常见绞股蓝属植物鉴别问题的生物技术应用解决方案

1、常见绞股蓝属植物鉴别问题的生物技术应用解决方案【摘要】:随着现代生物技术的迅速发展,利用分子标记方法解决绞股蓝属植物易混淆,以致难以鉴别的问题已成为可能。ISSR(inter-simple sequence repeat标记技术是在SSR基础上发展起来的一项新的标记技术。即先用CTAB法提取绞股蓝属植物总DNA,以57条ISSR引物进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析,然后筛选出产物清晰稳定的14条引物,其中引物UBC-873与UBC-895具有较高的多态性条带比率,均可独立区分常见的几种绞股蓝属植物。因此,ISSR-PCR分析可有效区分鉴别常见绞股蓝属植物。【关键词】:绞股蓝属;ISSR;区分

2、鉴别1 绞股蓝属植物基本情况绞股蓝属Gynostemma BL.是葫芦科Cucurbitaceae的一个中小属1,植物为多年生攀援草本,包含16种2变种,隶属于2亚属2组,主要分布于热带亚洲至我国秦岭南坡、长江流域及以南广大地区和朝鲜及日本,生长在山地林中或山谷水沟旁,在石灰岩地带较为常见,其分布中心为我国西南地区。该属广布种绞股蓝(G.Pentap hyllum(Thunb.Makion,被誉为“南方人参”,为我国常用中草药,具有悠久的应用历史。早在明代的救荒本草、农政全书,清代的植物名实图考以及近代的各类中草药著作中,均有记载。现代药理学研究证明绞股蓝属植物含有与人参皂甙相似的成分,还含有

3、多种维生素和黄酮甙,是一种具有人参作用,而无人参副作用的多功能保健药,被誉名为“世界四大保健品之冠”。具有抗肿瘤、抗疲劳、降血脂、益智健脑、提高免疫力、治疗白发症等多种功能,并且具有无毒、廉价等优点,广泛应用于医药保健领域。2 绞股蓝属植物现存问题绞股蓝属为热带亚洲分布类型,在我国秦岭长江以南地区广泛分布1,地理环境变化复杂,在其种系发生发展过程中,为适应新的环境形成了一系列的生态变异,属内各分类群之间形态特征交叉、过渡现象严重,鉴定困难。近几年来,由于生态环境的不断破坏,野生绞股蓝资源日益减少,而市场需求的不断增加,导致国内绞股蓝药材资源来源复杂,药材质量差异显著。绞股蓝皂苷具有重要的生理活

4、性,是评价绞股蓝品质的重要标志,绞股蓝属不同种间皂苷量差异显著,但由于其生长环境相似、植物形态学上难以区别,造成了市场上药材来源复杂,品质差异较大的情况2。目前采用的绞股蓝属植物分类系统,主要依据子房、果实形态进行划分3,由于属内种间形态特征交叉、过渡现象严重,为鉴定带来一定困难。因此,从形态学上难以区分,然而为有效利用绞股蓝属植物资源,对该属进行分类及正确鉴定显得尤为重要。更多的研究表明,绞股蓝属内不同种之间在蛋白质营养成分4、皂苷量5、黄酮量6等方面均存在差异,同时种子微结构7、染色体数目8、过氧化物酶同工酶谱9也有不同,因此绞股蓝属分类问题的研究具有重要的理论与应用价值。随着现代生物技术

5、的快速发展,分子标记技术应用在药用植物上大大提高了区分鉴别的效率,应用ISSR技术将成为解决常见绞股蓝属植物不能区分鉴别的难题的良好途径。3 ISSR技术途径近年来,随着分子标记技术的发展,中药鉴定逐步从形态组织学、化学水平提高到分子水平,各种DNA分子标记技术广泛应用于中药材的鉴定研究,DNA分子标记直接依据药材的遗传多样性特征,通过分析其特有的DNA片段对药材进行分类鉴别,具有准确快速、微量检测等特点。简单序列重复区间扩增多态(inter-simple sequence repeat, ISSR是Zietkiewicz等在1994年创建的一种DNA分子标记技术,它利用重复锚定引物扩增出SS

6、R之间的片断,具有重复性好、稳定性高、多态性丰富等优点,在种质鉴定、亲缘关系研究领域优势显著。 ISSR是基于SSR发展起来的一种新型分子标记技术,它是根据基因组内广泛存在的微卫星序列设计单一引物,对两侧具有反向排列的SSR的一段DNA序列进行扩增,然后进行电泳、染色,根据谱带的有无及相对位置,来分析不同样品间ISSR标记的多态性。ISSR引物通常为16l8个碱基,其主体是2-4个碱基组成的串联重复序列,然后在其5端和3端加上l4个锚定碱基,从而保证ISSR引物能够对 SSR之间的DNA序列进行PCR扩增10。由于微卫星在基因组中广泛分布,且等位变异特别丰富,因而ISSR可以检测到高的多态性。

7、另外,ISSR 不像SSR具有物种特异性,它可以和RAPD一样用于各类动植物的研究。只是引物设计要求不同,但其产物多态性远比RFLP、SSR、RAPD更加丰富,可以提供更多的关于基因组的信息,而且比RAPD技术更加稳定可靠,实验重复性更好。因此,针对我国常见的7种绞股蓝属植物:绞股蓝G.pentaphyllum、五柱绞股蓝G.pentagynum、心籽绞股蓝G.cardiospermum、长梗绞股蓝G.longipes、喙果绞股蓝G.yixingense、疏花绞股蓝G.laxiflorum、广西绞股蓝G. guangxiense,通过对其进行ISSR鉴定,即可加以区分,从而为绞股蓝药材的分子鉴

8、定提供依据。与其它基于PCR技术的分子标记方法一样,ISSR技术也主要包括DNA提取、PCR扩增、电泳检测、观察结果及统计分析等步骤11。首先,进行基因组DNA的提取:采用CTAB法提取绞股蓝属基因组DNA,对其略作改进。DNA一般不用纯化,但需对DNA样品进行电泳,检测其质量,并用分光光度计检测DNA浓度及其与蛋白质比值。新提取的DNA用一倍的TE溶液溶解,贮存在-20或-70冰箱中备用。用前稀释到l020ng/L的浓度,置4冰箱中保存。其次,进行PCR扩增及电泳检测:选取2份材料进行预试验,从57条ISSR 引物中筛选出扩增条带清晰、重复性好的14条ISSR引物用于全部材料的扩增。PCR反

9、应体系包括Mg2+、dNTPs、引物、模板 DNA、TaqDNA聚合酶,1×PCR缓冲液。反应程序为:94预变性5min;94变性30s,4577退火45s,72延伸2min,进行40个循环;最后72延伸7min2。反应产物在含有EB的琼脂糖凝胶中电泳分离,在紫外光投射仪下检测,然后照相记录。最后,观察结果及统计分析:根据ISSR扩增条带的有无,获得二元数据矩阵,分析各居群的多态位点比率(PPB2。从57条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、重复性好的14条引物,对7种野生绞股蓝属植物材料进行扩增,共得到151条带,平均每个引物扩增出10.79条,其中多态性条带148条,多态性比率达到

10、98.01%,揭示了供试材料在种间水平上具有丰富的多态性,扩增条带的相对分子质量从2002000bp不等2。14条ISSR引物中,引物UBC873和UBC895均可独立区分7种绞股蓝属植物。4 展望将ISSR-PCR方法引入绞股蓝属种间鉴定,结果表明,ISSR技术具有操作简便、多态性高、稳定可靠的特点,引物UBC873与UBC895均可独立区分7种绞股蓝属植物,可用于该属植物的分类鉴定。该方法对样品质量要求较低,可以为新鲜或干燥绞股蓝茎叶2。ISSR标记技术试验操作简单、快速、高效,不需要繁琐地进行基因文库构建、杂交和同位素显示等步骤;重复序列和锚定碱基的选择是随机的,无需知道任何靶标序列的S

11、SR背景信息,从而降低了技术难度和实验成本;无需活材料,无组织器官特异性,能实现全基因组无编码取样;采用了较长的引物,退火温度较高,因此,引物具有更强的专一性,增强了实验的可重复性12。传统药用植物种质资源的鉴定评价方法依赖于宏观特征,如叶片形状等,但可用的形态性状少且受环境影响大,因此需要高效、准确、不受环境因素影响的鉴定技术。ISSR技术不会受到环境因素的影响,因此在中药材真假品种的鉴定和道地药材的鉴别上有很大的优势。但是任何分子标记方法都不是十全十美的,应该以发展的观点来看待这个问题,相信ISSR技术凭其多态性高、稳定性强、节省时间、物力和财力等优势,必将使其在更多物种和领域得到应用。【

12、参考文献】1陈书坤. 绞股蓝属植物的分类系统和分布. 植物分类学报,1995,33(4: 403-410.2周天华,杨雪,郭晶,等. ISSR-PCR鉴别绞股蓝属7种植物. 中草药,2008, 39(4:588-591.3郭志刚,赵桂仿. 利用ISSR分析6种绞股蓝属植物的遗传多样性与亲缘关系.西北大学学报(自然科学版,2008,38(5:767-770.4李纯,孟洁. 安徽省绞股蓝资源调查及质量评价. 安徽农学通报,1997,3 (3:22-24.5刘世彪,林如,胡正海. 绞股蓝属5种植物的茎叶结构和总皂苷含量差异. 福建农林大学学报(自然科学版,2006,35(5:495-499.6蒋伟哲,周燕文,李锦椠,等. 6种广西产绞股蓝中总黄酮的含量测定. 中国药房,2006,17(1:74-75.7孙航,陈书坤. 绞股蓝属植物种皮微结构特征及其分类学意义. 云南植物研究,1998,20(3:309-311.8高信芬,陈书坤,顾志建,等. 绞股蓝属的染色体研究. 云南植物研究,1995,17(3:312-316.9张智,谢中稳,李遥. 安徽绞股蓝属植物资源分布及其过氧化物酶同工酶的研