暨南大学分子生物学笔记

1、分子生物学分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。第一章绪论一、引言1.创世说与进化论：1859年达尔文发表了物种起源，用事实证明“物竞天择，适者生存”的进化论思想。指出：物种的变异是由于大自然的环境和生物群体的生存竞争造成的，彻底否定了“创世说”。达尔文第一个认识到生物世界的不连续性。2.细胞学说：德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺共同提出：一切植物、动物都是由细胞组成的，细胞是一切动植物的基本单位。3.经典遗传学两条基本规律：统一律：当

2、两种不同植物杂交时，它们的下一代可能与亲本之一完全相同。分离规律：将不同植物品种杂交后的F1代种子再进行杂交或自交时，下一代就会按照一定的比例分离，因而具有不同的形式。1865年发表植物杂交试验，1900年被人们重新发现。孟德尔被公认为经典遗传学的奠基人。4.现代遗传学：Morgan指出：种质必须由某些独立的要素组成，这些要素称为遗传因子或基因。二、分子生物学发展简史1.准备和酝酿阶段（19世纪后期到20世纪50年代初）对生命本质的认识上的两点重大突破：确定了蛋白质是生命的主要基础物质确定了生物遗传的物质基础是DNA。2.现代分子生物学的建立和发展阶段（20世纪50年代初到70年代初）以195

3、3年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑，主要进展包括：遗传信息传递中心法则的建立对蛋白质结构与功能的进一步认识。DNA双螺旋发现的意义：确立了核酸作为信息分子的结构基础。提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式。从而最后确定了核酸是遗传的物质基础，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。Crick于1954年所提出遗传信息传递的中心法则（Central Dogma ）3. 初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段（20世纪70年代后至今）基因工程技术的出现作为标志，重大成就包括：重组DNA技术的建立和发展基因组研究

4、的发展单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展基因表达调控机理细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域。 （发展内容见笔记）第二章 染色体与DNA一、染色体(chromosome)1.染色质：由DNA和蛋白质构成，在分裂间期染色体结构疏松，称为染色质。染色质与染色体是同一物质在不同细胞周期的表现。常染色质：是进行活跃转录的部位，呈疏松的环状，电镜下表现为浅染，易被核酸酶在一些敏感的位点降解。异染色质：在间期核中处于凝缩状态，无转录活性，也叫非活动染色质，是遗传惰性区。在细胞周期中表现为晚复制，早凝缩，即异固缩现象。2.原核生物DNA的主要特征：一般只有一条染色体且大都带有单拷贝基因，只有很少数基因（如

5、rRNA基因）是以多拷贝形式存在。整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成。几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。3.染色体特性：分子结构相对稳定。能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性。能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程。能够产生可遗传的变异。4.真核细胞染色体的组成：DNA30%-40%；组蛋白30%-40%；非组蛋白变化很大；少量RNA5.染色体中的蛋白质主要包括组蛋白(histone)和非组蛋白(non-histone protein)：组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3及H4，其中H3、H4富含精氨酸，H1富含赖氨酸，H2A、H2B介于两者之间。

6、具有如下特性：进化上的极端保守性:H3、H4H2A、H2BH1。无组织特异性：极少细胞不含H1而带有H5。肽链上氨基酸分布的不对称性：碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。组蛋白的修饰作用：包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。富含赖氨酸的组蛋白H5非组蛋白大约占组蛋白总量的6070%，种类很多，酶等。特性：多样性、组织专一性、种属专一性。高速泳动蛋白(HMG)：能与DNA结合(不牢固)，也能与H1作用,可能与DNA的超螺旋结构有关。DNA结合蛋白：可能是一些与DNA的复制或转录有关的酶或调节物质。A24非组蛋白 ：与H2A差不多，位于核小体内，功能不祥。6. 真核细胞基因组的最大特点是

7、它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开。C值：一种生物单倍体基因组DNA的总量。C值反常现象：C值往往与种系进化的复杂程度不一致，某些低等生物却具有较大的C值。真核细胞DNA可分为：高度重复序列中度重复序列不重复序列：血红蛋白7. DNA包装成染色体：核小体螺线管超螺旋圆筒（中期染色质）染色体单体核小体(nucleosome)：每200bp的DNA有H2A、H2B、H3、H4各两个，H1一个。压缩比为7。螺线管（solenoid）：10nm的染色质细丝盘绕成螺旋管状的30nm纤维粗丝。每一螺旋包含6个核小体，其压缩比为6。是分裂间期染色质和分裂中期染色体

8、的基本组分。超螺旋圆筒：直径为4 000nm，压缩比是40。染色体单体：压缩比是5。总压缩比是76405=84008.真核生物基因组的结构特点：庞大，远大于原核生物的基因组。存在大量重复序列。大部分为非编码序列，占总序列90%以上（最主要区别）。转录产物为单顺反子。真核基因是断裂基因，有内含子结构。存在大量的顺式作用元件。存在大量的DNA多态性。具有端粒结构。9.原核生物基因组的特点：结构简练。存在转录单元：多顺反子mRNA。有重叠基因。 1977年，Sanger在Nature上发表了X174 DNA的全部核苷酸序列，正式发现了重叠基因。二、DNA的结构1.DNA的一级结构：4种核苷酸的连接及

9、其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。基本特点：DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，遵循碱基互补配对原则：腺嘌呤A只能与胸腺嘧啶T配对，鸟嘌呤G只能与胞嘧啶C配对。2.DNA的二级结构：两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。分两大类：右手螺旋，如A-DNA和B-DNA。左手螺旋，即Z-DNA。3.DNA的高级结构：DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋（拧紧）与负超螺旋（松开）两大类。

10、天然状态下DNA以负超螺旋为主。 三、DNA的复制1.DNA的半保留复制（semiconservative replication）：保证了DNA在代谢上的稳定性。2.复制的起点与方向：复制单位为复制子。一个复制子只含一个复制起点。原核生物多为单复制子，真核生物多为多复制子。DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的。复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。复制方向：53拓扑异构酶I：解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。DNA解链酶：通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。单链结合蛋白（SSB蛋白）：保证被解链酶解开的单链在复制完成前能

11、保持单链结构，以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环。SSB蛋白只保持单链的存在，并不起解链的作用。3. 复制的几种主要方式： 几个 两个环状DNA双链的复制：型(双向，大肠杆菌)滚环型(单向，噬菌体)D-环型(单向，线粒体和叶绿体)。线性DNA双链的复制：线性DNA复制中RNA引物被切除后，留下5端部分单链DNA，不能为DNA聚合酶所作用，使子链短于母链。特殊机制：a.将线性复制子转变为环状或多聚分子，T4和T7噬菌体。b.在DNA末端形成发夹式结构，使该分子没有游离的末端，草履虫。C.在某种蛋白质的介入下，在真正的末端上启动复制，腺病毒。四、原核和真核生物DNA复制的特点

12、1.原核生物的DNA聚合酶：DNA聚合酶：有35外切酶活性和53外切酶活性。主要起修复的作用以及把RNA引物切除后的空隙填补起来，保证DNA复制的准确性。DNA聚合酶 ：活性低，其35核酸外切酶活性可起校正作用。参与原核生物SOS修复的酶。DNA聚合酶：7种亚单位9个亚基。只具35外切酶活性，是原核生物在DNA延长中起主要作用的酶。2.真核生物DNA聚合酶：负责DNA引物合成，具有引发、延伸链的双重功能。主要负责DNA损伤修复。负责线粒体DNA修复。是主要的DNA复制酶，参与前导链和后随链的合成。负责复制修复，与后随链合成有关，在DNA合成过程中核苷切除以及碱基的切除修复中起着重要作用。3.D

13、NA复制的调控原核细胞：复制叉的多少决定了复制频率的高低。直接调控因子是蛋白质和RNA。真核细胞：细胞生活周期水平调控：限制点调控，决定细胞停留在G1期还是进入S期。染色体水平调控：决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在S期起始复制。复制子水平调控：决定复制的起始与否。五、DNA的修复：1.错配修复：恢复错配。2.碱基切除修复：糖苷水解酶，切除突变的碱基。3.核苷酸切除修复：DNA切割酶，修复被破坏的DNA。4.重组修复：复制后修复，5.DNA直接修复：DNA光解酶，修复嘧啶二体或甲基化DNA。6.SOS反应：修复DNA（有利）或产生变异（癌变）六、DNA的转座（移位）分为复制

14、型（TnA家族）和非复制型（IS序列、Tn5）1.TnA家族：没有IS序列的、体积庞大的转座子。这类转座子带有3个基因，两翼都带有38碱基的倒置重复序列。2.真核生物中的转座子：玉米中的控制因子：自主性因子：具有自主剪接和转座的功能；非自主性因子：单独存在时是稳定的，不能转座，当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时，它才具备转座功能，成为与自主性因子相同的转座子。AcDs体系、Spm, En转座子。果蝇中的转座子：Copia类、P转座子等。3.转座作用的机制：受体分子中有一段很短的、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，特定

15、的转座子所复制的靶序列长度一样。4.转座作用的遗传学效应：引起插入突变。产生新基因。产生染色体畸变：复制性转座发生在原有位点附近，正向重复转座子DNA缺失，反向重复转座子倒位。引起生物进化。第三章 从DNA到RNA基因表达：是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。转录：以DNA为模板，按照碱基互补原则合成一条单链RNA，从而将DNA中的遗传信息转移到RNA中去的过程。不对称转录：转录仅发生在DNA的一条链上。编码链=有意义链：与mRNA序列相同的DNA链。 模板链=反义链：根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链。1、 RNA转录：基本特点：合成方向为53。以DNA双链中的模

16、板链为模板。以4种三磷酸核苷（NTPs）为原料。遵循碱基配对原则。各核苷酸间通过形成磷酸二酯键相连。不需要引物的参与。合成的RNA带有与DNA编码链相同的序列。基本过程：模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。1.模板识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。原核：RNA聚合酶直接识别基因的启动子区。真核：RNA聚合酶与被称为转录调控因子的辅助蛋白质结合形成复杂的转录起始前复合物（PIC）。2.转录起始：不需要引物，RNA链上第一个核苷酸键的产生。3.通过启动子：转录起始后直到形成9个核苷酸短链的过程。通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。4.转录延

17、伸：RNA聚合酶释放因子离开启动子后，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程。5.转录终止：当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来。二、转录机器的主要成分：RNA聚合酶、转录复合物1.原核生物（大肠杆菌）RNA聚合酶：2亚基+1亚基+1亚基+1亚基=核心酶+1亚基=全酶和亚基：聚合酶的催化中心。亚基：核心酶组装，启动子识别。因子：模板链的选择和转录的起始，极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力。2. 真核生物RNA聚合酶：一般有8-14个亚基所

18、组成。分为（45SrRNA除5S外各rRNA）（hnRNAmRNA）（tRNA、5SrRNA、snRNA）对-鹅膏覃碱的敏感程度：不敏感；低浓度也敏感；高浓度对动物抑制，昆虫无； 3.转录复合物：全酶（原核）或RNA聚合酶+至少7种转录因子TF（真核）与启动子结合形成封闭复合物DNA开链转变为开放复合物与最初两个NTP结合转变成三元复合物转录起始复合物释放亚基生成转录延伸复合物。三、启动子与转录起始：基因表达的关键阶段。 1.启动子区的基本结构转录单元：一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。转录起点：与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为一个嘌呤。启动子区：RNA聚合酶与

19、启动子的结合位点，能与因子相互识别而具有很高的亲和力原核:Pribnow区（-10bp）、TTGACA区（-35bp）真核:Hogness区（-30-25bp）、CAAT区（-78-70bp）2.启动子区的识别：氢键互补学说。解释了启动子功能既受DNA序列影响，又受其构象影响的事实。3.RNA聚合酶与启动子区的结合：RNA聚合酶既是双链DNA结合蛋白，又是单链DNA结合蛋白。4.-10区和-35区的最佳间距：1619bp。两种启动子突变：下降突变与上升突变。5.增强子及其功能：增强子很可能通过影响染色质DNA-蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构，从而使得RNA聚合酶更容易与范本D

20、NA相结合，起始基因转录。6.真核生物启动子对转录的影响上游启动子元件UPE或上游激活序列UAS：TATA区上游的保守序列。GC区：在-110-80区的保守序列。TATA区的主要作用是使转录精确地起始。CAAT区和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。转录实际上是RNA聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。7.转录的抑制：DNA模板功能抑制剂：放线菌素D。RNA聚合酶抑制剂：利福毒素、-鹅膏覃碱四、原核生物与真核生物mRNA的特征比较只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA；把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNAmRNA分为3部分：编码区、位于

21、AUG之前的5端上游非编码区、位于终止密码子之后不翻译的3端下游非编码区。1.原核生物mRNA的特征：半衰期短以多顺反子的形式存在5端无帽子结构，3端没有或只有较短的poly A结构。2.真核生物mRNA的特征：5端存在“帽子”结构：腺苷酸转移酶加G。帽子结构：GTP和原mRNA5三磷酸腺苷（或鸟苷）缩合反应的产物，常常被甲基化。帽子功能：免遭外切核酸酶的攻击；为核糖体识别RNA提供信号。0号帽子：第一个核苷酸甲基化，出现在所有真核生物中。1号帽子：第二个核苷酸甲基化，除单细胞生物以外所有其他真核生物中都有的最主要的帽子。2号帽子：第三个核苷酸甲基化，只占帽mRNA总量的1015以下。绝大多数

22、真核生物mRNA具有多聚A尾巴：多聚腺苷酸是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式。五、终止和抗终止（大肠杆菌）1.不依赖于因子的终止：模板DNA存在内在终止子。结构特点：终止位点上游存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，所以转录产物的3端为寡聚U。2.依赖于因子的终止：因子是一个由6个相同亚基组成的六聚体蛋白，是一种NTP酶。它能水解各种核苷酸三磷酸，它通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。作用机制：“穷追”模型。3.抗转录终止主要有两种方式：破坏终止位点RNA的茎

23、-环结构 依赖于蛋白质因子的转录抗终止六、内含子的剪接、编辑及化学修饰 （真核生物独有）（内含子：非编码区。外显子：编码区 ） 1.真核生物mRNA前体的加工：核不均一RNA（hnRNA）5端形成特殊的帽子结构在3端切断并加上一个poly A尾巴通过剪接切除内含子，外显子连接成连续的可译框架。GU-AG法则（Chambon法则）：供体衔接点的5端为GU，接纳体衔接点的3端为AG。2. mRNA的剪接：核内RNA与核蛋白（snRNPs）参与。GU-AG类内含子为主要，AU-AC类内含子为次要。内含子的变位剪接：在个体发育或细胞分化时可以有选择性地越过某些外显子或某些剪接点进行变位剪接，产生出组织

24、或发育阶段特异性mRNA。内含子的自我剪接：类:游离鸟苷酸或鸟苷参与的转酯反应，发生两次磷酸二酯键的转移。类：本身羟基参与的转酯反应，形成套索状结构。3.RNA的编辑：在mRNA水平上改变遗传信息的过程。机制：位点特异性脱氨基作用（单碱基突变）引导RNA指导的尿苷酸插入或删除意义：校正作用 调控翻译 扩充遗传信息4.RNA的再编码：+1/-1移码 核糖体跳跃 终止子通读5.RNA的化学修饰：甲基化、硫代、二价键的饱和化、去氨基化、碱基的同分异构化、核苷酸的替代。6.核酶：具有催化功能的RNA分子。分为剪切型和剪接型（类、类内含子）。第四章 从mRNA到蛋白质一、遗传密码三联子：mRNA中翻译成

25、蛋白质多肽链上的一个氨基酸的三个相邻核苷酸。共有64个密码子，其中有1个起始密码子和3个终止密码子。起始密码子：AUG。 终止密码子：琥珀型密码子UAG、蛋白石密码子UGA、赭石型密码子UAA1.破译：以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指点多肽的分解。核糖体结合技术2.性质：连续性 简并性 普遍性与特殊性 密码子与反密码子的互相作用3.“摆动假说”：密码子第一、第二碱基严格遵守碱基配对原则，第三碱基有一定的自由性。反密码子第一位是A或C时，只能识别一种密码子；第一位是U或G时，可分别识别两种密码子。第一位是I（稀有成分）时，能识别3种密码子。所以，假如数个密码子同时编码一个氨基酸，但

26、凡第一、二位碱基不相反的密码子都对应于各自的tRNA。二、tRNA：第二遗传密码，3端均以CCA-OH序列结束1.tRNA的三叶草形二级构造：分为受体臂TC臂反密码臂D臂。按多余臂大小分两大类。2.tRNA的L形三级构造：由在二级构造中未配对碱基间构成氢键而引发。在三叶草构造中的氢键被称为次级氢键，在三级构造中的就称为三级氢键。分子中两个不同的功能基因是最大限度分离的。tRNA的性质由反密码子而不是它所携带的氨基酸决定。3. tRNA的功能：氨基酸必须通过AA-tRNA合成酶活化，结合到tRNA才能与mRNA的密码子相互识别。4. tRNA的种类:起始tRNA和延伸tRNA 同工tRNA 校正

27、tRNA：无义突变和错义突变。在蛋白质的构造基因中，一个核苷酸的改动能够使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA)，使蛋白质分解提早终止，分解无功用的或有意义的多肽，这种渐变就称为无义渐变。错义渐变：由于构造基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。5.氨酰-tRNA分解酶：一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶。三、核糖体（原核：50S+30S，真核：60S+40S）1.核糖体的构造：包括两个亚基，每个亚基包括一个相对分子质量较大的rRNA成分和许多不同的蛋白质分子。核糖体上有多个的活性中心，每个中心都由一组特殊的核糖体蛋白质构成。核糖体的根本功能

28、依赖于其中的rRNA，核糖体蛋白质起着增强rRNA功能的催化作用。核糖体有3个tRNA结合位点，tRNA移动顺序为：A点P位E位，在核糖体里的顺序：E点P位A位2.核糖体的功能：小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，大亚基负责携带氨基酸及tRNA功能。四、蛋白质合成的生物学机制：氨基酸活化,肽链的起始、伸长、终止以及新合成多肽链的折叠和加工。1.氨基酸的活化：氨基酸必须在氨基酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸AA-tRNA。2.翻译的起始：在mRNA起始密码子上游8-13个核苷酸的地方往往有一段富含嘌呤的序列，简称SD序列。它和16S rRNA 3端有一个互补的序列，它们互相识别，

29、以保证起始的正确性。原核生物：30S小亚基与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，再在SD序列的帮助下与mRNA模板结合。在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。带有tRNA，mRNA，三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。真核生物：与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5端的“帽子” 和3端的多聚A都参与形成翻译起始复合物。3.肽链的延伸：后续AA-tRNA与核

30、糖体结合 肽键的生成 移位4.肽链的终止：释放因子RF5.蛋白质前体的加工：N端fMet或Met的切除 二硫键的形成：蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化形成。特定氨基酸侧链的修饰：磷酸化、糖基化、甲基化 切除新生肽链中的非功能片段6.蛋白质的折叠：翻译后形成功能蛋白质的必经阶段。分子伴侣：在细胞内辅助新生肽链正确折叠的蛋白质，增加折叠产率，本身不参与最终产物的形成。目前发现有热休克蛋白和伴侣素。7.蛋白质合成的抑制剂：氯霉素：阻止mRNA与核糖体结合 四环素类：阻止AA-tRNA与核糖体结合 链霉素、卡那霉素、新霉素：干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生误读。青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞

31、核糖体发生作用，氯霉素和嘌呤霉素对原核和真核细胞皆作用。五、蛋白质运转机制1.翻译-运转同步机制：若某个蛋白质的合成和运转是同时发生的。如：分泌蛋白完整的信号多肽是保证蛋白质转运的必要条件 仅有信号肽还不足以保证蛋白质转运的发生 信号序列的切除并不是运转所必需的 并非所有的转运蛋白质都有可降解的信号肽2.翻译后运转机制：若蛋白质从核糖体上释放后才发生运转。如：细胞器发育蛋白（1）线粒体蛋白质的跨膜运转：运转之前大多数以前体形式存在，由成熟蛋白质和N端延伸出的一段前导肽共同组成。蛋白质通过线粒体内膜的运转是一种需能过程。前导肽中带正电荷的碱性氨基酸含量较为丰富。主要受体蛋白：Tom受体（2）叶绿

32、体蛋白质的跨膜运转：第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质，第二部分决定该蛋白能否进入类囊体。特点：活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内，这是鉴别翻译后运转的指标之一。叶绿体膜能够特异地与叶绿体蛋白的前体结合。叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异。3.核定位蛋白的运转机制：核定位序列NLS一般不被切除，可以位于核蛋白的任何部位。4.蛋白质的降解：大肠杆菌：蛋白酶Lon，切除一个肽键消耗两分子ATP。真核生物：泛蛋白第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术 一、DNA操作技术1.核酸凝胶电泳技术：分离DNA片段的基本原理：一种带电粒子在电场中，会以一定的速度移向与它自身带

33、相反电荷的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比，而相同数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，故一定的电场强度下，电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。2.细菌转化与目标DNA分子的增殖：细菌转化:是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。细菌转化常用的方法：CaCl2法（最常用）和电击法（高效）3.聚合酶链反应技术PCR：体外快速大量扩增特定基因或DNA序列的技术

34、。材料：模板DNA、PCR引物、Taq DNA 聚合酶、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+。全过程：DNA解链（变性）、引物与模板DNA相结合（退火）、DNA合成（链的延伸）4. 实时定量PCR技术：利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。SYBR Green I：可以检测全部双链DNA，但不能区分不同的双链DNA。TaqMan探针：一小段被设计成可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，所产生的荧光强度直接反应扩增靶DNA的总量。5. 基因组DNA文库构建：噬菌体载体和限制性内切酶部分消化法。2、 RNA

35、基本操作技术1.cDNA文库：真核生物mRNA逆转录所形成的DNA称为cDNA。将cDNA与载体DNA重组，并转化到宿主细菌里或包装成噬菌体颗粒，得到的一系列克隆群体。2.cDNA的合成：第一链cDNA的合成以mRNA为模板，在反转录酶和引物参与下反转录成cDNA。第二链cDNA的合成以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。3.基因文库的筛选：核酸杂交法：DNA探针 PCR筛选法：特异性引物 免疫筛选法：特异性抗体三、SNP的理论与应用1.概念：单核苷酸多态性SNP指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。等位位点：染色体DNA同一位置上的每个碱基类型。变化类型：转换（嘧啶嘧啶，嘌呤

36、嘌呤）、颠换（嘌呤嘧啶，嘧啶嘌呤）单倍型：某个染色体的紧密连锁的位点上多个等位基因的集合。按分布位置：基因编码区cSNP（同义或非同义cSNP）、基因调控区pSNP、基因间随机非编码区rSNP2.SNP的检测技术：基因芯片技术 TaqMan技术 分子信标技术 焦磷酸测序法（优）四、基因克隆技术1.RACE技术：在已知cDNA序列的基础上克隆5端或3端缺失序列的技术，很大程度上依赖于RNA连接酶连接和寡聚帽子的快速扩增。5RACE以5端RNA寡聚接头的部分序列和基因特异的3端反向引物进行PCR扩增，获得基因的5端序列；3RACE以5端基因特异的引物和3端寡聚dT下游部分序列为引物进行PCR扩增，

37、获得基因的3端序列。2. cDNA差示分析法:利用PCR以指数形式扩增双链DNA模板，线性形式扩增单链模板的特性。3.Gateway大规模克隆技术：利用噬菌体，不需酶切连接过程。包括TOPO技术和LR技术。4.基因的图位克隆法：可以克隆所有具有某种表现型的基因。构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记。通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。根据基因功能互作原理鉴定目的基因。五、蛋白质组与蛋白质组学技术1.双向电

38、泳技术SDS-PAGE：分离大量混合蛋白质组分的最有效方法。依赖于蛋白质的两个重要特性：等电点（决定聚集区域）、相对分子质量（决定迁移率）2.蛋白质印迹法Western blotting：最常用，又称免疫印迹法，用于检测样品中是否存在蛋白抗原和评价新抗体特异性。关键因素：抗原分子中可被抗体识别的表位性质 蛋白原液中的抗原的浓度二级抗体：放射性标记的抗体 与酶偶联的抗体 与生物素相偶联的抗体3. 蛋白质的质谱分析技术：用生物质谱鉴定电泳分离后的蛋白质。第六章 基因功能研究技术一、基因表达研究技术1.基因表达系列分析技术SAGE：分离提取mRNA，反转录反应合成cDNA双链，用特定限制性内切酶-锚

39、定酶进行消化。2.RNA的选择性剪接技术：用不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。类型：外显子遗漏性剪接、5选择性剪接、3选择性剪接、相互排斥剪接和平衡剪接。3. 原位杂交技术ISH：分为RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。4. 基因定点突变技术：PCR介导的重叠延伸技术和大引物诱变法。二、基因敲除技术：又称基因打靶。1.特点：专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传。分为：完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。 条件型基因敲除：通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。2.高等动物基因敲除技术：

40、重组DNA导入胚胎干细胞（ES细胞）3.植物基因敲除技术：农杆菌T-DNA插入失活技术三、蛋白质及RNA相互作用技术1.酵母单杂交系统：用于研究DNA-蛋白质之间相互作用。特点:可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。基本原理：将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子的上游，把报告基因连接到最基本启动子的下游。然后将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域融合表达载体导入酵母细胞，该基因如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活最基本启动子，使报告基因得到表达。2.酵母双杂交系统

41、：DNA结合结构域BD，转录激活结构域AD基本原理：将检测蛋白结合到AD上，诱饵蛋白结合到BD上，如果检测蛋白与诱饵蛋白结合则AD和BD靠近，激活报告基因表达。3.体外蛋白质相互作用技术Far Western印迹技术：探针蛋白GST与待测蛋白结合，激酶标记后切除GST后检测。免疫共沉淀技术：通过抗体来特异性识别候选蛋白。4.RNAi技术：RNA干涉。对触发物的加工（dsRNAsiRNA）、与目标mRNA的结合、目标mRNA的降解。四、基因芯片及数据分析1.基因芯片：又称DNA微阵列，是一种小型分析装置，能够快速和精确地研究生物基因组信息。基本步骤：生物学问题、样品制备、生物化学反应、检测、数据

42、模型分析2. 点制：简易基因芯片、大规模基因芯片、微珠芯片技术（密度高、测试重复性好、定制方便）3. 数据分析：数据可靠性分析、生物学意义分析。五、其他分子生物学技术1.凝胶滞缓实验EMSA：体外分析DNA与蛋白质相互作用。基本原理：蛋白质与DNA结合后将大大增加相对分子质量，而凝胶电泳中DNA朝正电极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比。2.噬菌体展示技术：将基因表达产物与亲和选择相结合。基本原理：将编码“诱饵”的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合，表达产物直接捕获与“诱饵”相互作用的蛋白质。3.蛋白质磷酸化分析技术：包括底物蛋白磷酸化和蛋白激酶活性检测。第七

43、章 原核基因表达调控模式表达基因分为组成性基因（管家基因）、可诱导基因、可阻遏基因。操纵子：指一组功能上相关的基因，由启动区、操纵区和结构基因三部分组成。 结构基因：编码蛋白质的基因。 操纵区:是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调 控蛋白结合在操纵子序列上，会影响其下游基因转录的强弱。 调控基因：是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。一、原核基因表达调控总论1.分类：主要发生在转录水平，根据调控机制的不同分为负转录调控和正转录调控。负转录调控：调节基因产物为阻遏蛋白，分为负控诱导和负控阻遏。正转录调控：调节基因产物为激活蛋白，分为正控诱导和正控阻

44、遏。2. 调节类型：可诱导调节：基因活化，如大肠杆菌的乳糖操纵子。可阻遏调节：基因沉默，如大肠杆菌的色氨酸操纵子。3.弱化子调节：起信号作用的是氨基酸-tRNA的浓度。4.降解物调节：降解物抑制作用，通过提高转录强度调节基因表达。5.细菌的应急反应：信号是鸟苷四磷酸ppGpp和鸟苷五磷酸pppGpp，影响大批操纵子，是超级调控因子，诱导物是空载tRNA。二、乳糖lac操纵子与负控诱导系统 属于降解物敏感型操纵子1.结构：阻遏子lacI+启动区P+操纵区O+结构基因（lacZ+lacY+lacA） Z编码-半乳糖苷酶，Y编码-半乳糖苷透过酶，A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶（非必需）2. 乳糖操纵子

45、的负控诱导调控模式：无葡萄糖的情况下，诱导物（异构乳糖或安慰性诱导物IPTG）通过与阻遏物结合，使之不能与操纵区相结合，从而激发lac mRNA的合成。本底水平的永久性合成：在非诱导状态下有少量的lac mRNA合成。代谢物阻遏效应：葡萄糖的某些降解产物抑制lac mRNA的合成。3.正调控：cAMP-CRP（代谢物激活蛋白）复合物结合在DNA的启动子区域，形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构，激活lac mRNA的合成，而阻遏物是与O区结合影响了RNA聚合酶与启动区结合。4.其他问题：A基因的生理功能:把乙酰基从供体转移到半乳糖苷分子，抑制-半乳糖苷有害衍生物在细胞内积累。-半乳糖苷酶：

46、-半乳糖苷透过酶：-半乳糖苷乙酰基转移酶=1:0.5:0.2的原因：翻译过程中lac mRNA与核糖体脱离、A基因更易受内切酶作用而发生降解。三、色氨酸trp操纵子与负控阻遏系统1.结构：启动区P+操纵区O+前导区trpL+弱化子区trpa（123150位）+结构基因（7个）2.阻遏系统（粗调）：辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合并关闭trp mRNA转录。信号：色氨酸的浓度。反应慢。3.弱化系统（细调）：弱化子通过自我配对形成茎-环结构，使转录达到第一个结构基因之前过早终止。根本原因：色氨酸的浓度。信号：tRNATrp的浓度。反应快。前导肽：一个含有14个氨基酸的假设多

47、肽，有1、2、3、4 区，3-4配对区是终止密码子的识别区。弱化理论：色氨酸浓度低tRNATrp少核糖体移动速度慢，停止在1区2-3配对转录继续 色氨酸浓度高tRNATrp多核糖体移动速度快，到达2区3-4配对转录终止4.其他调控机制：色氨酸激活的负阻遏蛋白。四、其他操纵子1.半乳糖gal操纵子特点：galR与结构基因及操纵区O等基因簇的距离远。有两个启动子，可从不同起始点转录：启动子S1：无葡萄糖、有cAMP-CRP才进行的半乳糖的高水平合成；启动子S2：有葡萄糖、无cAMP-CRP才进行的本底水平的永久性合成。有两个O区。2. 阿拉伯糖操纵子araBAD：结构：调节基因araC（表达蛋白为

48、正负调节因子）+araO2+araO1+Pc+CRP结合位点+araI+PBAD+结构基因调控机制：无AraC蛋白Pc启动子起始araC基因转录有葡萄糖PrAraC蛋白使操纵区araO2与araI结合形成DNA回转结构基因不表达只有阿拉伯糖PiAraC蛋白与阿拉伯糖结合，协同cAMP-CRPRNA聚合酶与DNA结合基因表达3. 阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答实质：把LexA阻遏蛋白从SOS体系（包括recA基因）的上游调控区移开过程：DNA受损复制中断，单链DNA缺口增加RecA与缺口相结合激活切割LexA蛋白SOS表达4. 二组分调控系统和信号转导过程:环境信号传感激酶磷酸化磷酸

49、基团转移到应答调节蛋白应答调节蛋白成阻遏或激活蛋白5. 多启动子调控的操纵子rRNA操纵子（rrnE）:对数生长期强启动子P1起始转录，ppGpp浓度增加（SOS）时弱启动子P2起始。核糖体蛋白SI操纵子（rpsA）:正常时强启动子P1、P2起始，ppGpp浓度增加时弱启动子P3、P4起始。DnaQ蛋白操纵子：DNA聚合酶全酶亚基。按RNA聚合酶活性高低分别激活强启动子P1和弱启动子P2。5、 转录水平上的其他调控方式：因子、组蛋白类似蛋白、调控因子、抗终止因子的调节作用。六、转录后调控1.稀有密码子对翻译的影响：细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，翻译过程容易受阻。2.重叠基因对翻译的影响

50、：前一个基因的终止密码子与后一个基因的起始密码子共用一个或几个核苷酸，或后一个基因的SD序列位于前一个基因的终止密码子之前，导致翻译偶联，保证基因的等量翻译。3.魔斑核苷酸水平对翻译的影响：魔斑指ppGpp和pppGpp。当氨基酸缺乏时，不负载氨基酸的tRNA结合到核糖体上，使细胞产生严密控制，RNA合成速度与蛋白质合成速度一起下降。第八章 真核基因表达的调控真核基因表达调控的最明显特征：能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现“预定”的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官保持正常功能。基因表达调控的层次：1.转录水平上的调控 2.转录后水平上的调控：mRNA加工

51、成熟水平上的调控 翻译水平上的调控。真核生物基因调控分为两大类：1. 瞬时调控或可逆性调控：包括某种底物或激素水平升降时，或细胞周期不同阶段中酶活性的调节。2.发育调控或不可逆调控：真核基因调控的精髓部分，决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。一、真核生物的基因结构与转录活性1.真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在差异。2.基因家族：简单多基因家族、复杂多基因家族（组蛋白）、发育调控的复制多基因家族（血红蛋白）3.真核基因的断裂结构：外显子、内含子、连接区（高度保守性和特异性碱基序列）可变调控：组成型剪接（只产生一种成熟mRNA），选择型剪接（一个基因的内含子成为另

52、一个基因的外显子，形成基因的差别表达）4. 真核生物DNA水平上的基因表达调控：基因本身或它的拷贝数发生了永久性变化。开放型活性染色体结构：更易降解。基因扩增：某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要。基因重排与变换：将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录。例子：免疫球蛋白结构基因（B-淋巴细胞合成）和T-细胞受体基因的表达（T-淋巴细胞合成）、酵母的交配型交换（存在“沉默交换型盒”）、人血红蛋白。5.DNA甲基化与基因活性调控：甲基化关闭活性，去甲基化诱导表达甲基化酶：日常型甲基转移酶（甲基化母链指导，催化半甲基化DNA）

53、 从头合成型甲基转移酶（不需母链指导，催化未甲基化DNA，速度慢）甲基化抑制基因转录（强启动子在低甲基化下可恢复转录）、提高突变频率。X染色体失活：X染色体失活中心Xic，失活基因Xist失活X染色体机制：Xist去甲基化Xist转录其他位点高度甲基化X染色体失活2、 真核基因转录机器的主要组成：顺式作用元件、反式作用因子。以RNA聚合酶为例1. 启动子：决定RNA聚合酶转录起始点和转录频率的关键元件，分为核心启动子（转录起始点及TATA盒）和上游启动子 （CAAT盒和GC盒）2.增强子：大多为重复序列，功能受DNA双螺旋空间构象的影响。3.反式作用因子DNA识别或结合域：螺旋-转折-螺旋H-

54、T-H、锌指结构、碱性-亮氨酸拉链bZIP、同源域蛋白、突环转录活化结构域：形成蛋白质复合物。连接区4.真核生物转录调控的主要模式：信号转导。有离子通道受体、G蛋白偶联受体、跨膜蛋白激酶受体。3、 蛋白质磷酸化对基因转录的调控1.受体分子活化的两条途径：受体本身或受体结合蛋白具有内源酪氨酸激酶活性，胞内信号通过酪氨酸激酶途径得到传递。配体与细胞表面受体结合，通过G蛋白介导的效应系统产生介质，活化丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶，从而传递信号。2.蛋白激酶：分为丝氨酸/苏氨酸型、酪氨酸型、组氨酸型。或信使依赖型、非信使依赖型受cAMP水平调控的A激酶PKA 依赖于Ca2+，受DAC和Ca2+双重影响的

55、C激酶PKC MAP激酶3. 蛋白质磷酸化影响细胞分裂三、蛋白质乙酰化对基因表达的影响：组蛋白乙酰转移酶HAT、组蛋白去乙酰化酶HDAC乙酰化：降低组蛋白与DNA的亲和性，增强DNA结合能力，提高转录活性。去乙酰化：抑制DNA转录。四、其他水平上的表达调控1.RNA的加工成熟：简单转录单位 复杂转录单位 利用多个加poly A位点和不同的剪接方式产生不同的蛋白质 虽无剪接，但有多个转录起始位点或加poly A位点的基因2.翻译水平的调控：铁应答元件：转铁蛋白受体、铁蛋白；可溶性蛋白因子（起始因子）调控翻译起始因子(IF)的调节：eIF-4F的可逆磷酸化激活蛋白质的合成。eIF-2的磷酸化引起翻

56、译起始受阻，降低蛋白质的生物合成水平。第9章 疾病与人类健康1、 肿瘤与癌症1. 癌基因：病毒癌基因、细胞转化基因（“持家基因”原癌基因突变）2. 原癌基因产物：与膜结合的蛋白 可溶性蛋白 核蛋白3. 细胞癌变：显性的癌基因与隐性的抑癌基因经过多阶段的协同作用形成。2、 人类免疫缺陷病毒HIV：反转录病毒1. 结构：两条单链正链RNA。2. 宿主：人体的T淋巴细胞及巨噬细胞。3. 最大特点：含有许多调控基因3、 乙型肝炎病毒HBV1. 结构：有部分单链区的环状双链DNA分子，两条单链长链为负链、断链为正链。基因组依靠正链5端的黏性末端与负链缺口部位的互补维持环状结构。分为大球形颗粒、小球形颗粒、管形颗粒