版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
1、分子生物学与临床 中中 山山 大大 学学 主讲:杨主讲:杨 中中 汉汉() http:/ PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要20kB fragments插入噬菌体载体细菌扩增从基因组文库中筛选目的基因从基因组文库中筛选目的基因probe引物引物1977年引物引物引物引物1983年XX()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20 复温 3 PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶
2、段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 30次 12341234A:无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失B:病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C:正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失 PCR的局限:需了解靶基因片段两测的序列 对于未知序列和具有不同末端序列怎么办?对于未知序列和具有不同末端序列怎么办?(固定化PCR)锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一
3、同聚物尾(polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物(带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作 A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增荧光标记荧光标记 I5353SGExcitationSGSGSGSGEmission 5353SGSGSGSGSGExcitationEmission Taqman探针3端Q荧光分子能够吸收5端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5端荧光分子发出的荧光,只能检测到3端荧光分子的荧光信号,但当溶液中有PCR 产物(模板) 时,探针与模板
4、退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Taq 酶的5外切酶活性,将探针5端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET ,从而发出荧光,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer , FRET)Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递(荧光共振能量传递(FRET Probe)RQ53535353Excit
5、ationRQ QRQRExcitation双标记探针(双标记探针(Taqman Probe)RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标分子信标(Molecular Beacon Probe)引物特异性探针(引物特异性探针(Amplisenor Probe)535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR引物特异性探针(引物特异性探针(Amplifluor Probe)全新全新4通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCR仪仪 普通梯度普通梯度PCR仪仪+55A正常人A病 人病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)APCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 河北省保定市曲阳一中2025年高三年级1月调研测试语文试题试卷含解析
- 贵州省织金县第一中学2025年高三毕业班联考(二)语文试题含解析
- 《全面质量管理》习题集(含答案)
- 贵州省六盘水市盘县第二中学2025年高三下期中语文试题试卷含解析
- 广东省佛山一中、珠海一中、金山中学2025届高三年级下学期3月质量检测试题卷语文试题含解析
- 甘肃省嘉峪关市酒钢三中2025届高三联合调研考试(语文试题理)试题含解析
- 福建省晋江市安溪一中、养正中学2025届高三下学期单元检测试题语文试题含解析
- 北京市西城区第四十四中学2024-2025学年高三下学期第三次月考语文试题理试题含解析
- 二年级数学计算题专项练习1000题汇编集锦
- 高考生物备考教案生态系统的结构
- 新产品开发跟踪表
- 小学体育人教四年级全一册第五章投掷与游戏软式标枪教学设计
- 从听课议课到观课评课课件
- xx公司明星员工、明星班组评选方案
- 物料先进先出管理规范,月份标签使用与进出库作业要求 - 现场管理经验
- (中职)电工技术基础与技能课程标准
- 英语专业本科毕业论文写作指导课件
- 二年级上册数学教学课件-3.角的初步认识102-人教版(共14张PPT)
- 化工原理实验精馏实验
- 群租房排查登记表
- 新教材大象版三年级下册科学2-4导体与绝缘体教学课件
评论
0/150
提交评论