基因工程的工具课件

1、专题专题1 1 基因工程基因工程现代生物科技专题现代生物科技专题转基因抗虫棉转基因抗虫棉普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫基因抗虫基因棉花细胞棉花细胞( (含抗虫基因含抗虫基因) )棉花植株棉花植株( (有抗虫特性有抗虫特性) )重组重组DNADNA导入导入形成形成基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表

2、达基因工程的概念基因工程的概念 准确切割准确切割DNADNA的工具（的工具（“分子手术刀分子手术刀”）限制性内切酶限制性内切酶 DNADNA片段的连接工具（片段的连接工具（“分子缝合针分子缝合针”）DNADNA连接酶连接酶 基因转移工具（基因转移工具（“分子运输车分子运输车”）基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体1.1 DNA1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具黏性末端黏性末端平末端平末端一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”12345脱氧核苷酸的结构脱氧核苷酸的结构3端5端3端5端 G1234512345 A3,5-磷磷酸二酯酸二酯键键磷酸二酯

3、键磷酸二酯键8限制酶的识别序列限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的限制酶所识别的序列的特点是：特点是：呈现碱基互补呈现碱基互补对称，无论是对称，无论是6个碱基还个碱基还是是4个碱基，都可以找到个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线一条中心轴线，中轴线两侧的双链两侧的双链DNA上的碱上的碱基是基是反向对称重复反向对称重复排列排列的的 ，称为，称为回文序列回文序列中轴线在G与A之间切割EcoRIEcoRI限制酶的作用限制酶的作用大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切开的被限

4、制酶切开的DNA两条两条单链的切口，带有几个单链的切口，带有几个伸出的伸出的核苷酸核苷酸，他们之间正好互补配他们之间正好互补配对，这样的切口叫对，这样的切口叫黏性末端黏性末端。SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的时，切开的DNADNA两条单链的切口，是平整两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫的，这样的切口叫平末端平末端。限制性内切酶作用过程限制性内切酶作用过程SmaISmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G与C之间切割你能推测限制酶存在于原核生物

5、中的你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？作用是什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。制，以防止外来病原物的侵害。限制酶限制酶就是细就是细菌的一种菌的一种防御性工具，防御性工具，当外源当外源DNA侵入时，会侵入时，会利用限制酶利用限制酶将外源将外源DNA切割掉，切割掉，以保证自身的以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切切割外源割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的、使之失效，从

6、而达到保护自身的目的。目的。寻根问底寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其的细胞，其DNADNA分子中分子中不具备这种限制酶不具备这种限制酶的识别切割序列的识别切割序列，或者，或者通过甲基化酶将甲通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的种限制酶也不会使自身的DNADNA被切断，并被切断，并且可以防止外源且可以防止外源DNADNA的入侵。的入

7、侵。 基因的针线：基因的针线：DNA连接连接酶酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶用同种限制酶切割切割ATGCATGC连接酶连接连接酶连接磷酸二酯键磷酸二酯键DNADNA连接酶的作用过程：连接酶的作用过程：二、二、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”作用部位：作用部位：（扶手）（扶手）（梯子）（梯子）核苷酸分子的连接：核苷酸分子的连接：ATGCATGCDNADNA聚合聚合酶连接单酶

8、连接单链，把单链，把单个脱氧核个脱氧核苷酸连接苷酸连接到到DNADNA片片段上段上？DNA聚合酶和聚合酶和DNA连接酶有连接酶有何相同点和不同点？何相同点和不同点？DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶连接连接DNA链链连接部位连接部位双链双链在两在两DNADNA片片断之间形成断之间形成磷酸二脂键磷酸二脂键单链单链将单个核苷酸加将单个核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片断片断33末端形成末端形成磷酸二脂键磷酸二脂键DNA连连接酶接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同点点作用作用实质实质化化学学本本质质不不同同点点模板模板作用作用对对象象 作用作用结结果果用途用途都能催化形成都能催化形成磷酸二酯键磷酸二

9、酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重组组DNA分子分子形成形成DNA的一条的一条链链基因工程基因工程DNA复制复制DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较只能将只能将单个核苷单个核苷酸酸连接到已有的连接到已有的DNADNA片段上，形片段上，形成磷酸二酯键成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键E.coliDNAE.coliDNA连接酶：连接酶：连接黏性末端连接黏性末端T T4 4DNADNA连接酶：连接酶： 连接黏性末端连接黏性末端 平末端平末端DNADNA连接酶种类连接酶种类三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子

10、运输车”1.载体的作用载体的作用2.载体的必要条件载体的必要条件3.3.载体的种类载体的种类质粒质粒病毒：病毒：、动植物病毒等、动植物病毒等 大肠杆菌的质粒：大肠杆菌的质粒： 最常用的质粒是最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因。中常含有抗药基因。质粒的存在与否对宿质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定主细胞生存没有决定性作用，但复制只能性作用，但复制只能在宿主细胞内成。在宿主细胞内成。基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”能复制并带能复制并带着插入的目着插入的目的基因一起的基因一起复制复制有切割位点有切割位点有标记基因有标记基因的存在，

11、将的存在，将来可用含青来可用含青霉素的培养霉素的培养基鉴别。基鉴别。基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”小结基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性(识别序列识别序列)切开切开DNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键DNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键种类种类E.coliDNA连接酶连接酶T4 DNADNA连接酶连接酶运载运载工具工具具备的具备的条件条件1、2、3、4、5、质粒、质粒、噬菌体、动植物病毒噬菌体、动植物病毒第二节第二节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序细胞的基因结构细胞

12、的基因结构原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子能够编码蛋白质的序列能够编码蛋白质的序列不能够编码蛋白质的序列不能够编码蛋白质的序列内含子：内含子： 外显子：外显子： 一、目的基因的获取一、目的基因的获取 目的基因主要是指目的基因主要是指_ 获取目的基因的常用方法获取目的基因的常用方法 从基因文库

13、中获取从基因文库中获取（基因组文库，部分基因文库）（基因组文库，部分基因文库） 利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（变性，复性，延伸）（变性，复性，延伸） 通过通过DNADNA合成仪用化学方法直接人工合成合成仪用化学方法直接人工合成编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因基因文库基因文库基因组文库基因组文库部分基因文库（如部分基因文库（如:cDNA:cDNA文库）文库）1. 1.基因文库基因文库 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，

14、称为基因文库种生物的不同基因，称为基因文库（一）从基因文库中获得目的基因（一）从基因文库中获得目的基因2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法鸟枪法：鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接载入与载体连接载入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离（直接分离法）（直接分离法）（一）从基因文库中获得目的基因（一）从基因文库中获得目的基因反转录法：反转录法： 以目的基因转录成以目的基因转录成的信使的信使RNARNA为模板，反为模板，反转录成互补的单链转录成互补的单链DN

15、ADNA，然后在酶的作用下合成然后在酶的作用下合成双链双链DNADNA，从而获得所，从而获得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA杂交双链杂交双链( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反转录酶反转录酶核酸酶核酸酶H H2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA( (目的基因目的基因) )（一）从基因文库中获得目的基因（一）从基因文库中获得目的基因（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核

16、酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制模板模板DNADNA四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-959

17、0-95）：）：目的基因目的基因DNADNA受热变性，解链受热变性，解链b b、复性（、复性（55-6555-65）：）：引物与单链互补结合引物与单链互补结合c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：）：合成链在合成链在DNADNA聚合酶作用下进行延伸聚合酶作用下进行延伸（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因三、根据已知的氨基酸序列合成三、根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：根据已知蛋白质的氨基根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的酸序列，推测出相应的信使信使RNARNA序列，然后按序列，然后按照碱基互补配对原则，照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的

18、推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成1. 1.用一定的用一定的_切割质切割质粒，使其出现一个切口，露粒，使其出现一个切口，露出出_。2.2.用用_切断目的切断目的基因，使其产生基因，使其产生_。3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组DNADN

19、A分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶切口切口DNADNA连接酶连接酶相同的黏性末端相同的黏性末端二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种4.4.过程过程: :二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建5.5.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +

20、标记基标记基因因二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建基因表达载体的组成：基因表达载体的组成： 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因启动子启动子：一段有特殊结构的：一段有特殊结构的DNADNA片段，位于基因的首端，片段，位于基因的首端，是是RNARNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位。终止子终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNADNA片段，使转录在所需要的地方停止下来。片段，使转录在所需要的地方停止下来。标记基因标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，

21、从而将含有目的基因的细胞筛选出来。从而将含有目的基因的细胞筛选出来。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建小结：小结：一、获取目的基因的常用方法一、获取目的基因的常用方法从基因文库中获取从基因文库中获取（鸟枪法构建基因组文库，逆转录法构建（鸟枪法构建基因组文库，逆转录法构建部分基因文库，目的基因在细胞部分基因文库，目的基因在细胞内内复制）复制）利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（目的基因在细胞（目的基因在细胞 外外复制）复制）通过通过DNADNA合成仪用化学方法直接人工合合成仪用化学方法直接人工合成成质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏

22、性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种过程过程: :二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基标记基因因二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建基因工程的基本操作程序第二课时基因工程的基本操作程序第二课时转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农

23、杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法农杆菌转化法（1 1）农杆菌介绍）农杆菌介绍（2 2）原理及适用范围）原理及适用范围三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受

24、体细胞 显显微注射法：微注射法：转转基因基因动动物中采用最多，最物中采用最多，最为为有有效的方法效的方法 操作程序：操作程序：表达载体提纯表达载体提纯从雌性动物体内取出卵从雌性动物体内取出卵显微注射显微注射胚胎早期培养胚胎早期培养胚胎移植胚胎移植显显微微注注射射仪仪固定固定吸管吸管微量注微量注射针射针针尖极细（针尖极细（0.10.1至至0.5m0.5m） 3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1 1）常用大肠杆菌：）常用大肠杆菌： （2 2）大肠杆菌的转化方法）大肠杆菌的转化方法 首先用首先用CaCa2+2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围处理细胞，使细胞处于一种能吸收

25、周围环境中环境中DNADNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体细胞。第二步是将重组表达载体DNADNA分子溶于缓冲分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收细胞吸收DNADNA分子，完成转化过程。分子，完成转化过程。检测检测鉴定：鉴定：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗

26、病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因方法方法DNADNA分子杂交分子杂交复性复性RNADNA检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA方法方法检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法抗原抗体杂交抗原抗体杂交鉴定

27、：鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程程序总结基因工程程序总结一、获取目的基因的常用方法一、获取目的基因的常用方法从基因文库中获取从基因文库中获取（鸟枪法构建基因组文库，逆转录法构建（鸟枪法构建基因组文库，逆转录法构建部分基因文库，目的基因在细胞部分基因文库，目的基因在细胞内内复制）复制）利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（目的基因在细胞（目的基因在细胞 外外复制）复制）通过通过DNADNA合成仪用化学方法直接人工合合成仪用化学方法直接人工合成成基因表达载体的组成：基因表达载体的

28、组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基标记基因因二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞检测检测鉴定：鉴

29、定：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1 1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 A A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列序列B B、质粒是基因工程中唯一的运载体质粒是基

30、因工程中唯一的运载体 C C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接限制酶切点，以便与外源基因连接D D、基因控制的性状都能在后代表现出来基因控制的性状都能在后代表现出来C C随堂练习随堂练习2 2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A A、能复制能复制 B B、有多个限制酶切点有多个限制酶切点 C C、具有标记基因具有标记基因 D D、它是环状它是环状DNADNAD D随堂练习随堂练习3 3）有关基因工程的叙述中，错误的是）有关基因工程的叙述中，错误的是 A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、 运载体和目的基因用同一种限制酶处理运载体和目的基因用同一种限制酶处理A A随堂练习随堂练习4 4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 A A、限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成重组质粒的形成在细胞内完成C C、质粒都可作为运载