编织聚乙烯醇支架材料构建前交叉韧带的生物相容性和力学性能分析

1、编织聚乙烯醇支架材料构建前交叉韧带的生物相容性和力学性能分析    中国 作者：白利明， 陈鸿辉， 叶春婷， 邹海燕， 戴丽冰， 张鸣生 【摘要】 目的通过对编织聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）材料的生物相容性和力学性能的分析，初步探讨运用该材料构建组织工程前交叉韧带支架的可行性。方法将体外分离培养的人前交叉韧带细胞和NIH3T3细胞分别种植在编织构建支架材料上进行立体培养，观察细胞在支架材料上的生长情况；然后运用 电子 拉力机对支架材料进行力学性能测试并进行分析。结果细胞在支架材料上生长良好，并分泌细胞外基质；支架材料的最大负荷、

2、最大应变和极限抗张强度分别达169.78±9.18N、11.67%±1.38%、52.21±2.88 MPa。结论该支架材料具有优良的生物相容性和肯定的力学性能，有望通过改进力学性能后成为一种较理想的组织工程前交叉韧带支架材料。 【关键词】 聚乙烯醇； 支架材料； 编织； 生物相容性； 力学性能； 膝前交叉韧带 Abstract：ObjectiveTo investigate the feasibility of the fabrication of tissue?engineered anterior cruciate ligament (ACL) in vit

3、ro by studying biocompatibility and mechanical property of the braided polyvinyl alcohol (PVA) materials.MethodFirstly, human ACL cells and NIH3T3 cells were isolated, expanded in vitro and seeded onto the surface of the braided PVA scaffold materials, the adhesion, proliferation and three?dimension

4、al growth of cells on the scaffold were observed by SEM. Secondly, the biomechanical properties of the braided PVA scaffold materials were measured with electro?biomechanical machine.ResultThe braided PVA scaffold materials had no cytotoxicity, ACL and NIH3T3 cells adhered, grew and proliferated wel

5、l both on the surface and in the holes of the braided PVA scaffold materials. The maximum load, the maximum strain and ultimate tensile stress of the braided PVA scaffold materials respectively were 169.78±9.18N, 11.67±1.38% and 52.21±2.88MPa.ConclusionThe braided PVA scaffold materia

6、ls possess good biomechanical properties and biocompatibility, it may become an ideal biomaterial for fabricating tissue?engineering ACL if the biomechanical properties can be improved. Key words：polyvinyl alcohol(PVA); scaffold material; braiding; biocompatibility; mechanical property; knee; anteri

7、or cruciate ligament(ACL) 前交叉韧带断裂是最常见的膝关节损伤之一。ACL本质撕裂常无法自愈，运用自体或异体移植物在关节镜下重建ACL是目前常用的 治疗 方法1。自体移植物来源有限且存在供区部位并发症；异体移植物也受来源限制，还有传播疾病和产生免疫排异的风险；人工韧带材料重建ACL的远期疗效还存在争议，限制了其临床应用。组织工程技术的 发展 和应用为ACL重建提供了新思路和方法。 本文拟运用聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）纤维编织构建韧带支架材料，通过分析支架材料的生物相容性和力学性能，探讨运用该材料构建膝前交叉韧带支架的可行性。 1 材料与方法

8、1.1 材料与主要仪器 1.1.1 主要材料 聚乙烯醇（进口分装，分子式(C2H4O)n，平均聚合度124，水解度97%），DMEM培养基 (Gibco, USA)，I型胶原酶(Gibco, USA)，、型胶原兔抗人或鼠多克隆抗体、即用型免疫组化SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）等。 1.1.2 主要仪器 电子拉力测试机（H25KS?S, Hounsfield Test Equipment Ltd，UK），扫描电镜（PHILIPS, ESEM?30），激光共聚焦显微镜(ZEiSS 510Meta，Germany)，倒置相差显微镜(IMT?2，OLMYPUS，Japan)，图像分析仪（

9、Axio Vision，Germany）等。 1.2 方法 1.2.1 ACL细胞的体外分离培养和鉴定 1.2.1.1 无菌取膝骨性关节炎患者未受损的ACL组织，按照组织块和胶原酶消化培养法2在体外分离培养并扩增ACL细胞。 1.2.1.2 将培养23代ACL细胞进行吖啶橙（acridine orange, OA）染色，在激光共聚焦显微镜下观察ACL细胞的形态特征。 1.2.1.3 在ACL细胞中加、型胶原单克隆抗体（浓度为1200），阴性对照加PBS。按照SABC免疫组化试剂盒的步骤检测ACL细胞分泌、型胶原的情况。 2.2 编织支架材料接种细胞前处理 将编织成形的支架材料修剪成约21 mm

10、×2.4 mm×1.4mm大小，分别经过0.1 mol/L稀盐酸、0.1 mol/L氢氧化钠和蒸馏水超声洗涤5次，置入6孔培养板包装后，经60Co辐照（剂量6 kGy，8 min）灭菌，然后用DMEM培养基充分浸泡24 h，在接种细胞前再用无血清的DMEM培养基反复洗几遍，备用。 2.3 编织支架材料接种细胞并观察 取35代ACL细胞和NIH3T3细胞分别进行消化，制成细胞悬液（浓度为1×105/ml），种植于编织支架材料上，在37、5%CO2培养箱内孵育2 h，再复种1次，然后在培养箱内静置培养6 h，加入充足培养基，以后每隔2 d换培养基1次，分别在第3、7

11、d搜集支架材料细胞复合物。 种植NIH3T3细胞的支架材料细胞复合物经过0.01 mol/L PBS清洗，0.01%吖啶橙染色，在激光共聚焦显微镜下观察细胞在支架材料上的生长情况；种植两种细胞的支架材料细胞复合物分别经过0.01 mol/L PBS清洗、2.5%戊二醛固定、梯度酒精脱水、醋酸异戊酯置换、CO2临界点干燥、喷金，在扫描电镜下观察细胞在支架材料上的生长情况。 2.4 聚乙烯醇纤维丝的制作 称取肯定质量的PVA粉末，用75%酒精浸泡48 h充分溶胀后，去除部分杂质，再用蒸馏水反复冲洗多次，除去残余的酒精，按20%（w/v）比例加蒸馏水后，在7080°C水浴加热使PVA溶解，

12、配制成20% PVA溶液，然后高速离心（18 000 r/min, 20 min）去除杂质。20%聚乙烯醇溶液经过喷丝（上海东华大学材料研究所协助制作），制作聚乙烯醇纤维丝材料。 2.5 编织构建前交叉韧带支架材料 运用两种方法编织构建韧带支架材料：一种方法是将PVA纤维经过钩花后形成有孔的单条丝束，以每4条丝束为1股，以3股这样的丝束，编织构建韧带支架材料；另一种方法是将20条PVA纤维平行编成1股作为编织的丝束，用3股这样的丝束，编织构建韧带支架材料。 2.6 编织支架材料的力学性能测试各取8条两种不同的韧带支架材料均经0.2 mol/L PBS（PH7.4）充分浸泡48 h后进行力学测试

13、，运用游标卡尺测量材料中间部分的长、宽和厚度（测量3次，取平均值）， 计算 其横截面积，在电子拉力机上以100 mm/min的速度进行单轴拉伸力学测试，运用电子拉力机自带软件（QMAT Professional material testing software）计算支架材料的极限抗张强度、最大拉应力、最大负荷、弹性模量等力学性能指标，运用SPSS11.5软件包分析测量结果并绘制负荷拉伸曲线和应力应变曲线，分析支架材料的力学性能。 2 结 果 2.1 ACL细胞的形态学特征 在体外培养的条件下，ACL细胞贴壁生长。细胞呈梭形，核呈圆形或卵圆形，位于细胞质的中心，与典型的成纤维细胞形态相似；25

14、代ACL细胞增殖最为旺盛。细胞的形态主要以梭形为主，核呈圆形或卵圆形，位于细胞中心，胞质可向外伸出数个长短不等的突起，呈典型的成纤维细胞特征（图12）。 2.2 ACL细胞、型胶原蛋白的表达 、型胶原蛋白免疫组化结果显示：所有滴加一抗的细胞，核呈浅蓝色淡染，胞浆内含有丰富的棕黄色颗粒，主要分布在细胞核周围，胞浆外无棕黄色颗粒出现（图34），表明胞浆内含有较多由ACL细胞分泌的、型胶原蛋白，所培养的细胞为韧带成纤维细胞。 2.3 NIH3T3细胞在支架材料上生长情况 激光共聚焦显微镜观察显示，支架材料上有大量的NIH3T3细胞生长，并可见细胞分泌基质（图56）；在扫描电镜下可见支架材料上有大量细

15、胞生长，细胞呈圆形并伸出伪足在支架材料上黏附生长，伴着工夫增加，细胞分泌的基质不断增加（图78）。 2.4 ACL细胞在支架材料生长情况 扫描电镜显示，ACL细胞能在支架材料上黏附，细胞伸出突起附着于材料表面或孔隙内。细胞在材料上呈多角形或梭形，支架表面和孔隙内可见细胞分泌的胶原蛋白丝状物质。伴着工夫增加，细胞间相互联结成片状 网络 结构，分泌较多细胞外基质；部分孔隙内可见胶原蛋白丝状物质相互联结成网状，丝状物的排列较乱，没有肯定的 规律 性（图910）。 2.5 两种编织支架材料的力学性能 两种不同的支架材料的力学性能测试结果如下（表1）。表1 两种不同的支架材料的力学性能测试结果 2.6

16、编织支架材料的应力应变和负荷拉伸曲线 根据电子拉力机软件系统分析绘制的支架材料典型应力应变和负荷拉伸曲线呈非线性曲线（图11-12）。 图1 倒置相差显微镜观察组织块培养的原代ACL细胞的形态 100× 图2 AO染色激光共聚焦显微镜观察ACL细胞的形态学特征 100× 图3 ACL细胞分泌型胶原蛋白 LM 200× 图4 ACL细胞分泌型胶原蛋白 LM 200× 图5 NIH3T3细胞在支架材料上生长7 d，细胞生长良好，可见细胞分裂 100× 图6 NIH3T3细胞在支架材料上生长7 d，细胞生长良好，细胞并联结成片 100× 图7 NIH3T3细胞在支架材料上生长3 d，细胞生长良好 SEM 1500× 图8 NIH3T3细胞在支架材料上生长7 d，分泌较多细胞外基质 SEM 1000× 图9 ACL细胞在支架材料上生长3 d，细胞呈梭状，生出伪足黏附生长 SEM 445× 图10 ACL细胞在支架材料上分泌较多细胞外基质 SEM 1000 ×图11 纤维钩花编织支架材料的负荷拉伸曲线 图12 平行纤维编织支架材料的负荷拉伸曲线 3 讨 论 3.1 支架材料的生物相容性 目前，运用体外模拟实