发的芳香族化合物容易发生荧光。激发的芳香族化合物容易发生荧光。 此外，此外，增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大增加

4、体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。 例如，在苯中的荧光效率例如，在苯中的荧光效率 phph（CH=CHCH=CH）2 2 ph 0.28 ph 0.28 ph ph（CH=CHCH=CH）3 3 ph 0.68 ph 0.68 由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。生。24 在在0.1mol0.1molL L-1-1的的NaOHNaOH溶液中，荧光黄溶液中，荧光黄荧光效率达荧光效率达0.920.92，而酚酞却没有荧光。，而酚酞却没有荧光。 又如芴与联二苯又如芴与联二苯(

5、(左图所示左图所示) )，由于，由于芴中的亚甲基使分子的刚性平面增加，芴中的亚甲基使分子的刚性平面增加，导致两者在荧光性质上的显著差别，前导致两者在荧光性质上的显著差别，前者荧光产率接近于者荧光产率接近于1 1，后者仅为，后者仅为0.180.18。 萘与维生素萘与维生素A A都具有都具有5 5个共轭个共轭键键( (左左图所示图所示) )，而前者为平面结构，后者为非，而前者为平面结构，后者为非刚性结构，因而前者的荧光强度为后者刚性结构，因而前者的荧光强度为后者的的5 5倍。倍。 = 0.92 0 1 = 0.182526 27 。28 当入射光强度当入射光强度I0 和和l一定时：一定时： 注意：

6、注意：当当 l c 0.050.05时才成立时才成立29 温度对荧光强度的影响温度对荧光强度的影响 30 例：例： GaGa3+3+与与2 2，2-2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯 pH3-4pH3-4 生成生成1 1：1 1的配合物，的配合物，发射荧光发射荧光 pH6-7pH6-7 生成生成1 1：2 2的配合物，的配合物，不发射荧光不发射荧光。 31 溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用内滤光作用”。 荧光物质的荧光发射光的短波长的一端与该荧光物质的荧光发射光的短

7、波长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。 在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生吸收，产生“自吸收自吸收”现象而降低了溶液的荧光现象而降低了溶液的荧光强度。强度。32 荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭荧光猝灭。 能引起荧光强度降低的物质称为能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂猝灭剂。 33 34 35 原因：原因：36 荧光分析法的光谱比较简单，特征性强，而且荧光分析法的光谱比较简单，特征性

8、强，而且有激发光谱和发射光谱，选择的余地大。有激发光谱和发射光谱，选择的余地大。 激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光效率、激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光效率、荧光寿命等多种物理参数。荧光寿命等多种物理参数。 37 校准曲线法校准曲线法 比较法比较法 无机化合物的分析无机化合物的分析 直接荧光法直接荧光法 待测元素与有机试剂所组成的能发荧光的配合物，待测元素与有机试剂所组成的能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度以测定该元素的含量。这种方法称通过检测配合物的荧光强度以测定该元素的含量。这种方法称为直接荧光法。为直接荧光法。 现在可以利用有机试剂以进行荧光分析的元素已达现在可以利用有机试剂

9、以进行荧光分析的元素已达到到7070多种。较常用有机试剂进行荧光法测定的元素为多种。较常用有机试剂进行荧光法测定的元素为铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素等。铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素等。38 荧光猝灭法荧光猝灭法 某些元素可以从其他会发荧光的金属离子某些元素可以从其他会发荧光的金属离子-有机试剂配合物中取代金属离子或有机试剂，组成更稳定的不发有机试剂配合物中取代金属离子或有机试剂，组成更稳定的不发荧光配合物或难溶化合物，而导致溶液荧光强度的降低，由荧光荧光配合物或难溶化合物，而导致溶液荧光强度的降低，由荧光强度降低的强度来测定该元素的含量，这种方法称为荧光猝灭法。

10、强度降低的强度来测定该元素的含量，这种方法称为荧光猝灭法。 间接荧光法间接荧光法 间接荧光法常用于某些阴离子如间接荧光法常用于某些阴离子如F F- -、CNCN- -等的等的分析，它们可以从某些不发荧光的金属有机配合物中夺取金属离分析，它们可以从某些不发荧光的金属有机配合物中夺取金属离子，而释放出能发荧光的配位体，从而测定这些阴离子的含量。子，而释放出能发荧光的配位体，从而测定这些阴离子的含量。 催化荧光法催化荧光法 某些反应的产物虽能发生荧光，但反应速度某些反应的产物虽能发生荧光，但反应速度很慢，荧光微弱，难以测定。很慢，荧光微弱，难以测定。 若在某些金属离子的催化作用下，反应将加速进行，利

11、用这若在某些金属离子的催化作用下，反应将加速进行，利用这种催化动力学的性质，可以测定金属离子的含量。种催化动力学的性质，可以测定金属离子的含量。 铜、铍、铁、钴、锇、银、金、锌、铅、钛、钒、锰、过氧铜、铍、铁、钴、锇、银、金、锌、铅、钛、钒、锰、过氧化氢及氰离子等都曾采用这种方法测定。化氢及氰离子等都曾采用这种方法测定。39 有机化合物的分析有机化合物的分析 芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发射芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发射荧光，可以直接进行荧光测定。荧光，可以直接进行荧光测定。 如如维生素、氨基酸和蛋白质、胺类和甾族化合物、酶和辅酶以及各维生素、氨基酸和蛋白质、胺类和甾族化

12、合物、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等，这些复杂化合物许多均能发射荧光，种药物、毒物和农药等，这些复杂化合物许多均能发射荧光， 40抗体抗体( (或抗原或抗原) ) 荧光抗体（或抗原）荧光抗体（或抗原） 荧光素荧光素 相应抗原（或抗体）相应抗原（或抗体） 复合物复合物 41 42 在在20082008年年1010月月8 8日日, ,诺贝尔化学奖，绿色荧光蛋白诺贝尔化学奖，绿色荧光蛋白成了主角。诺贝尔委员会将化学奖授予美籍日裔科成了主角。诺贝尔委员会将化学奖授予美籍日裔科学家学家下村修下村修、美国科学家、美国科学家马丁马丁沙尔菲沙尔菲 和美籍华裔科和美籍华裔科学家学家钱永健钱永健 三人，以表彰

13、他们发现和发展了绿色荧三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。光蛋白质技术。 43什么是绿色荧光蛋白什么是绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，当它受到蓝光照射时，会吸收蓝光的部分能量，桶，当它受到蓝光照射时，会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。然后发射出绿色的荧光。 利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。原本黑暗或透明的视场马上射下进行显微镜观察。原本黑暗或透明的视场马

14、上变得星光点点变得星光点点那是被标记了的活动目标。对生那是被标记了的活动目标。对生物活体样本的实时观察，在绿色荧光蛋白被发现和物活体样本的实时观察，在绿色荧光蛋白被发现和应用以前，是根本不可想象的。应用以前，是根本不可想象的。 这种彻底改变了生物学研究的蛋白质，最初是这种彻底改变了生物学研究的蛋白质，最初是从一种广泛生活于太平洋海域的发光水母体内分离从一种广泛生活于太平洋海域的发光水母体内分离得到的。得到的。 44 45 通常应在低温下测量磷光！通常应在低温下测量磷光！46 液氮是最常用的合适的液氮是最常用的合适的冷却剂。冷却剂。 对溶剂要求对溶剂要求: : 在液氮温度（在液氮温度（77K77

15、K）下）下应具有足够的粘度并能形应具有足够的粘度并能形成透明的刚性玻璃体，对成透明的刚性玻璃体，对所分析的试样应具有良好所分析的试样应具有良好的溶解特性的溶解特性 溶剂应易于提纯溶剂应易于提纯，以除溶剂应在所研究的光溶剂应在所研究的光谱区域内没有很强的吸收谱区域内没有很强的吸收和发射和发射47 48 49胶束增稳的溶液室温磷光法（胶束增稳的溶液室温磷光法（MS-RTPMS-RTP） 50 敏化磷光跃迁示意图敏化磷光跃迁示意图 51 在荧光分光光度计上配上磷光配件后，即可用于磷光测在荧光分光光度计上配上磷光配件后，即可用于磷光测定。如将样品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于低定。如将样品放在盛

16、有液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于低温磷光测定。温磷光测定。 磷光分析主要用于测定有机化合物，如石油产品、多环磷光分析主要用于测定有机化合物，如石油产品、多环芳烃、农药、药物等方面。（教材列出了一些有机化合物芳烃、农药、药物等方面。（教材列出了一些有机化合物的磷光分析实例）的磷光分析实例）522 2、化学发光分析、化学发光分析 53 54 I Iclcl （t t）= = clcl dc/dt dc/dt I Iclcl化学发光反应的速率化学发光反应的速率55 A + B C* + D C* C + h 56 A + B C* + D C*+ F F* + E F* F + h 例如：例如：荧光棒发光机理荧光棒发光机理苯基草酸酯苯基草酸酯 H H2 2O O2 2酚酚中间物中间物*中间物中间物*染料染料染料染料*中间物中间物染料染料*染料染料h 57、58 59 60 化学发光测试仪原理方框图化学发光测试仪原理方框图 6162 化学发光分析最大的特点是灵敏度高，对气体和痕化学发光分析最大的特点是灵敏度高，对气体和痕量金属离子的检出限都可达量金属离子的检出限都可达ngngmLmL1 1级。级。 在环境监测、医学、生物学、生物化学和免疫学在环境监测、医学、生物学、生物化学和免疫学研究中，化学发光分析也是一种重要的手段。研究中，化学发光分析也是一种重要的手段。 6