生物化学实验指导

1、生物化学实验指导重庆邮电学院生物信息学院前 言 生物化学是一门比较年轻的实验科学, 近年来发展相当迅速，其任何进展都是以实验为基础的。生化实验手段不仅推动了本学科的进展，而且被兄弟学科利用，促进了各学科的共同发展。生化实验技术的学习已经成为理解近代生命科学的重要基础之一。为了提高生化教学质量，使同学们了解必要的生化实验技术，进行一定的基本技能、基本操作训练，培养同学们独立操作、分析问题和解决问题的能力，我们借鉴兄弟院校的经验编写了这本 生物化学实验指导，供我院开设的各专业选用。 由于我们主客观条件所限，而且编写时间仓促，肯定会有不少缺点和错误，请提出批评意见，帮助我们不断改进教学。 编者 李茂

2、言 2002年6月目录前 言2实验一 生化实验基本操作5附：无蛋白质血滤液的制备9实验二 缓冲溶液10实验三 功能基实验13实验四 糖的性质实验17实验五 蛋白质的性质实验19实验六 蛋白质含量的测定（凯氏定氮法）22实验七 氨基酸的纸层析24实验八 凝胶层析法分离血红蛋白与糜蛋白酶28实验九 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳31实验十 肝组织核酸的分离与鉴定33实验十一 核酸的定量分析36实验十二 温度、pH等对酶促反应速度的影响39实验十三 碱性砱酸酶Km数值的测定42实验十四 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制44实验十五 胡萝卜素的柱层析分离法46实验十六 比色分析法及7220型分光光度计的原理

3、和使用48附:应用比色分析法绘制测定无机磷的标准曲线54实验十七 维生素C的提取与定量55实验十八 血中葡萄糖含量的测定57实验十九 糖酵解60实验二十 肝糖原的提取与鉴定62实验二十一 血清总胆固醇的测定64实验二十二 肝的生酮作用66实验二十三 薄膜层析法分离血清脂类68实验二十四 血清甘油三酯的测定70实验二十五 氨基移换作用72实验二十六 血清谷丙转氨酶的测定74实验二十七 血浆二氧化碳结合力的测定77实验二十八 维生素C的定量测定79实验三十 粘多糖肝素钠效价的测定85实验三十一 细胞色素C的制备和测定88实验三十二 枯草杆菌碱性磷酸酶的制备及酶活力的测定92实验三十三 酯酶的分离、

4、纯化与活性测定96实验三十四 蛋白质浓度测定紫外线(UV)吸收法101实验三十五 核酸浓度测定紫外线(UV)吸收法105实验三十六 酵母RNA提取与地衣酚显色测定法108实验三十七 二苯胺法测定DNA111实验三十八 植物DNA的提取113实验三十九 鼠肝DNA的制备115实验四十 DNA片段的琼脂糖凝胶电泳120附：琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段122实验四十一 SDSPAGE测定蛋白质的相对分子量127实验四十二 蛋白质印迹免疫分析131实验四十三 大鼠肝总磷脂的提取及薄层色谱分析134实验四十四 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点137实验四十五大蒜细胞SOD的提取与分离141实

5、验四十六 离子交换柱层析分离核苷酸143实验四十七 离子交换柱层析法分离氨基酸151实验四十八 卵磷脂的提取和鉴定153实验四十九 植物组织中丙二醛含量的测定154实验一 生化实验基本操作一. 玻璃仪器的洗涤在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的重要环节。洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，无水珠附着在玻壁上。 常用的洗涤方法：1.一般仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗涤剂仔细刷洗。然后用自来水反复冲洗，最后用少量蒸馏水冲洗23次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干备用。2.容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后应及时用自来水多次冲洗，细心检查洁净程度，根

6、据挂不挂水珠采取不同处理方法。（1）如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、干燥，方法同上；（2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡46小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后干燥。3.粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方法：（1）先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗；（2）也可用1%氨水浸泡，使血浆溶解，然后再依次用1%稀盐酸溶液、自来水冲洗；（3）以上二法如达不到清洁要求，可浸泡于重铬酸钾洗液46小时，再用大量自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗23次。4.新购置的玻璃仪器，应先置于12%稀盐酸溶液中浸泡26小时，除去附着的游离碱，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏

7、水冲洗23次。5.凡用过的玻璃仪器，均应立即洗涤，久置干涸后洗涤十分困难。如不能及时洗涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待后按常规处理。 使用重铬酸钾洗液（以下简称洗液）时应注意以下几点：1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干。否则会因洗液被稀释而降低洗液的氧化力。2.Hg2+、Ba2+、Pb2+ 等离子可与洗液发生化学反应，生成不溶性化合物沉积在容器壁上。因此，凡接触过上述离子的容器，应先除去上述离子（可用稀硝酸或510%EDTA钠清除）。3.油类、有机溶剂等有机化合物可使洗液还原失效。因此，容器壁上附有大量油类、有机物时，应先除去。4.洗液的酸性和氧化性很强，使用时应格外注意，千万不

8、要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤或烧坏。5.洗液颜色由深棕色变为绿色时，说明洗液已经失效，应停止使用，更换新液。因重铬酸变成硫酸铬后不再具有氧化性。注：重铬酸钾洗液的配制 取重铬酸钾20g溶于20ml蒸馏水中，加热至沸。冷却后再将200ml浓硫酸慢慢加入，边加边搅拌。注意：此时可产生高热。为防止容器破裂，应选用耐酸搪瓷缸或耐高温的玻璃器皿，切忌用量筒及试剂瓶等配制。为防止洗液吸收空气中的水分而被稀释变质，洗液应贮存于带盖的容器中。当清洁效力降低时，再加入少量重铬酸钾及浓硫酸就可继续使用。二. 吸量管的使用 吸量管和定量吸(移)液器(微量加样器)均为用来转移一定体积溶液的量器。 吸量管：生化实验中

9、常用的有三种，最常用的是刻度吸量管。1.刻度吸量管：刻度吸量管的种类： 按容量规格来分，有0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、5、10ml等数种。其精密度按不同的容积可达移取量的0.11%。通常将管身标明的总容量分刻为100等分。因此，10mlml；1mlml,其余类推。 按“零”点位置来分，有“O”点在吸量管上端的（即读数从上而下逐渐增大），也有“O”点在吸量管下端的（读数从下而上逐渐增大)。两种标示方法，在使用时各有方便之处。 按刻度方法来分，刻度吸量管也有两种，一种是刻度刻到尖端的，将液体放出时，应吹出残留在吸量管尖端的少量液体(我实验室的刻度吸量管全部是这一种)，另一种是刻度不刻

10、到尖端的。 刻度吸量管的正确使用方法：用右手拇指和中指夹住管身，将吸量管的尖端伸入试液深处，左手持洗耳球把试液吸入管内至高过刻度以上时，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制试液的泄放。吸液后应尽量使吸量管保持垂直，使右眼与刻度等高，稍微轻抬食指或轻轻转动吸量管，使试液面缓慢降落，至管内试液弯月面的最低点与吸量管的刻度线相齐为止。然后将吸量管插到需加试剂的容器中，让尖端与容器内壁靠紧，松开食指让液体流出。液体流完后再等15秒钟，捻动一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，则吹出尖端的液体后再捻转一下吸量管移去）。 使用刻度吸量管的注意事项： 选择适当规格的吸量管：吸量管的最大容积应等于或略大于所需容

11、积（ml数）。 仔细看清吸量管的刻度情况：刻度是否包括吸量管尖端的液体？读数方向是从上而下，还是从下而上？ 拿吸量管时，刻度一定要面向自己，以便读数。 吸取试剂时应注意三点：一是先吹去吸量管内可能存在的残留液体，二是将吸量管插入试剂液面深部(以免吸液过程中因液面降低而吸入空气产生气泡或管内试剂进入洗耳球)，三是使用洗耳球(不可直接用口吸)。 按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。 吸取粘滞性大的液体(如血液、血浆、血清等)时，除选用合适的吸管(奥氏管)外，应注意拭净管尖附着的液体，尽量减慢放液速度(用食指压力控制)，待液体流尽后吹出管尖残留的最后一滴液体。 使用的吸量管应干净、干燥无水。如急用

12、而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免试剂被稀释。 2.移液吸量管：也有两种，常见的一种是吸量管的上端只有一个刻度，另一种是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狭窄处也有一刻度线。无论哪一种，在使用时将量取的液体放出后，只需将吸量管的尖端触及受器壁约半分钟即可，不得吹出尖端的液体。3.奥氏吸量管：准确度最高，使用时必需吹出留在尖端的液体。 定量吸(移)液器(微量加样器)：定量吸液器是吸量管的革新产品。由塑料制成。目前，因产地厂家不同其质量、价格差异十分悬殊。 1.定量吸液器的优点：使用方便，取、加样迅速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品（只换吸嘴即可）。2.定量吸液器的类型：有两种类型

13、。 固定式：只能取加一定容量的试剂，不能随意调节取加样量。其规格有10l、20l、25l、30l、50l、100l、200l、250l、300l、400l、500l、1000l等。 可调式：在一定容量范围内可根据需要进行调节取加样量。例如规格为50200l的可调式定量吸液器，可以在50到200l的范围内根据需要调节成设计容许的各种取加样容量（60l、85l、110l、170l、200l等）。 一般来讲，固定式吸液器比较准确，可调式吸液器使用较为方便。3.定量吸液器的使用方法： 选择适当的吸液器。吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要轻轻旋紧一下，以保证结合严密。 持法：右手四指（除大拇指外）并拢

14、握住吸液器外壳（使外壳突起部分搭在食指近端），大拇指轻轻放在吸液器的按钮上。 取样(吸液)：用大拇指按下按钮到第一停止点，以排出一定容量的空气，随后把吸嘴尖浸入取样液内，徐徐松开大拇指，让按钮慢慢自行复原，取样即告完成。 排液：将吸液器的吸嘴尖置于加样容器壁上，用大拇指慢慢地将按钮按下到第一停止点，停留1秒钟（粘性较高的溶液停留时间应适当延长）。然后再把按钮按到第二停止点上，让吸嘴沿管壁向上滑动。当吸嘴尖与容器壁或溶液离开时，方可释放按钮，使其恢复到初始位置。 吸液器用后应及时取下吸嘴。将吸嘴用自来水冲洗后浸入盛水的容器内（以防干涸），待实验结束后集中仔细清洗。三. 溶液的混匀 混匀的目的：

15、使反应体系内的各种物质分子很好地互相接触，充分进行反应；使欲稀释的溶液成为浓度均一的溶液。 混匀的方法通常有以下几种： 使盛器作离心运动。 左手持试管上端，用右手指轻击试管下半部，使管内溶液作旋转运动。 利用旋涡混合（振荡）器混匀。 不得已时可用干燥清洁的玻璃棒搅匀。 混匀的注意事项：防止盛器内的液体溅出或被污染。严禁用手指堵塞管口或瓶口震荡混匀。 四. 离心机的使用 离心法是分离沉淀的一种方法。它是利用离心机转动产生的离心力，使比重较大的物质沉积在管底，以达到与液体分离的目的。因液体在沉淀的上部，故称清亮的液体部分为上清液。 电动离心机的使用方法： 1.将欲离心的液体，置于离心管或小试管内。

16、并检查离心管或小试管的大小是否与离心机的套管相匹配。 2.取出离心机的全部套管，并检查套管底部是否铺有软垫，有无玻璃碎片或漏孔（有玻璃碎片必须取出，漏孔应该用蜡封住）。检查合格后，将盛有离心液的两个试管分别放入套管中，然后连套管一起分置于粗天平的两侧，通过往离心管与套管之间滴加水来调节两边的重量使之达到平衡。 3.将已平衡的两只装有离心管的套管，分别放入离心机相互对应的两插孔内。盖上离心机盖。打开电源开关。逐档扭动旋钮，缓慢增加离心机转速，直至所需数值。达到离心所需时间后，将转速旋钮逐步回零，关闭电源，让离心机自然停止转动后（不可人为制动），取出离心管。附：无蛋白质血滤液的制备一. 实验目的

17、通过无蛋白质血滤液的制备，练习玻璃仪器的洗涤、吸量管的使用、溶液的混匀及离心机的使用等基本操作。二. 实验原理 在生化分析中有时为了避免蛋白质的干扰，常用沉淀蛋白质的试剂除去血液中的蛋白质。这种在血液中加了沉淀剂，经离心或过滤得到的上清液或滤液，称为无蛋白质血滤液。常用的蛋白质沉淀剂有：钨酸、钨酸钠与硫酸、三氯醋酸或氢氧化锌等。三. 实验方法和步骤 1. 每人取4支试管和2支离心管，仔细洗涤干净（洗净的标准是什么？）。然后，将其中的1支离心管和1支试管，用气流烘干器烘干，其余的试管和离心管倒置在试管架上。mlmlml，混匀，2/3 mol/Lml，充分混匀后应无鲜红的血块留在管底。（注意：为使

18、血液中的蛋白质全部沉淀，加试剂的顺序切勿颠倒。）3. 混匀后，放置10分钟左右，使蛋白质充分沉淀，此时血液的鲜红色变成褐红色。然后离心5分钟（转速：2000转/分）。4. 取出离心管，将上清液（即血滤液）转移到另一干燥试管内。转移的方法可采用直接倾倒上清液，或用滴管将上清液吸出。最好能一次吸净，否则上清液易混浊。血滤液若有混浊必须重新离心、转移。 注：试剂的配制 （1）10%钨酸钠 （2）2/3 mol/L硫酸：95.6%浓硫酸（比重1.84）37ml 加入963ml蒸馏水中，混匀。 （3）蒸馏水实验二 缓冲溶液 一. 实验目的 掌握配制缓冲溶液的原理和方法，加深对缓冲溶液性质的认识。二. 实

19、验原理由弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸组成的，具有一定的pH值，不因稀释或加入少量强酸或强碱而使其pH值有明显改变的溶液称为缓冲溶液。缓冲溶液的pH值的计算公式为：pH = pKa + lg B- / HB (1)由于：B-= CBVB / V HB= CHB VHB/ V(V为缓冲溶液的总体积，VB和VHB分别为共轭碱和弱酸的体积，CB和CHB分别为混合前的共轭碱和弱酸的摩尔浓度）。代入(1)式，得： pH = pKa + lg (CBV B / CHBVHB ） (2)当CB = CHB 时，则得： pH = pKa + lg ( VB/ VHB ） (3)利用 (2) 或 (3) 式，可

20、配制具有一定pH值的缓冲溶液，也可计算出一定浓度和体积的弱酸及其共轭碱溶液配制的缓冲溶液的pH值。由(1) 式可知：缓冲溶液的pH值取决于B/HB的比值（缓冲比）。因此，稀释缓冲溶液时几乎不影响缓冲溶液的pH值。由于缓冲溶液中有抗酸成分和抗碱成分，故加入少量强酸或强碱，其pH值几乎不变。但所有缓冲溶液的缓冲能力都有一定限度，即各具有一定的缓冲容量。如果加入的强酸或强碱超过了缓冲容量，则可引起溶液pH值的急剧改变，失去缓冲作用。三. 实验方法和步骤 缓冲溶液的配制：取洁净的大试管3支，编号，放在试管架上，然后用10ml刻度吸量管按下表中所示的数量(单位：ml），吸取1/15mol·L-

21、1 Na2HPO4及1/15mol·L-1 KH2PO4加入试管中。 试管号试剂（ml）1231/15mol·L-1Na2HPO41/15mol·L-1KH2PO4PH（计算结果） 计算所配制缓冲溶液的pH值，记入报告中。同时用洁净的玻璃棒蘸取上面配制好的三种缓冲溶液，与精密pH试纸接触，显示颜色与标准色列比较，粗测三种缓冲溶液的pH值。粗测结果是否与计算结果相符？如果不符，应分析原因。 缓冲溶液的稀释：按下表所列顺序作以下实验。比较第3、4管的颜色是否与第2管相同？将观察结果记入报告，并解释出现该现象的原因。 试管号试剂1234自制2号缓冲溶液 (ml)421蒸

22、馏水 (ml)423混合指示剂 (滴)1111溶液显示的颜色 （记录） 缓冲溶液的抗酸、抗碱作用：按下表所列顺序作以下实验。比较加入酸碱后1和2管、3和4管、5和6管、7和8管溶液颜色的是否相同，将观察结果记入报告，并解释出现该现象的原因。 试管号试 剂 1 2 3 4 5 6 7 8蒸馏水 (ml)22自制1号缓冲溶液 (ml)22自制3号缓冲溶液 (ml)22mol·L-1NaCI (ml)22混合指示剂 (滴)111111110.01mol·L-1HCI (滴)11110.01mol·L-1NaOH (滴)1111溶液显示的颜色 （记录） 注：试剂的配制 1

23、/15mol·L-1 Na2HPO4：取g Na2HPO4·2H2O溶于1000ml蒸馏水中，混匀。 1/15mol·L-1 KH2PO4加：取g KH2PO4溶于1000ml蒸馏水中，混匀。 精密pH试纸 蒸馏水 mol·L-1 ml浓盐酸（浓度：37.2%，比重：1.19）溶于900ml蒸馏水中，再加蒸馏水至10000 ml，混匀。 mol·L-1 NaOH：将4.000g NaOH溶于少量蒸馏水中，再加蒸馏水至10000 ml，混匀。 混合指示剂：500ml乙醇中溶解：g溴百里酚蓝，g百里酚蓝，g甲基黄，g酚酞，g甲基红。 混合指示剂的变

24、色范围：pH246810颜色红橙黄绿蓝实验三 功能基实验 一. 实验目的1掌握醇、酚、醛、酮和尿素的化学性质及鉴别法。1. 掌握滴管的使用和加热的方法等基本操作技术。 二. 实验原理 1醇 一元醇是中性化合物。在强氧化剂重铬酸钾的作用下，伯醇可被氧化生成醛或在高温下进一步氧化生成羧酸。仲醇可被氧化生成酮。 醇与羧酸生成羧酸酯，乙酸与异戊醇起酯化反应生成乙酸异戊酯。 具有两个相邻羟基的多元醇与新配制的氢氧化铜反应，使氢氧化铜沉淀消失形成深蓝色的溶液。用此反应可鉴别含有两个相邻羟基的多元醇。 2 酚 酚羟基上的氢原子能部分电离，故酚具有弱酸性，能溶于NaOH溶液中，生成酚盐。 酚类或含有酚羟基的化

25、合物，能与三氯化铁发生各种特有的颜色反应，产生颜色的原因主要是生成复杂的配合物，但具有烯醇结构的化合物也有这个反应。 3 醛和酮 醛和酮都具有羰基，因此它们具有许多相似的化学性质。例如：醛和酮都能与2,4-二硝基苯肼反应，析出2,4-二硝基苯腙黄色结晶（通常，用2,4-二硝基苯肼试剂来检识具有羰基结构的化合物，称为羰基试剂）。又因为在醛和酮的分子中，羰基所连接的基团不同，其化学性质又有差异。醛的羰基上连有一个氢原子，化学性质比较活泼，易被弱氧化剂氧化，能与多伦（Tollen）试剂发生银镜反应，能与斐林（Fehling）试剂反应生成砖红色Cu2O沉淀，还能与品红亚硫酸试剂发生颜色反应。酮则不能发

26、生这些反应。因此，常用多伦和斐林试剂区别醛和酮。 具有：CH3-CO-R(H) 结构的醛、酮或CH3-CHOH-R(H) 结构的醇都能发生在碱性溶液中与碘作用生成碘仿的反应。碘仿为黄色固体，有特臭，易识别，此反应称为碘仿反应。 丙酮在碱性溶液中能与亚硝酰铁氰化钠作用显红色，此反应用作检验丙酮的存在。 4尿素 将尿素加热至熔点以上，则两分子尿素脱去一分子氨而生成缩二脲（双缩脲），缩二脲分子中含有两个肽键。凡化合物分子中含有两个或两个以上肽键时，在碱性溶液中均可和铜盐生成紫红色的配合物，这种显色反应称为缩二脲反应。 三. 实验方法和步骤 基本操作 1 滴管的使用：需要少量液体试剂时，可用橡皮头滴管

27、从滴瓶中吸取。方法是先取出滴管轻捏橡皮头，排去滴管内空气，然后插入试剂中，放松手指，液体即能吸入管中，取出（注意：滴管应保持直立勿倒转，以免液体流入橡皮头内），移入容器，勿使滴管口触及器壁，以免弄脏管口，而把杂质带回试剂瓶中以致弄坏全部试剂。轻捏橡皮头使液体滴入容器，大约20滴相当于1ml。 2 加热：化学反应速度与反应时的温度有密切关系，在室温时有的反应很慢，升高温度可加速反应的进行。所以，加温是一项常用的基本操作技术。加热方法如下： 试管加热时，一般用试管夹夹住试管上部，先使管内液体普遍受热，然后在底部加热，并不断上下移动和振荡。一定要使溶液受热均匀，否则会突然溅出。加热时管口不要朝着自己

28、或别人。 烧瓶或烧杯加热时，须放在石棉网上，否则会因受热不匀而裂损。附有铁环和铁夹的铁架，是常用来固定各种容器的器具。 瓷制器皿可以用灯火直接加热。溶液的蒸发浓缩及焙干一般用蒸发皿。无论那种器皿，在加热前都要把外面的水擦干。强热后的器皿不可与冷的铁器或桌面接触，应把它放在石棉网上。 有机化学反应速度较慢，需长时间加热，而且许多是易燃的有机溶剂（如：乙醚、乙醇等），因此严禁用明火直接加热。应选用间接加热（水浴加热、油浴加热）的方法。 水浴加热：适于加热到100以下的反应。目前，一般是将容器浸入事先调好温度的电子控温水浴锅中保温。也可将盛水的较大容器（如：大烧杯等）加热到要求温度，再把欲加温的试管

29、浸入热水中。 油浴（或石蜡浴）加温：适于加热到100250的反应。 实验方法 1醇的氧化：取3支小试管，编号，各加入0.5%重铬酸钾溶液2滴和3mol·L1H2SO41滴，然后分别加入10滴95%乙醇、异丙醇和叔丁醇，将各试管摇匀，3分钟后观察有何现象。 2 醇的酯化反应：在1支干燥的大试管内加入2ml醋酸、2mlml浓硫酸，然后将试管用试管夹夹好后放在水浴中加热10分钟。加热完毕，将试管内的反应生成物倒入盛有冷水的另1支大试管中，观察有无分层现象，能否闻到愉快的香味？ 3醇与氢氧化铜的反应：于一试管中加入 2%CuSO4溶液6滴，再滴入5%NaOH溶液8滴，使Cu(OH)2完全沉淀

30、下来，将悬浊液的一半倒入另一试管，两试管在振摇下分别加入2滴甘油和乙醇，观察结果，并加以比较。 4 酚的酸性：在1支小试管中加入绿豆大小的一块固体苯酚，再加1 ml蒸馏水充分振荡，得一乳浊液，然后滴入5%NaOH溶液至苯酚完全溶解。再此溶液中再加入3mol·L1 H2SO4溶液呈现酸性，观察有何变化。 5 酚与三氯化铁作用：取试管4支，分别加入2%苯酚溶液、0.2%邻苯二酚溶液、1%间苯二酚溶液、1，2，3-苯三酚溶液各5滴，每支试管各加入1%FeCI3溶液1滴，摇匀。记下各管中所产生的颜色。 6 醛、酮与2,4-二硝基苯肼的反应：取2支试管，各加入1ml 2,4-二硝基苯肼溶液，然

31、后分别加入34滴乙醛与丙酮，用力振荡。如无沉淀生成，可静置510分钟，观察有无沉淀生成。必要时用玻璃棒摩擦管壁，以促使晶体析出。 7 醛、酮与品红亚硫酸试剂的反应：取试管2支，各滴入10滴品红亚硫酸试剂，在第一管加入23滴乙醛，第二管加入23滴丙酮，观察两管有何现象发生。 8 丙酮的检识（亚硝酰铁氰化钠Na2Fe(CN)5NO试验）：取1支试管，加入1滴5%的丙酮水溶液，然后加入5%亚硝酰铁氰化钠和10%NaOH溶液各2滴，观察呈现何种颜色？9尿素的特殊反应缩二脲反应 缩二脲的制取：取1支干燥试管放置g尿素（绿豆大小），小心加热至熔化，有氨的气味放出（闻其气味），继续将试管加热时，试管内的物质

32、逐渐凝固，即成为缩二脲。放冷留作下面实验用。 缩二脲反应：在上述试管中，加入3ml热水和5%NaOH溶液10滴，尽量使固体溶解，然后试管加入3滴2 % CuSO4溶液，振荡，观察试管有何颜色变化。 注：试剂的配制 （1）浓硫酸、醋酸、95%乙醇、异丙醇、叔丁醇、甘油、苯酚、乙醛、丙酮、尿素。 （2）3mol·L1H2SO4 （3）0.5%重铬酸钾溶液 （4）5%NaOH溶液 （5）2%苯酚溶液 （6）2%邻苯二酚溶液 （7）1%间-苯二酚溶液 （8）2%邻苯二酚溶液 （9）2%1,2,3-苯三酚溶液 （10）1%FeCI3溶液 （11）5%丙酮水溶液 （12）5%亚硝酰铁氰化钠溶液

33、(13 ) 2%CuSO4溶液 (14) 2,4-二硝基苯肼试剂：将2g2,4-二硝基苯肼溶于15ml浓硫酸中，加入150ml95%乙醇，以蒸馏水稀释至500ml，搅拌使其混合均匀，必要时过滤供用。 （15）品红亚硫酸试剂：将g品红盐酸盐研细，溶于含2ml浓盐酸的200ml蒸馏水中，再加入2g亚硫酸氢钠，搅拌后静置，直至红色腿去。如溶液最后仍呈黄色，则加入g活性炭，搅拌后过滤，把试剂保存在严密的棕色试剂瓶中。实验四 糖的性质实验一. 实验目的 加深对单糖、二糖、多糖化学性质的认识，进一步体会糖类化合物的分子结构与其化学性质的关系。二. 实验原理 糖是多羟基醛、多羟基酮或它们的缩合物。单糖及分子

34、中含有半缩醛（酮）羟基的二糖都具有还原性，能将班氏试剂还原成砖红色的Cu2O沉淀。蔗糖等不含有半缩醛（酮）羟基的糖则无还原性。但蔗糖经水解生成了葡萄糖和果糖，因而水解液具有还原性。多糖是由许多单糖缩合而成的高分子化合物，无还原性。但多糖在酸存在下加热水解，可生成单糖，随之具有还原性。淀粉为一多糖，经水解先生成糊精，再水解成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖，因此水解液也具有还原性，能与班氏试剂发生反应。淀粉遇碘显蓝色，此反应很灵敏，常用于检验淀粉或碘。糖在浓酸存在下，可与酚类化合物产生颜色反应。糖在浓硫酸的作用下与-萘酚反应显紫色，常用于糖类化合物的检出。己酮糖与间-苯二酚-盐酸试剂反应很快出现鲜红

35、色，而己醛糖显色缓慢，两分钟后可出现微弱的红色，因此常用于区别酮糖（果糖）和醛糖（葡萄糖）。三. 实验方法和步骤 糖的还原性：取5支大试管，编号后各加入1ml班氏试剂，再分别加入2%葡萄糖、2%果糖、2%麦芽糖、2%蔗糖和2%淀粉溶液各10滴。振荡后，将试管用橡皮筋捆好放入沸水浴中，加热35分钟，观察那几个试管中生成砖红色沉淀。 蔗糖的水解：取2支大试管，各加入2%蔗糖溶液1ml，然后于一支试管中加入3mol·L1H2SO42滴，将此支试管置于沸水浴中加热510分钟，冷却后，用10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止。将两支试管各加入班氏试剂1ml，再在沸水浴中加热35分钟，观察

36、并比较两管的结果。 淀粉与碘的作用：取1支大试管加10滴2%淀粉溶液和1滴0.1%碘液，观察呈现的颜色。然后将此试管放入沸水浴中加热510分钟，观察有何现象。取出试管，放置冷却，又有何变化，为什么？ 淀粉的水解：取1支大试管，加2%淀粉溶液2ml ,再加入浓盐酸3滴，在沸水浴中加热1015分钟，加热时每隔12分钟取出1滴反应液，置于白瓷滴板上，加1滴碘液，注意观察其颜色的变化过程，直到无蓝色出现为止。取出试管，冷却后，用10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止，加入班氏试剂510滴，然后在沸水浴中加热35分钟，观察结果。 糖的颜色反应 -萘酚反应：取4支小试管，分别加入2%葡萄糖、2%果糖

37、、2%蔗糖和2%淀粉溶液1ml，然后各加入新配制的-萘酚试剂2滴，混合均匀后，将试管倾斜沿管壁徐徐注入浓硫酸各1ml,切勿摇动。然后竖起试管，静置10分钟，观察两液界面之间出现紫色环。如无紫色环生成，可在水浴中温热后再进行观察。 间-苯二酚反应：取4支大试管，分别加入间-苯二酚-盐酸试剂1ml，然后在三支试管中各加入2%葡萄糖、2%果糖、2%蔗糖溶液5滴，第4支试管留作对照。将4支试管摇匀后，同时放入水浴中加热2分钟，观察各管出现颜色的顺序。 注：试剂的配制 （1） 班氏试剂的配制：称取柠檬酸钠20g，无水碳酸钠g，溶于100ml热水中，在不断搅拌下把含2g硫酸铜晶体的20ml水溶液慢慢加入。

38、溶液应澄清，否则需过滤。 （2）2%葡萄糖 （3）2%果糖 （4）2%麦芽糖 （5）2%蔗糖（所用蔗糖必须纯净） （6）2%淀粉溶液：将2g可溶性淀粉用10ml 蒸馏水调成糊状，加入90ml沸水中煮沸后冷却。 （7）3mol·L1H2SO4溶液 （8）10%Na2CO3 溶液 （9）0.1%碘液：在1g碘和5g碘化钾中，加入尽可能少的蒸馏水使其溶解，然后用蒸馏水稀释为1000ml。 （10）浓盐酸 （11）-萘酚试剂的配制：将10g-萘酚溶于95%乙醇中，再用同样的乙醇稀释至100ml，贮于棕色瓶中，一般用前才配制。 （12）浓硫酸 （13）间-苯二酚-盐酸试剂的配制：将g间-苯二酚

39、溶于50ml浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100ml。实验五 蛋白质的性质实验 一. 实验目的 加深对蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点的认识。 二. 实验原理蛋白质分子中的氨基酸是以肽键连接的，因此蛋白质具有缩二脲反应。由于蛋白质分子中含有自由氨基，可与茚三酮试剂作用生成紫蓝色化合物，此反应称茚三酮反应。以上呈色反应可用于检验蛋白质。在蛋白质溶液中加入中性盐 (NH4)2SO4、MgSO4、NaCl等时，蛋白质即沉淀析出，这种过程称为盐析作用或盐析。盐析作用包括两种过程：（1）大量电解质破坏了蛋白质的水化层而出现沉淀；（2）电解质中和了蛋白质分子所带的电荷而沉淀。中性盐能否沉淀各种蛋白质常决定于中

40、性盐的浓度、蛋白质的种类、溶液的pH、以及蛋白质胶体颗粒的大小。颗粒大的比颗粒小的容易析出，如球蛋白多在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出，而清蛋白则常在饱和(NH4)2SO4溶液中析出。极性较大的有机溶剂（如：甲醇、乙醇、丙酮等）由于对水的亲和力较大，可破坏蛋白质的水化层使其沉淀；当溶液的pH值大于蛋白质的等电点时，蛋白质带有较多的负电荷，可与重金属离子结合生成不溶性的蛋白盐沉淀；在溶液的pH值小于蛋白质的等电点时，蛋白质带有较多的正电荷，可与酸（如：苦味酸、钨酸、三氯醋酸、磺基水杨酸、偏磷酸等）根离子结合生成不溶性蛋白盐沉淀。当蛋白质解离成两性离子（其分子净电荷为零）时溶液的pH值称为该蛋

41、白质的等电点。酪蛋白溶液在等电点时很不稳定，可以发生沉淀。所以，可以根据相对浊度来测定酪蛋白的等电点的近似值。 三. 实验方法和步骤 茚三酮反应 取小试管1支，加10 %鸡蛋白溶液4滴，蒸馏水10滴和0.2 %茚三酮乙醇液6滴，混匀，在沸水浴中加热510分钟，待冷却后观察溶液的颜色变化。 沉淀反应 盐析：取10%鸡蛋白溶液4ml于小试管中，再加入4ml 饱和(NH4)2SO4溶液，混匀，静置20分钟后，则球蛋白全部析出。离心（2000转/分钟）5分钟，取上清液1ml加固体(NH4)2SO4约ml蒸馏水，观察结果。 重金属盐沉淀蛋白质：取试管1支，加入10%鸡蛋白溶液1ml，及0.5%NaOH溶

42、液1滴混匀，再加入0.5%硫酸锌溶液6滴，观察结果。3 三氯乙酸沉淀蛋白质：取试管1支，加入10%鸡蛋白溶液1ml，然后再加入10%三氯乙酸溶液35滴，观察沉淀的生成。3 蛋白质等电点的测定： 取5个大试管，编号，按下表准确加入试剂，混匀。 试管号试 剂 (ml)12345蒸馏水mol/L醋酸mol/L醋酸1. 0mol/L醋酸0.5%酪蛋白醋酸钠溶液（加入方法见后）溶液pH值浊度比较 各试管加入酪蛋白醋酸钠溶液时，应随加随摇（切勿在各管加完后才摇），观察各管浊度。静置1030分钟后，比较各管浊度，用（）多少表示其浑浊程度。沉淀最多而上清液最透明的试管的pH值，即为酪蛋白的等电点。为什么？ 注

43、：试剂的配制 （1）蒸馏水 (2) 10% 鸡蛋白溶液 (v / v ) (3) 0.2 %茚三酮乙醇液 (4) 固体(NH4)2SO4 (5) 饱和(NH4)2SO4溶液： 称取377 g硫酸铵溶于20500ml的蒸馏水中。硫酸铵在20水中的溶解度为754g/L水。配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在，同时可加热助溶。 (6) 0.5% NaOH溶液 (7) 0.5% 硫酸锌溶液 (8) 10% 三氯乙酸溶液 (9) 0.01 mol/L醋酸 (10) 0.1 mol/L醋酸 (11) 1.0mol/L醋酸 (12) 0.5%酪蛋白醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白g，置于50ml容量瓶内

44、，准确地加蒸馏水20 ml及1mol/L NaOH 5ml，摇匀，使酪蛋白溶解，然后准确地加1mol/L醋酸液5ml，最后用蒸馏水稀释至刻度。实验六 蛋白质含量的测定（凯氏定氮法） 掌握凯氏定氮法的原理、操作过程及计算方法，了解其实用意义。 凯（Kyeldahl）氏定氮法是蛋白质含量测定的常用方法，它利用一般蛋白质含氮量较恒定，平均占16左右，并且在一般生物组织中的氮主要存在于蛋白质中，因此测定生物组织中的含氮量可以计算出蛋白质的含量。 凯氏定氮法的定氮原理是将生物样品放在凯氏烧瓶中与硫酸共热进行消化，并加入硫酸钾以升高沸点，以硫酸铜作催化剂。样品中的C、H等元素全部氧化为CO2及水汽挥发掉，

45、有机氮转变为氨并与硫酸结合生成硫酸銨，然后以标准硫酸銨溶液为对照，用茚三酮法测定其含氮量，最后计算出蛋白质的含量。 以甘氨酸为例，化学反应过程如下： CH2NH2COOH + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 （一）蛋白质样品液的制备：取3个干净的凯氏烧瓶，标号为：“样品A”（用于测定样品的总氮量N1）；“样品B”（用于测定样品的的非蛋白氮N2）和“样品C”（作为空白对照）。“样品A”为在0.2ml血清中加入0.8ml蒸馏水；“样品B”为用0.2ml血清制备的血滤液，其方法是：在一个干净的离心管中加入0.3ml血清和0.

46、7ml蒸馏水，摇匀，再加入5三氯醋酸0.5ml，摇匀，静置10分钟后离心（3000转/分，5分钟）取上清液1m供测定用。“样品C”为1 ml蒸馏水。（二）蛋白质样品液的消化：在盛有样品的三个凯氏烧瓶里各加入固体硫酸钾与硫酸铜（31），浓硫酸5ml，玻璃珠二只，混匀。将凯氏烧瓶固定在铁架上置电炉或酒精灯加热（火力不可太旺）。消化架应放在通风橱中或用酸雾收集器收集酸雾。开始有水汽发出，后来冒出浓白烟（SO2）时，调节热源使SO2不致溢出过多。溶液逐渐变成棕色直至黑色，继续加热至瓶中消化液变成澄清的蓝绿色时，消化即完成。待冷却至接近室温时，小心沿管壁加水约10ml稀释消化液，将其倾入25ml容量瓶中

47、，以少量蒸馏水冲洗消化瓶数次，全部倾入容量瓶内，然后用蒸馏水稀释至刻度，反复颠倒混匀。（三） 三酮反应：取干净大试管4只，按下表操作：管 号1234消化液（ml，下同）(NH4)2SO4标准液茚三酮试剂2222混匀，在沸水浴加热30分钟，冷却后，各管加入50乙醇6ml，选用570nm的单色光，用“1号管”调零，测定24号管的吸光度，并记录在本表下一行。吸光度（A） （一） 样品含氮量的计算：N1(mg/ml样品)（A3号管/A2号管）××(1/0.2)×(0.5/25) N2(mg/ml样品)（A4号管/A2号管）××(1/0.2)×

48、(0.5/25)（二） 样品蛋白质含量的计算： 蛋白质含量（g/dl）(N1N2)××100/1000注：1.主要仪器：分光光度计、100ml凯氏烧瓶、25ml容量瓶、玻璃珠（3mm）、电炉等。 硫酸钾与硫酸铜混合物（K2SO4CuSO4·5H2O31）研细混匀。 浓硫酸 50乙醇 醋酸盐缓冲液（pH5.5）：4mol/L醋酸钠溶液与4mol/L醋酸溶液按44357.5（VV）的比例混合。 茚三酮试剂：将2g茚三酮溶解于50ml乙二醇甲醚、25ml醋酸盐缓冲液（pH5.5）及25ml蒸馏水，再加的SnCl2·2H2O（检查pH必须达到5.5）。 硫酸銨标

49、准液（1mg氮/ml）：取适量硫酸銨（AR）置于110烘箱内半小时，使其干燥，继置干燥器内冷却。准确称取此干燥的硫酸銨，溶于少量蒸馏水中，将溶液全部转移入100ml容量瓶内，加浓硫酸1滴，并用蒸馏水稀释至刻度。实验七 氨基酸的纸层析 学习层析技术的原理，掌握纸层析的具体操作。 层析法又称色谱法（Chromatography），色层法或层离法，是近代生物化学实验中广泛应用的一种分离分析技术。层析法是利用混合物（样品）中各组分的理化性质（如溶解度、吸附力、分子的形状、大小、极性、分子所带电荷的性质和数量以及分子表面的特殊基团等）不同，而使各组分借以分离的分析方法。例如一个混合样品含有A（红色）、B

50、（黄色）两个性质相似的组分及其它杂质，用一般的分离方法不能将其分离，因此无法测定A与B的含量。如果将此混合样品加至一个填充了Al2O3吸附剂的玻璃柱中，然后不断地从柱顶加入适当的溶剂，经过一定时间后，发现A在柱的下端，B在柱的中段，其它杂质留在柱的上端，达到了分离的目的，这种分离方法即称为层析法。其中Al2O3吸附剂称为固定相，溶剂称为流动相，填充了固定相的玻璃柱称为层析柱。层析法的分离原理是流动相在柱中往下流动时，已被吸附在柱顶端Al2O3上的A与B部分解吸溶于流动相中，随着流动相向下移动，当遇到新的吸附颗粒时，已解吸的溶质又有部分被重新吸附在Al2O3表面上。就这样，随着流动相的不断加入，

51、在层析柱中不断发生着吸附、解吸、再吸附、再解吸。由于A和B在流动相中的溶解度不同，假若A在流动相中的溶解度略大于B，那么A在柱中的往下的移动速度就略大于B。经过多次反复，微小的差异逐渐变大，一定时间后A和B便在柱上形成两条区带，不溶于流动相的其它组分则仍留在柱子的上端。如果不断地加入流动相，就可以将分离后的组分从柱上先后洗脱下来，依次流出柱外。溶质可以进入固定相又可以进入流动相，这个过程称为分配过程，分配过程进行的程度可以用分配系数（K）表示。K=Cs/Cm（K 是广义的分配系数，Cs是溶质在固定相中的浓度，Cm是溶质在流动相中的浓度）。因此，层析过程可以说是物质在两相间进行分配的过程。由于不

52、同物质的分配系数不同，它们在层析柱中往下移动的速度也就不同，从而达到分离的目的。 层析法由三种分类方法：层析法中总是要有两相，流动相可以是液体也可以是气体。根据流动相所处的状态来分：流动相是液体的称液相层析法（LC），流动相是气体的称气相层析法（GC）。固定相可以是固体也可以是液体，但后者（液体）必须附载在某个固体物质（称为载体或担体）上。因此，根据固定相所处的状态不同，在液相层析法中又可分为液固层析法（LSC）和液液层析法（LLC）；在气相层析法中又可分为气固层析法（GSC）和气液层析法（GLC）。可分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析。 吸附层析法：固定相是固体吸附剂

53、，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。 分配层析法：固定相是液体，利用各组分在两相中的分配系数的差别而分离。 离子交换层析法：固定相是离子交换剂，利用各组分对离子交换剂亲和力的不同而进行分离的方法。 凝胶层析法：固定相是一种多孔性凝胶，利用各组分的分子大小不同，在通过凝胶时受阻滞的程度不同而得到分离。凝胶层析法也称分子筛层析法，凝胶起到分子筛的作用，或对分子大小不同的组分起过滤作用，故凝胶层析又可称为凝胶过滤。 亲和层析法：主要是利用各种待分离组分生物学性质不同的一种层析方法，固定相只对一种待分离组分具有亲和力（高度专一性），借以和没有亲和力的其它组分分离。 可分为：柱层析法、纸层析法、薄层层析法和薄膜层析法。 柱层析法：是将固定相装在柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析法：是用滤纸作为液体的载体，点样后用流动相（又称展开剂）展开，使组分达到分离。 薄层层析法：是将适当粒度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用 流动相