六邻体利用亲和生物素的相互作用特定修饰聚乙二醇化腺病毒载体

1、Hexon-specific PEGylated adenovirus vectors utilizing avidin-biotin interaction 六邻体特异性 聚乙二醇 腺病毒 载体 利用 亲和生物素 相互作用六邻体利用亲和生物素的相互作用特定修饰聚乙二醇化腺病毒载体摘要：聚乙二醇化重组腺病毒（AD）载体不仅使腺病毒抗体避免被中和和被吞噬细胞吸收，而且对于全身给药后腺病毒载体血液保存时间的延长，都成为一种可能。然而，传统的聚乙二醇化导致的腺病毒载体转导活性显着降低，可能是因为聚乙二醇非特异性结合到腺病毒衣壳蛋白，从而抑制了腺病毒载体结合的主要受体柯萨奇病毒受体（CAR）。为了使聚

2、二乙醇化的腺病体载体在传递活动中没有显著减少，生物素结合肽（BAP）插入到六邻体的高变区5（HVR），这个不参与结合CAR，而且聚乙二醇通过亲和生物素的相互作用具体结合到病毒六邻体HVR5上。体外转导实验表明，六邻体特有的聚乙二醇并不会造成腺病毒载体转导率的明显减少，相对于传统的腺病毒载体，在抗腺病毒血清缺少的情况下，尽管生物素结合肽进入HVR5本身，但使得转导效率减少了50倍。在抗血清病毒的存在下，六邻体HVR5中生物素结合肽和腺病毒载体的传导明显受阻；然而，抗血清病毒只是略微的抑制血清与六邻体特异聚乙二醇化腺病毒载体的转导(Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2)。Ad-BAP

3、/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的静脉注射导致延长血液滞留，在肝脏的转导显著减少，并在肿瘤积累；然而，出乎意料的是，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在肿瘤的转导效率几乎在本底水平。关键词：基因疗法，药物释放，基因表达，表面改性，聚乙烯1、 简介重组腺病毒（Ad）载体是最有前途的基因载体，由于其优越的传导能力，被广泛用于临床试验中。虽然在大多数临床试验中使用腺病毒载体，腺病毒载体直接管理靶器官(e.g., tumors) 1,2，发展一种将腺病毒载体系统传送到靶器官的方法是可行的。然而，在实现腺病毒载体系统传送之前，一些问题必须得到解决。首先，腺病毒载体具有较强的向肝性：

4、超过九成的腺病毒载体剂量静脉注射后积累在肝脏3。当肝脏作为靶器官时，此属性看起来是有利的，但是，当其它器官是靶器官时，肝中的腺病毒载体积累应减少，而且，腺病毒载体在血液循环的时间应延长，以使系统传递到靶器官。另外，抗腺病毒抗体在成年人中的高感染率已经报道4,5，并且在全身用药后中和抗腺病毒抗体明显抑制住腺病毒载体在体内的传导6。经中和抗腺病毒抗体的腺病毒载体应避免调解具有抗腺病毒抗体患者的有效传导。为了解决上述问题，共价键共轭聚乙二醇（PEG）（PEGylation）的腺病毒载体已经进行7-12。聚乙二醇是一种亲水性聚合物，通常用于改善蛋白质和纳米粒子的药动力学特性13,14。聚乙二醇化蛋白质

5、和脂质已经投入市场。结果在共轭的聚乙二醇化剂周围形成了水化领域，它从吞噬细胞和血清蛋白的相互作用中屏蔽了聚乙二醇化剂 ，包括中和抗体。此外，聚乙二醇介导从吞噬细胞和血清蛋白中逃逸，结果使含聚乙二醇化剂的血液的半衰期延长。血液的半衰期延长也可以引起通透性的增强和保留（EPR）的效果，其中由于在肿瘤血管渗透，聚乙二醇化药物传递到肿瘤效率加强15。以往的研究已经表明，聚乙二醇化腺病毒载体随着血液循环时间的延长而延长，在肝脏的摄取减少，从中和的抗腺病毒抗体中逃逸，并在肿瘤中增加其转导效率7-9.11,12。此外，先天性免疫不仅是由腺病毒载体引起的，聚乙二醇化腺病毒载体也使其提高9。但是，聚乙二醇化腺病

6、毒载体的主要缺陷是，传统的聚乙二醇化大大降低了腺病毒载体的传导效率7,9。在几乎所有的聚乙二醇化腺病毒载体的研究中，聚乙二醇已经共价偶联结合酰胺的腺病毒衣壳蛋白的赖氨酸残基，这就导致了对聚乙二醇可能与六邻体或者是腺病毒载体的纤维蛋白随机进行共轭。聚乙二醇的纤维蛋白，它与主要受体结合（柯萨奇病毒腺病毒受体，CAR），显著抑制柯萨奇病毒腺病毒受体的附件，结果使其的转导活性显著减少。在腺病毒衣壳蛋白中聚乙二醇化网络无法通过传统的聚乙二醇进行控制。为了使聚乙二醇与腺病毒载体的转导效率不受到干扰，聚乙二醇应该有选择性的与六邻体共价结合，这不包含柯萨奇病毒的相互作用。在这项研究中，为了使聚乙二醇有选择性的

7、结合到六邻体，我们把生物素结合肽加入到六邻体高变区（HVR）5，而且，聚乙二醇通过亲和素复合物的形成于六邻体HVR5进行特殊结合。2、 材料与方法2、1 小鼠和细胞雌性BALB/c小鼠，年龄：5-6周，日本SLC（滨松，日本）。A549细胞（人肺腺癌细胞源性肺癌）在含有10%小牛血清和抗生素的鹰的最小培养基中进行培养。甲基-A细胞（鼠标纤维肉瘤细胞株）通过腹腔移植维持到同基因品系小鼠体内（BALB/c）。2、2 质粒和腺病毒载体 在这项研究中的腺病毒载体用外体连接构建了一个完善的方法16-18。腺病毒载体质粒，pAdHM62-BAP-L2，构造如下：pAdHM6219，其中包含了在病毒六邻体H

8、VR5编码区的独特的Xbal位点，被Xbal消化和寡聚糖编码的生物素结合肽结扎20，创建pAdHM62-BAP。随后，pAdHM62-BAP被I-Ceul/PI-Scel消化和I-CeuI/PI-SceI-设计的Pcmvl1a21结扎，其中包含了CMV启动子驱动的萤火虫荧光素酶基因表达盒，在pAdHM62-BAP-L2中产生。寡核苷酸编码的生物素结合肽的序列如下： 5-CTAGGGGCAGCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCACGAGGGCAGCC-3， 5-CTAGGGCTGCCCTCGTGCCACTCGATCTTCTGGGCCTCGAAGATG

9、TCGTTCAGGCCGCTGCCC-3。要生成含有生物素结合肽的腺病毒载体，pAdHM62-BAP-L2被PacI消化，并且根据制造商的指示，用SuperFect转染试剂（Qiagen, Valencia, CA）把293个细胞植入到60mm的读盘中。Ad-L2，以荧光素酶表达的腺病毒载体包含了野生型的腺病毒衣壳，在以前就造成了21。所有的腺病毒载体在293个细胞中增殖，用两轮氯化铯梯度离心进行纯化，透析，并储藏在-80。矢量粒子（VP）的效价用分光光度法进行测定22。对于腺病毒载体生物素来说，在病毒六邻体(Ad-BAP-L2) (2x1011VP)HVR5中，往含生物素结合肽在内的腺病毒载

10、体中加入100mm的ATP、100mmMgoAc和50mm的D-生物素组成的缓冲液，随后在30用7ml的生物素蛋白连接酶(BirA500; Avidity, LLC, Aurora, CO)处理40min。然后，腺病毒载体在4收获和过夜透析，并除去蛋白连接酶，生产处生物素腺病毒载体（Ad-BAP/Bio-L2）。生物素腺病毒载体可以被免疫印迹和酶联免疫吸附试验（ELISA）证实。对于六邻体特异修饰的聚乙二醇化腺病毒载体来说，Ad-BAP/Bio-L2在(六邻体生物素:抗生素蛋白:MPEG-生物素-5000)摩尔比为1:1:3的比例下用生物素蛋白和MPEG-生物素-5000在室温培下养20min

11、，生产出Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2。未结合的抗生素蛋白和mPEG-生物素-5000在本实验中不能从混合物中除去。2、3 免疫印迹法每一个腺病毒载体（1x109 VP）在一个含有4%的-巯基乙醇的缓冲液中，在95的温度下加热5min，然后在电转移到硝酸纤维素膜后，把样品在5-20%的SDS-PAGE凝胶下分离。在被免疫阻断剂(Dainippon Pharmaceutical Co., Osaka, Japan)阻断后，该膜在辣根过氧化酶（HRP）-抗生物素抗体共轭（1:10000：矢量实验室，Burlingame，CA）的情况下在4培育一整晚。洗涤后，膜就会与ECL加免疫

12、印迹检测试剂反应(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)。通过使用LAS3000成像系统检测信号(Fujifilm, Tokyo, Japan)。2、4 血液清除和聚乙二醇化腺病毒载体的组织分布甲基-A细胞（2x106细胞/鼠）是在BALB/c小鼠的腹部接种表达。一星期之后，当肿瘤直径超过5-8毫米，Ad-L2，Ad-BAP-L2，Ad-BAP/Bio-L2，或者是Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在剂量为1x1010VP/ 鼠时通过静脉注射到冰毒河流小鼠，并在指定时间点通过眼窝出血采集血液样本。总的DNA，包括腺病毒载体DNA在内，利用DNA

13、组织和血液迷你试剂盒（Qiagen）从全部血液中分离。接种腺病毒载体48小时后，肿瘤和主要器官的累积和均质如前所述23。总的DNA，包括腺病毒载体DNA在内，从肿瘤或各个器官中使用自动分离核酸纯化系统分离(NA-20000;Kurabo, Osaka, Japan)。分离后，对总的DNA浓度进行测定，并且如前面所说的，对腺病毒载体基因组用TaqMan荧光检测系统(ABI Prism 7700 sequence detector; Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA)拷贝数量24。2、5 腺病毒载体在小鼠体内的转导为了评估腺病毒载体在

14、体内的传导性能，甲基-A轴承小鼠经静脉注射每一种腺病毒载体1x1010VP。肿瘤和主要的器官在注射后48个小时收获，如前面所述，荧光素酶的生产确定使用荧光素酶检测系统23。蛋白质含量的测定时使用Bio-Rad检测试剂盒，这个试剂盒是用牛血清白蛋白作为标准衡量的。3、 结果3、1 六邻体特异结合的聚乙二醇化腺病毒载体的生成把PEG（聚乙二醇）用特定的异己酮、通过抗生素蛋白-维生素的相互作用的方法结合到腺病毒载体上，我们得到了Ad-BAP-L2，而BAP这种肽，包含异己酮循环中的HVR5（表1）。异己酮不包括腺病毒载体与主要受体结合之后的捆绑物。异己酮的HVR5为插入外源的肽提供专门的结合位点，因

15、为HVR5允许外源肽的插入对它作为转基因腺病毒的功能没有影响19,25。BAP通过维生素-蛋白质连接酶（BirA）连接之后是很有效地生物素。进一步，为了把生物素连接到BAP上，Ad-BAP-L2用BirA在30处理40分钟，结果是Ad-BAP/Bio-L2（表2）BirA把维生素绑定到BAP的赖氨酸残渣上；其次，为了把生物素化的PEG连接到HVR5的BAP上，Ad-BAP/Bio-L2是由抗生素蛋白和乙二醇生物素-5000混合而成。因为抗生素蛋白含由四个生物素结合位点的四聚体26，异己酮允许特定的聚乙二醇化的聚合物的相互作用。被标记的异己酮、抗生素蛋白和mPEG-bitoin-5000的比例是

16、1:1:3。我们选择这个比例的原因是我们认为mPEG-bitoin-5000应该属于异己酮。总之，mPEGbiotin-5000的量减少，腺病毒载体的几部分主要的成分的形成更加容易（数据没有显示）。我们分析生物素是不是处理异己酮的特定物质用蛋白质分子印记法进行分析（表3A）。Ad-BAP/Bio-L2的异己酮的蛋白质通过抗生素蛋白标记法检查。在结果中没有发现其他的带。这些结果都表明Ad-BAP/Bio-L2的异己酮与抗生素的偶联是特定的。3.2 用Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的体外转导首先，为了证明BAP是否转移到腺病毒载体的HVR5里起到了作用，我们把它与未转移的腺病毒

17、载体进行比较，分别标记为Ad-L2和 Ad-BAL-L2。最近研究已经证明血清和异己酮处理的HVR5结合，在细胞表面对磷酸素起到桥梁的作用。27，28。本研究中，Ad-BAP-L2比Ad-L2的转染效应降低了大约50倍（表3B）。但现在还不明白这种结果的原因。 再次，为了证明在体外Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的传导能力，在A549细胞内转入没有血清或存在抗血清的腺病毒载体。众所周知，聚乙二醇修饰物保护腺病毒载体被其抗体识别。一方面，一般的聚乙二醇修饰物，能降低腺病毒载体的转移能力。在没有抗血清腺病毒载体存在下，Ad-BAP/Bio-L2和Ad-BAP/Bio/Avi/Bi

18、o-PEG-L2的转移能力比Ad-BAP-L2降低约10倍，然而，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的转移能力与Ad-BAP/Bio-L2,相比，证明聚乙二醇修饰物没有降低腺病毒载体的转移能力（表4）。另一方面，在抗血腺病毒载体存在的情况下，Ad-BAP-L2,Ad-BAP/Bio-L2, 和 Ad-BAP/Bio/Avi-L2的转移能力随着抗血清腺病毒载体浓度的增加而减小更多。在血液中观察到的Ad-BAP-L2 and Ad-BAP/Bio-L2是Ad-L2的100多倍。另外，在血液中，经处理30分钟后，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的基因组染色组残留数比

19、Ad-L2高10倍。出乎意外的是，经15分钟处理之后，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2和Ad-L2表现出相似的血液清除曲线。进一步，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的转移效率没有降低血清的浓度。所以我们确定，把mPEG-Biotin-5000转移到Ad-BAP/Bio-L2，没有消除抗腺病毒载体血清的作用（数据没有给出）。这些结果都表明腺病毒载体介导的导入没有被特定的异己酮的聚乙二醇的修饰物抑制。3.3 静脉注射后，特定异己酮的聚乙二醇修饰物的腺病毒载体的血液清除率 为了证明全身给药后腺病毒载体的血液清除率是否能够延长特定异己酮的聚乙二醇修饰物，腺病毒载体通

20、过静脉注射注射到老鼠体内，在血液中腺病毒载体染色体组数用实时PCR仪检测。在以前的研究中3,29，一般的Ad-L2从血液循环中很容易发现（表5）。低腺病毒载体可能会导致Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的清除数量。这些结果都表明特定异己酮的聚乙二醇修饰物的腺病毒载体，在全身给药后，腺病毒载体会延长血液的保留时间。3.4 全身给药后，特定的异己酮的聚乙二醇修饰物的腺病毒载体在组织中的积累 为了证明静脉注射后，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在肿瘤和主要组织器官中的分布，把腺病毒载体通过静脉注射到老鼠体内，在组织、肝、脾中的腺病毒载体的染色体组数用实时PCR仪检测

21、。众所周知，Ad-L2的全身给药会在肝中有很大的积累3，事实如此，Ad-L2在肝脏中有最大的积累量（表6A）。而检测到的Ad-BAP-L2在肝的积累中减少了大约15倍可能是因为BAP的插入而封锁了异己酮HVR5和外源血清的相互作用。进一步说，Ad-BAP/Bio-L2 and Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的肝积累水平比Ad-BAP-L2低，但在腺病毒载体染色体组的数目在肝脏中没有很大的不同（表6B）。在脾脏中，Ad-BAP-L2的染色体组数是Ad-L2的90倍，而在脾脏的积累Ad-BAP/Bio-L2 and Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2比Ad-L2

22、低。 腺病毒在组织中的积累与在肝脏和在脾脏中的积累不同（表6C）。在组织中，Ad-BAP-L2的积累比Ad-L2的积累高倍Ad-BAP/Bio-L2 和 Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的积累比Ad-L2高40倍。Ad-BAP/Bio-L2 和 Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的积累没有明显的差别。所以结果表明，Ad-BAP/Bio-L2 and Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在肝脏中的积累的减少可能会导致在组织中的积累的增加。3.5 在体内特定的异己酮的聚乙二醇的修饰物的腺病毒载体的转移效率 为了证明Ad-BAP/Bio/Avi/Bio

23、-PEG-L2在体内的转移效率，我们对经过静脉注射后的老鼠的组织和主要器官的转移效率进行评估（表7）。就像以前的研究3，在肝脏中，Ad-L2的转移效率最高，然后是脾脏和心脏。在所有的器官中，Ad-BAP-L2的转移效率比Ad-L2降低了10倍。进一步说，除在心脏中，Ad-BAP/Bio-L2的转移效率在其它器官中比Ad-BAP-L2低28倍。在所有器官中，转移效率最低的是Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2。在所有的器官中，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的转移效率和Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2 与Ad-BAP-L2相似。尤其是Ad-BAP

24、/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在组织中的转移效率，尽管发现Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在组织中的染色体组数比Ad-L2高很多。这些结果都表明，特定异己酮的聚乙二醇的修饰物能明显的降低腺病毒载体的转移效率。4、 讨论 这项研究的目的是制造一个特定共轭聚乙二醇化腺病毒载体，与柯萨奇病毒腺病毒受体结合无关，为了不降低聚乙二醇化腺病毒载体的转导或率。为了这个目标，我们把生物素结合肽纳入六邻体HVR5，这不参与结合柯萨奇病毒受体，并随后通过亲和生物素的相互作用把聚乙二醇共轭结合到六邻体上。本研究的数据表明，病毒六邻体特异结合聚乙二醇不能从实质上抑制体外腺病毒载体的转导效率，

25、尽管把生物素结合肽结合到病毒六邻体HVR5上可以减少50倍的转导效率。另一方面，对在肿瘤中病毒六邻体特异修饰的聚乙二醇化腺病毒载体的转导效率明显的比全身用药后腺病毒载体的转导效率低，尽管，相对于传统的腺病毒载体，肿瘤中六邻体特异聚乙二醇化腺病毒载体的积累显著增强。聚乙二醇分子量的大小是聚乙二醇化腺病毒载体转导轮廓的关键因素。在以前的研究中，聚乙二醇分子大小是随着肝中转导率的日益减少和腺病毒载体在血液中停留时间的延长而增加的9,30。Yao等人表明，在培养细胞时共轭的PEG-20000介导的转导效率比较低，而且在肝脏中更低，而在全身用药后和PEG-5000共轭的腺病毒载体相比，与PEG-2000

26、0共轭的腺病毒载体显示较长的血液停留时间9。Doronin等表明，PEG-20000共轭的的腺病毒载体在肝脏中比PEG-5000共轭的腺病毒载体的转导效率低30。在本研究中，我们使用PEG-5000是因为具有大分子量的聚乙二醇可能完全覆盖纤维旋钮和抑制纤维和柯萨奇病毒受体的相互作用。PEG-5000的长度估计约为34nm，而腺病毒5型纤维长度已经确定为37nm。这些数据表明，纤维旋钮将从PEG-5000外层凸出来，从而使Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在体外产生转导效率。PEG-5000共轭的腺病毒载体在肝脏中阻断腺病毒载体转导的效率，相对于和上述分子量大的PEG共轭来说较低

27、9,12；但是，不仅Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2而且Ad-BAP/Bio-L2都在调解肝脏中转导效率的本底水平，尽管在这个研究中使用了PEG-5000。Ad-BAP-L2在肝脏的转导效率也明显低于Ad-L2。这很可能是把生物素结合肽插入到病毒六邻体HVR5上抑制了FX和病毒六邻体之间的相互作用，导致与生物素结合肽连接的腺病毒载体在体内的转导效率显著减少。最近，除了通过柯萨奇病毒受体-纤维扭转相互作用传播和RGD（丙氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列的整合互动，而且涉及病毒六邻体的腺病毒感染途径也被证明27,28。在血清中的FX结合病毒六邻体中高变区5和7，作为硫酸肝素对肝细胞的

28、作用桥梁。Vigant等表明，把肽插入到腺病毒六邻体的HVR5可以使肝脏的转导效率减少33。此外，和Ad-BAP-L2相比，Ad-BAP/Bio-L2中发现肝脏转化约减少10倍。生物素结合到六邻体的HVR5上可能造成空间位阻，从而进一步抑制FX与六邻体之间的相互作用。 不仅体内器官而且连体外Ad-BAP-L2的转导效率都低于Ad-L2各自的价值，尽管柯萨奇病毒受体对A549细胞有很强的表达。现在还不清楚为什么Ad-BAP-L2介导在体内的转导效率低于Ad-L2；但是，把生物素结合肽插入到HVR5可能影响到腺病毒与核膜的连接，或者是在进入细胞内部后，影响腺病毒基因组DNA导入细胞核。Trotman等表明，腺病毒六邻体蛋白涉及到与核包封结合和导入腺病毒基因组蛋白34。腺病毒载体介导的转导的主要障碍之一就是在成年人中抗腺病毒抗体的高感染率。超过80%的成年人具有抗腺病毒抗体4,5。抗腺病毒抗体不仅抑制腺病毒载体介导的转导，并且增加腺病毒载体的诱导毒性35，这表明对抗腺病毒抗体的识别应避免腺病毒载体的安全和有效的转导。中和抗腺病毒抗体的主要是六邻体36，这表明六邻体特异结合的聚乙二醇提供了一个有效的方式来规避对抗腺病毒抗体介导的抑制。在这项研