生物化学技术原理及应用

1、南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院生物化学技术原理及应用生物化学技术原理及应用第七章第七章 光谱与质谱光谱与质谱2022-4-252南京农业大学 生命科学学院 紫外紫外-可见光谱可见光谱 红红 外外 光光 谱谱 质质 谱谱 法法 核核 磁磁 共共 振振1234 分分 光光 光光 度度 法法5 荧荧 光光 分分 析析 法法62022-4-252南京农业大学 生命科学学院第七章第七章 光谱与质谱光谱与质谱v 光谱光谱是复色光经过色散系统（如棱镜、光栅）分光后，被色散开单色光按波长（或频率）大小而依次排列的图案。v 光波是由原子内部运动的电子产生的。各种物质的原子内部电子的运动情况不

2、同，所以2022-4-253南京农业大学 生命科学学院 它们发射的光波也不同。研究不同物质的发光和吸收光的情况，有重要的理论和实际意义，已成为一门专门的学科光谱学光谱学。2022-4-25南京农业大学 生命科学学院4第七章第七章 光谱与质谱光谱与质谱v 由于每种原子都有自己的特征谱线，因此可以根据光谱来鉴别物质和确定它的化学组成，这种方法叫做光谱分析光谱分析。v做光谱分析时，可以利用发射光谱，也可以利用吸收光谱这种方法的优点是非常灵敏而且迅速。某种元素在物质中的含量达10-10克，就可以从光谱中发现它的特征谱线，因而能够把它检查出来。v 光谱的分类：n按波长区域不同，光谱可分为红外光谱、可见光

3、谱和紫外光谱；n按产生的本质不同，可分为原子光谱、分子光谱；n按产生的方式不同，可分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱；n按光谱表观形态不同，可分为线光谱、带光谱和连续光谱。2022-4-255南京农业大学 生命科学学院第七章第七章 光谱与质谱光谱与质谱v 由于每种原子都有自己的特征谱线，因此可以根据光谱来鉴别物质和确定它的化学组成，这种方法叫做光谱分析光谱分析。v做光谱分析时，可以利用发射光谱，也可以利用吸收光谱这种方法的优点是非常灵敏而且迅速。某种元素在物质中的含量达10-10克，就可以从光谱中发现它的特征谱线，因而能够把它检查出来。v 光谱的分类：n按波长区域不同，光谱可分为红外光谱、可见光

4、谱和紫外光谱；n按产生的本质不同，可分为原子光谱、分子光谱；n按产生的方式不同，可分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱；n按光谱表观形态不同，可分为线光谱、带光谱和连续光谱。2022-4-256南京农业大学 生命科学学院第七章第七章 光谱与质谱光谱与质谱v 分光光谱技术可用于：n通过测定某种物质吸收或发射光谱来确定该物质的组成；n通过测量适当波长的信号强度确定某种单独存在或其他物质混合存在的一种物质的含量；n通过测量某一种底物消失或产物出现的量同时间的关系，示踪反应过程。v 鉴定分子式、结构式的方法（四大名谱）：n质谱。离子峰、碎片峰，物质大小测定。n紫外光谱。反映分子中共轭体系状况。n红外光谱

5、。官能团鉴定、分子中环、双键数目。n核磁共振。验证上述方法的正确性，提供分子二、三级结构信息。2022-4-257南京农业大学 生命科学学院第一节第一节 紫外紫外-可见光谱可见光谱v 有机分子吸收紫外光后，发生电子能级的跃迁，所测得的吸收光谱；一般紫外光谱仪所用的波长范围为200nm-800nm，即包括可见光区，因而也叫紫外紫外-可见光谱可见光谱。v 在有机化合物的结构测定中，紫外-可见光谱与红外光谱不同，它一般不能用来鉴别具体的官能团，而能用来推测分子中是否存在发色团和共轭体系，只要分子含有相同的发色团和共轭体系，就有十分相似的紫外光谱。v 有机物的紫外吸收光谱受共轭效应，互变异构效应及溶剂

6、效应等因素影响。2022-4-258南京农业大学 生命科学学院第一节第一节 紫外紫外-可见光谱可见光谱v 紫外光谱的应用：n单独使用紫外光谱进行有机化合物结构分析比较困难，紫外光谱只有与其它物理、化学资料及其它光谱方法结合，才能发挥较大作用。n紫外光谱在确定发色团种类，判断某些方面的异构体及确定不饱和化合物的结构骨架等方面起重要作用。n在结构分析中应用：顺反异构体的判别；有机化合物可能结构的推断；有机物分子量的确定。v 注意：n近紫外区200300nm 空气无干扰n测定时样品放在石英杯中n紫外区小于200nm空气有吸收峰，须在真空中测定v 谱带特征位置、定性由辐射波长而定；强度、定量由辐射能量

7、决定。2022-4-259南京农业大学 生命科学学院第一节第一节 紫外紫外-可见光谱可见光谱v 紫外光谱的应用：n从吸受光谱中初步推断官能团：n一个化合物在220-800nm范围内无吸收（1），它可能是脂肪族饱和碳氢化合物、醇、醚、羧酸、胺等，不含直链或环状共轭体，没有醛、酮等基团。在210-250nm有吸收带，可能含量2个共轭单位250-300nm有弱吸收带，表示有羰基存在。n异构体的推定：n许多异构体可以利用双键位置不同，通过紫外吸收光谱推断异构体结构。n化合物骨架的推定：n未知化合物与已知化合物的紫外吸收光谱一致时，可以认定两者具有同样的发色团。通过这个原理可以推定未知化合物的骨架。20

8、22-4-2510南京农业大学 生命科学学院第二节第二节 红外光谱红外光谱v 研究红外光谱的方法主要是红外吸收光谱法红外吸收光谱法，即用连续波长的红外光为光源照射样品，分子发生键振动能级的跃迁，所测得的吸收光谱。v 红外光谱图中的吸收峰是由键的振动引起的，同一类型的化学键振动频率非常相似，总是出现在某一固定范围内，因此有机化合物中的各类官能团和一些基团具有特征的吸收峰。根据官能团区吸收峰位置可以推测未知化合物所含的官能团。v 红外光谱具有高度的特征性，不但可以用来研究分子的结构和化学键，如力常数的测定等，而且广泛地用于表征和鉴别各种化学物种。2022-4-2511南京农业大学 生命科学学院20

9、22-4-2511南京农业大学 生命科学学院第二节第二节 红外光谱红外光谱v 仪器类型与结构仪器类型与结构v 使用的光谱有两种类型：n一种是单通道或多通道测量的棱镜或光栅色散型光谱仪，n另一种是利用双光束干涉原理并进行干涉图的傅里叶变换数学处理的非色散型的傅里叶变换红外光谱仪。v现代红外光谱议是以傅立叶变换为基础的仪器。该类仪器不用棱镜或者光栅分光，而是用干涉仪得到干涉图，采用傅立叶变换将以时间为变量的干涉图变换为以 频率为变量的光谱图。傅立 叶红外光谱仪的产生是一次 革命性的飞跃。与传统的仪 器相比，傅立叶红外光谱仪 具有快速、高信噪比和高分 辨率等特点。2022-4-2512南京农业大学

10、生命科学学院2022-4-2512南京农业大学 生命科学学院第二节第二节 红外光谱红外光谱v 红外光谱示意图：红外光谱示意图：2022-4-2513南京农业大学 生命科学学院2022-4-2513南京农业大学 生命科学学院第三节第三节 质质 谱谱v 质谱分析法质谱分析法是将不同质量的离子按质荷比（m/z）的大小顺序收集和记录下来，得到质谱图，用质谱图进行定性、定量分析及结构分析的方法。v 质谱分析法是物理分析法，早期主要用于相对原子质量的测定和某些复杂化合物的鉴定和结构分析。2022-4-2514南京农业大学 生命科学学院v 随着GC和HPLC等仪器和质谱仪联机成功以及计算机的飞速发展，使得质

11、谱法成为分析、鉴定复杂混合物的最有效工具。2022-4-2514南京农业大学 生命科学学院第三节第三节 质质 谱谱v 突出特点（与核磁、红外、紫外相比）:n质谱法是唯一可以确定分子质量的方法n灵敏度高，样品用量少n通常只需微克级样品，检出限可达10-14 gn应用范围广n质谱仪种类很多，应用范围广，可进行同位素分析、化学分析、无机成分分析、有机结构分析n被分析对象：气体、液体、固体2022-4-2515南京农业大学 生命科学学院2022-4-2515南京农业大学 生命科学学院第三节第三节 质质 谱谱v 基本原理:v 质谱法一般采用高速电子来撞击气态分子，将电离后的正离子加速导入质量分析器，然后

12、按质荷比（m/z）的大小顺序进行收集和记录，得到质谱图，根据质谱峰的位置进行定性和结构分析，根据峰的强度进行定量分析。2022-4-2516南京农业大学 生命科学学院气态分子气态分子高速电子撞击高速电子撞击正离子正离子加速导入加速导入质量分析器质量分析器收集质谱图收集质谱图峰位置定性定结构峰位置定性定结构峰强度定量分析峰强度定量分析2022-4-2516南京农业大学 生命科学学院第三节第三节 质质 谱谱v质谱分析仪结构示意图质谱分析仪结构示意图2022-4-2517南京农业大学 生命科学学院质量分析器离子源分子分离器2022-4-2517南京农业大学 生命科学学院第三节第三节 质质 谱谱v 质

13、谱分析仪的组成：质谱分析仪的组成：v 质谱仪主要包括六部分：质谱仪主要包括六部分：n真空系统n进样系统n离子源n质量分析器n离子检测器n计算机自动控制和数据处理系统2022-4-2518南京农业大学 生命科学学院2022-4-2518南京农业大学 生命科学学院第三节第三节 质质 谱谱v 质谱分析仪的组成：质谱分析仪的组成：v 高真空系统n在质谱分析中，为了降低背景以及减少离子间或离子与分子间的碰撞，离子源、质量分析器及检测器必须处于高真空状态。离子源（10-410-5 ）质量分析器（10-6 Pa）。v 进样系统n进样系统作用是将待测物质（试样）送进离子源。一般有：n直接进样高沸点的试液、固体

14、试样可用探针或直接进样器送入离子源，调节温度使试样气化n间接进样一般气体或易挥发试样n色谱进样色谱-质谱联用仪器中，经色谱分离的组分通过接口元件直接导入离子源。2022-4-2519南京农业大学 生命科学学院2022-4-2519南京农业大学 生命科学学院v 质谱分析仪的组成：质谱分析仪的组成：v 离子源n其作用使样品离子化，并使离子汇聚成具有一定形状和能量的离子束。它是质谱仪的心脏。离子源的结构和性质对质谱仪的分辨率、灵敏度影响很大。使物质电离的方法很多：电子轰击，化学电离、火花电离、ICP离子源等。v 质量分析器n作用是将离子源产生的离子按质荷比 m/z 大小分离，使符合条件的离子飞过分析

15、器，过滤掉不符合条件的离子。常见的有单聚焦质量分析器，双聚焦质量分析器和四极滤质器等。v 离子检测器和记录系统n经质量分析器分离的离子，到达检测器进行接受检测，经放大器放大后，由记录仪记录下来。常用离子检测器：静电式电子倍增器、法拉第筒接受器、照相版和闪烁计数器等。2022-4-2520南京农业大学 生命科学学院2022-4-2520南京农业大学 生命科学学院第三节第三节 质质 谱谱v 质谱图质谱图v 以质荷比m/z 为横坐标，离子相对强度为纵坐标，相对强度是把原始质谱图上最强的离子峰定为基峰，规定其相对强度为100%，其它离子峰以对基峰的相对百分值表示，由质谱图很直观地观察整个分子的质谱信息

16、。2022-4-2521南京农业大学 生命科学学院2022-4-2521南京农业大学 生命科学学院第三节第三节 质质 谱谱v 质谱图质谱图2022-4-2522南京农业大学 生命科学学院2022-4-2522南京农业大学 生命科学学院第三节第三节 质质 谱谱v 气质联用（气质联用（GC-MS）v 气质联用是对气相色谱-质谱联用技术的简称，是将气相色谱仪器（GC）与质谱仪（MS）通过适当接口相结合，借助计算机技术，进行联用分析的技术。GC-MS是最成熟的两谱联用技术。2022-4-2523南京农业大学 生命科学学院2022-4-2523南京农业大学 生命科学学院第三节第三节 质质 谱谱v 气质联

17、用（气质联用（GC-MS）v 气质联用仪由GC、MS和接口三部分组成。其中前两部分原理与单独的仪器相同。v GC-MS的接口：由GC出来的样品通过接口进入到质谱仪，接口是色质联用系统的关键。v 接口作用：n压力匹配质谱离子源的真空度在10-3Pa，而GC色谱柱出口压力高达105Pa，接口的作用就是要使两者压力匹配。n组分浓缩从GC色谱柱流出的气体中有大量载气，接口的作用是排除载气，使被测物浓缩后进入离子源。v 常见接口技术有：分子分离器连接（主要用于填充柱）；直接连接法（主要用于毛细管柱）；开口分流连接（放空一部分色谱流出物，让另一部分进入质谱仪。此法样品利用率低。）2022-4-2524南京

18、农业大学 生命科学学院2022-4-2524南京农业大学 生命科学学院2022-4-2525南京农业大学 生命科学学院气质联用仪气质联用仪气质联用气质联用基本原理基本原理第四节第四节 核磁共振核磁共振v 核磁共振核磁共振（NMR）v 核磁共振谱核磁共振谱技术，是将核磁共振现象应用于分子结构测定的一项技术。v 在外加磁场的作用下，原子核的自旋方向达到一致，可以和一定频率的外加磁场共振而形成吸收峰，同一种原子核在分子中的位置不同，因其外围的电子云对核的屏蔽作用引起的吸收峰位置移动（化学位移）也不同，由吸收峰的位置可以推断原子处于哪一个基团。在1H-NMR谱中，当相邻基团上有n个质子时，该基团的质子

19、吸收峰将分裂成n+1个峰。v 核中电子运动产生磁场是吸收光谱的另一种形式。在适宜的条件下样品能吸收射频区的频率，所吸收的电磁频率能反映样品的特征。2022-4-2526南京农业大学 生命科学学院2022-4-2526南京农业大学 生命科学学院第四节第四节 核磁共振核磁共振v NMR给出的信息：n化学位移：各种结构的1H、13C有不同的化学位移，对结构敏感。n磁性核附近的取代情况及空间排列：通过偶合常数J和自旋-自旋裂峰来判断。核磁共振谱中的每一个峰都有归属！n峰面积（积分高度）：n用于结构分析：各种化学环境相同的核（1H）的个数；n用于成分分析：由特征峰定量。2022-4-2527南京农业大学

20、 生命科学学院2022-4-2527南京农业大学 生命科学学院第四节第四节 核磁共振核磁共振v 基本原理：基本原理：v 有些原子核有自旋，而有些原子核没有自旋，凡质量数和原子序数均为偶数的原子核（如碳12）的自旋量子数I=0，不自旋。质量数和原子序数至少有1个奇数的原子核，自旋量子数I0，有自旋。v 碳和氢是有机物中最主要的2种元素，其中11H和136C核最重要，所以有机化学中研究最多，目前应用最广的是氢核的核磁共振谱（1H-NMR或PMR）和136C核磁共振谱（13C-NMR）。v 下面以1H-NMR为例来介绍核磁共振的原理。2022-4-2528南京农业大学 生命科学学院2022-4-25

21、28南京农业大学 生命科学学院第四节第四节 核磁共振核磁共振v 由于原子核带有电荷，其自旋会产生小磁场，有一定的磁矩，就好象一个小磁铁。v 当置于外磁场（H0）中时，可以有2I+1种自旋取向，1H核I=1/2，其自旋取向有两种：磁矩与外磁场同向，处于低能态；磁矩与外磁场反向，处于高能态。于是产生能级差。v1H核自旋能级分裂及其与H0的强弱有关：+12m=-m=+12H0NNE12m=-m=+12EH002022-4-2529南京农业大学 生命科学学院v 这两种取向的能量：n为磁旋比；h为普朗克常数；H0为外加电场强度。v 因此对于1H核来说产生自旋能级的跃迁所需能量与外磁场强度成正比，用电磁波

22、来照射外磁场中的自旋氢核，当某频率(V)电磁波的能量（E=hv）恰好与1H核两个能级之间的能级差相等时， 1H核就吸收能量，由低能态跃迁到高能态，发生核的转向（从顺磁向转到反磁向）。这种现象就叫核磁共振核磁共振。v 产生核磁共振条件：n可见，固定H0，改变射或固定射，改变H0都可满足上式，发生核磁共振。但为了便于操作，通常采用后一种方法。 核磁共振基本关系式核磁共振基本关系式2022-4-2530南京农业大学 生命科学学院第四节第四节 核磁共振核磁共振v 有机分子中氢核处于不同的化学环境中,其周围的原子或基团不同，在其周围的电子在外部磁场垂直平面上绕核运动时，会产生与外磁场方向相反的感应磁场来

23、对抗外加磁场，使氢核实际所受的磁场强度减小，这种核周围电子的作用称为屏蔽效应屏蔽效应。v 分子中不同类型的氢核由于电子屏蔽效应的不同，其共振吸收峰出现在NMR谱中的不同位置，这种位置的差异称化学位移化学位移。v 在NMR谱中共振吸收峰的面积与产生此吸收的氢核数目成正比。分子中邻近氢核的自旋会产生相互干扰称自旋偶合，由于自旋偶合引起谱线增多的现象叫自旋裂分自旋裂分。 根据核磁共振提供的三种重要信息化学位移，积分线高度和自旋偶合裂分，就可以分析未知物的分子中氢核的分布情况，并结合质谱，红外光谱所得数据，掌握了未知物分子质量及所含的光能团，就能迅速确定未知物的结构式。2022-4-2531南京农业大

24、学 生命科学学院第四节第四节 核磁共振核磁共振v 有机分子中氢核处于不同的化学环境中,其周围的原子或基团不同，在其周围的电子在外部磁场垂直平面上绕核运动时，会产生与外磁场方向相反的感应磁场来对抗外加磁场，使氢核实际所受的磁场强度减小，这种核周围电子的作用称为屏蔽效应屏蔽效应。v 分子中不同类型的氢核由于电子屏蔽效应的不同，其共振吸收峰出现在NMR谱中的不同位置，这种位置的差异称化学位移化学位移。v 在NMR谱中共振吸收峰的面积与产生此吸收的氢核数目成正比。分子中邻近氢核的自旋会产生相互干扰称自旋偶合，由于自旋偶合引起谱线增多的现象叫自旋裂分自旋裂分。 根据核磁共振提供的三种重要信息化学位移，积

25、分线高度和自旋偶合裂分，就可以分析未知物的分子中氢核的分布情况，并结合质谱，红外光谱所得数据，掌握了未知物分子质量及所含的光能团，就能迅速确定未知物的结构式。2022-4-2532南京农业大学 生命科学学院第四节第四节 核磁共振核磁共振v 核磁共振仪核磁共振仪v 连续波核磁共振仪n根据连续改变RF或H0 ，使观测核一一被激发。 n扫频：固定H0，改变RF；n扫场：固定RF，改变H0（操作更为方便）。n连续波仪器的缺点是工作效率低，因而有被PFT仪器取代的趋势。v 脉冲傅里叶变换（PFT）核磁共振谱仪n采用射频脉冲激发在一定范围内所有的欲观测的核，通过付里叶变换得到NMR谱图。nPFT大大提高了

26、仪器的工作效率。 2022-4-2533南京农业大学 生命科学学院核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪第四节第四节 核磁共振核磁共振2022-4-2534南京农业大学 生命科学学院第五节第五节 分光光度法分光光度法1. 基本原理基本原理v Beer-Lambert 定律定律v 当一束单色光通过溶液时，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就会减弱。设入射光的强度为I0，透过浓度为c，液层厚度为b的溶液后，透射光的强度I必定小于I0，随浓度和厚度的增加，光被吸收的程度亦增加，透射光的强度则减小。透射光强度与入射光强度的比值，称为透光度，以T表示。v 实验证明，当液层厚度b和溶液浓度c按算术级数增加时，透光度

27、T按几何级数减小，数学式为：A-lgTabcnA：吸光度，又称光密度OD；nT：透光度， TI/I0；na：吸光系数（Lmol1 cm1）； b：样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，则b=1cm； c：样品浓度（mol/L）。2022-4-2535南京农业大学 生命科学学院第五节第五节 分光光度法分光光度法1. 基本原理（基本原理（Beer-Lambert 定律）定律）v 当一束单色光通过溶液时，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就会减弱。设入射光的强度为I0，透过浓度为c，液层厚度为b的溶液后，透射光的强度I必定小于I0，随浓度和厚度的增加，光被吸收的程度亦增加，透射光的强度则减

28、小。透射光强度与入射光强度的比值，称为透光度，以T表示。v 实验证明，当液层厚度b和溶液浓度c按算术级数增加时，透光度T按几何级数减小，数学式为：A-lgTabcnA：吸光度，又称光密度OD；nT：透光度， TI/I0；na：吸光系数（Lmol1 cm1）； nb：样品光程（cm）； nc：样品浓度（mol/L）。bI0Ic2022-4-2536南京农业大学 生命科学学院1.1.基本原理基本原理v Beer-Lambert Beer-Lambert 定律定律n当a、c一定时，吸光度A与液层厚度b成正比，称为朗伯定律。 n当a、b一定时，吸光度A与溶液浓度c成正比，称为比尔定律。 n吸光度与液层

29、厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯比尔定律，即光的吸收定律。其数学表达式为：A=abcv a为比例常数，称吸光系数，有两种表示方式： n摩尔吸光系数，是指在一定波长时，溶液浓度为1mol/L，厚度为1cm的吸光度，用或EM表示。 n百分吸光系数或称比吸光系数,是指在一定波长时，溶液浓度为1%(W/V)，厚度为1cm的吸光度，用E1%1cm表示。 v 吸光系数两种表示方式之间的关系是：= Mr/10 E1%1cm2022-4-2537南京农业大学 生命科学学院1. 基本原理基本原理v 摩尔吸光系数是物质对某波长的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。值越

30、大，说明电子跃迁的几率大，通常 10-105：一般认为 104为强吸收；103-104 为较强吸收；102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。v 因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A0.001, 所以，当b1cm，105时，可检测的溶液最小浓度是C10-8 mol/L。v 的值很难直接测定，通常要先测出E1%1cm再按公式计算求得。v 吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性：n即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。若溶液中各溶质的吸光系数相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。2022-4-2538南京农业大学 生

31、命科学学院1. 基本原理基本原理v 影响吸光系数的因素：影响吸光系数的因素：n物质不同物质不同。吸光系数可作为物质的特性常数。分光光度法中，常用摩尔吸光系数来衡量显色反应的灵敏度，值越大，灵敏度越高。 n溶剂不同溶剂不同。所以在说明某一物质的吸光系数时，应注明溶剂。 n光的波长不同。如将不同波长的单色光依次通过被分析物质，分别测得吸光度，然后绘制吸光度-波长曲线，称为吸收曲线，又称吸收光谱收光谱。由吸收曲线可以看出物质的吸收特征。吸收曲线上有极大值的部分，称为吸收峰。吸收峰所对应的波长，称为最大吸收波长，以符号max表示 ，这是物质定性的依据之一。物质的定量也常选择在max处测定其吸光度，因为

32、在此处测定的灵敏度最高。 n单色光的纯度单色光的纯度。单色光越纯，即经单色器分光后的波长范围越窄，其吸光系数越大。严格说来，朗伯-比尔定律只有当入射光是单色光时才完全适用，但实际上不管仪器中光学系统的质量怎样高，单色化以后的光还是具有一定的宽度，这取决于仪器的精确程度。滤光片的分光本领较差，故一般测得的吸光系数要比真值小得多。2022-4-2539南京农业大学 生命科学学院第五节第五节 分光光度法分光光度法2. 分光光度计的组成分光光度计的组成v 分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器显示装置五部分组成。v 光源光源：n理想光源的条件是：能提供连续的辐射；光强度足够大；在整个光谱区内光谱

33、强度不随波长有明显变化；光谱范围宽；使用寿命长，价格低。n用于可见光和近红外光区的光源是钨灯。适用波长范围是320-1100nm。由于能量输出的波动为电压波动的四次方倍，因此电源电压必须稳定。n用于紫外光区的是氘灯，适用波长范围195-400nm，由于氘灯寿命有限，国产氘灯寿命仅五百小时左右，要注意节约灯时。2022-4-2540南京农业大学 生命科学学院2. 分光光度计的组成分光光度计的组成v 单色器：单色器：v 单色器是分光光度计的心脏部分，其作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作用是：n入射狭缝：限制杂散光进入。n色散元件：即棱镜或光栅，是核心部件，可

34、将混合光分解为单色光。n准直镜：把来自入射狭缝的光束转化为平等光，并把来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上。 n出射狭缝：只让额定波长的光射出单色器。v转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长；调节出入射狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度。2022-4-2541南京农业大学 生命科学学院v 单色样品室单色样品室:v 包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各种可更换的附件。池架有普通池架和恒温池架。v 吸收池有光学玻璃杯和石英玻璃杯两种。n光学玻璃杯因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此只能用于可见光，适用波长范围是400nm-2000nm。n石英玻璃杯可透过紫外光、可见光和

35、红外光， 是最常使用的吸收池，使用波长范围是180nm-3000nm。v 吸收池使用注意事项：n要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净。n严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 n严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。 2022-4-2542南京农业大学 生命科学学院v 检测器检测器:v 检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器以下三种：n光电管：光电管可检测10-11A的光电流，管内

36、抽真空充入惰性气体。n光电倍增管：它是检测弱光的最灵敏最常用的光电元件，其灵敏度比光电管高200多倍，光电子由阴极到阳极重复发射9次以上，每一个光电子最后可产生106-107个电子，因此总放大倍数可达106-107倍，光电倍增管的响应时间极短，能检测10-8-10-9秒级的脉冲光。其灵敏度与光电管一样受到暗电流的限制，暗电流主要来自阴极发射的热电子和电极间的漏电。 n光电二极管：其原理是这种硅二极管受紫外-近红外辐射照射时，其导电性增强的大小与光强或正比。其灵敏度还赶不上光电倍增管，但它的稳定性更好，使用寿命更长，价格便宜。v显示装置：显示装置：n已都使用数字显示，而且有的主机还使用带液晶或C

37、RT荧屏显示的微处理机和打印绘图机。2022-4-2543南京农业大学 生命科学学院第五节第五节 分光光度法分光光度法3. 分光光度法的定性与定量方法分光光度法的定性与定量方法v 定性方法：n一系列不同波长的单色光照射待测溶液，可测的一系列相应的吸光度。以吸光度为纵坐标，以波长为横坐标作图，可以得到待测物质的吸收曲线。通过与标准品比较而定性。n实际工作中常用max 和来定性nmax 可以从吸收曲线中吸收峰所对应的波长直接找出；n通常需配置待测物质三种不同浓度的溶液，在1cm的吸收池中，在max处分别测定其吸光度，根据A= bc,即=A/bc，计算出，将三次结果平均，即是该物质的摩尔吸光系数。2

38、022-4-2544南京农业大学 生命科学学院v 定量方法：v 根据比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与浓度之间有线性关系。因此，只要选择一定的波长测定溶液的吸光度，即可求出浓度。v 吸光系数法（绝对法）：吸光系数法（绝对法）：n根据比尔定律A= c l ，若 l 和吸光系数或E1%1cm已知，即可根据测得的A，求出被测物的浓度。c= A/l 。通常或E1%1cm可以在手册或文献中查到。v 对照法：对照法：n在同样条件下配置标准溶液和样品溶液，在选定波长处，分别测量吸光度，根据定律有 A标标=c标标l A样样= c样样ln在同种物质、同台仪器及同一波长测定的条件下l 和E 均为定值，所以：A标

39、标/A样样 = c标标/c样样 ； c样样 = c标标（A样样/ A标标）2022-4-2545南京农业大学 生命科学学院v 定量方法：定量方法：v 标准曲线法标准曲线法:v 有些情况下，如单色光不纯等，测得的吸光值随所用仪器不同而有相当大的变化。若此时用吸光系数换算成浓度，将产生很大的误差。v 但如果只用一台固定的仪器，则可认定在固定工作状态和测定条件下，浓度与吸光度之间的关系在许多情况下是线性关系或接近于线性关系。A=Kc （K只为比例常数，而非物质常数）v 据上式的关系进行定量是分光光度法中比较简便易行的方法。标准曲线的制作配置一系列浓度不同的标准溶液。在测定条件相同的情况下，分别测定其

40、吸光度。以标准液浓度为横坐标，以相应吸光度为纵坐标，绘制A-c关系图。在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。AC0AxCx2022-4-2546南京农业大学 生命科学学院第五节第五节 分光光度法分光光度法4. 减小测定误差的方法：减小测定误差的方法：n选择合适的显色剂，使显色反应的灵敏度高、选择性好、显色产物稳定。n通过条件试验，找出最佳的试剂加入量、酸度、温度和显色时间。并使样品与标准品在尽可能完全相同的条件下进行测定。n通过加掩蔽剂和控制pH值，消除共存离子的干扰。n尽可能在吸光度0.1-1.0范围内测定，以减小吸光度误差。A1.0的溶液，可通过稀释或用薄的吸收池来降低吸

41、光度。n减小仪器误差。用稳压器稳定电源以使入射光强度保持不变；吸收池厚度应一致，透光性好，不要用手摸透光面；吸收池与入射光线应垂直，否则会因光程增大而发生误差。 2022-4-2547南京农业大学 生命科学学院第五节第五节 荧光分析法荧光分析法1. 基本原理基本原理1.1. 基本概念基本概念v 某些物质受到光的照射，在吸收某些特定波长的光后还会发射出比原来吸收波长更长的光的现象称为光致发光，常见的光致发光有荧光和磷光两种。v 荧光是指物质吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级返回基态时所辐射的光。根据物质的荧光谱线位置及强度进行物质鉴定和含量测定的方法称为荧光分析法。v 根据研究对象

42、的不同，荧光可分为原子荧光分析法和分子荧光分析法，其中在生命科学中用得较多的是分子荧光分析法。v 分子荧光分析法分子荧光分析法是基于某些有机物质分子在光激发时发射荧光所建立起的测定方法，根据激发光的波长范围又可分为紫外-可见荧光、红外荧光和X射线荧光，本章主要介绍紫外-可见荧光。2022-4-2548南京农业大学 生命科学学院1.2. 荧光分析法的特点（优点）：荧光分析法的特点（优点）：n灵敏度高，选择性好，其检测限达10-10g/mL，甚至可达10-12 g/mL，而一般紫外-可见分光光度法的检测限只有10-7g/mL。n荧光分析法不仅能直接测定荧光物质，也能通过衍生反应测定非荧光物质。n信

43、息量大：荧光光谱能提供较多的信息，例如激发谱、发射谱、峰位、峰强度、荧光寿命等。荧光光谱还可以检测一些紫外-可见吸收光谱检测不到的时间过程过程。荧光产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。两个过程中有一个时间延搁，大约为10-9秒，由于荧光有一定的寿命，因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。n动态线性范围宽，方法简便，重现性好，取样量少，仪器设备不复杂。2022-4-25南京农业大学 生命科学学院491.3. 荧光的产生荧光的产生v 当室温下分子受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是

44、在分光光度法中所述的吸光现象吸光现象。2022-4-25南京农业大学 生命科学学院50v 吸收外来光子后被激发到激发态的分子，可以通过多种途径丢失能量，回到基态，这种过程称为弛豫。在很多情况下，分子回到基态时，能量通过热量等形式散失到周围。但是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。如果能量以光子形式释放，则放出的光称为荧光荧光。1.4. 荧光的产生荧光的产生v 当由于荧光的频率低于入射光的频率，因此测量到的荧光频率与入射光的频率不同。同时，作为发射光，荧光是从与入射光成直角的方向上检测。这样，荧光不受来自激发光的本底干扰，可以达到很高的灵敏度，一般比吸收光谱高两个数量级左右。v 此外，

45、由于荧光有一定的寿命，且其寿命比紫外吸收的时间过程（10-15秒）要长，因此一些用紫外观测不到的变化过程（如生色团及其环境的变化），恰好可以用荧光来观测。在紫外吸收的时间过程（10-15秒）中，生色团及其环境基本上是静止不变的。而在很多反应中，溶剂的重新排列和分子的运动过程发生的时间与激发态的寿命是同一数量级。2022-4-25南京农业大学 生命科学学院511.5. 激发谱和发射谱：激发谱和发射谱：v 荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。n激发谱：是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长激发光的相对效率；n发射谱：则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度

46、在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。v 激发谱是表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的同一波长下荧光强度的变化，而荧光的产生又与吸收有关，因此激发谱和吸收谱极为相似，呈正相关，镜象对称关系。v 在发射谱中最大荧光强度的位置 称为max ，它是荧光光谱的一个 重要参数，对环境的极性和荧光 团的运动很敏感。2022-4-25南京农业大学 生命科学学院521.5. 天然荧光生色团和荧光探针：天然荧光生色团和荧光探针：v 生物化学中主要的荧光生色团可分为天然荧光生色团和荧光指示剂（荧光探针）两类。v 天然荧光生色团：n天然的荧光生物分子只有芳香族氨基酸、核黄素、维

47、生素A、叶绿素和NADH等少数分子，核酸中的碱基没有显著的荧光，只有tRNA中的Y碱基（二氢尿嘧啶）是个例外。在蛋白质的荧光谱中，由色氨酸残基发出的荧光占主导地位。 v 判断化合物能否产生荧光的标准：n长共轭结构：具有共轭双键体系的分子容易产生荧光。绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环。任何能使电子共轭度提高的结构变化都将提高荧光效率，或使荧光波长红移。n刚性平面结构：具有刚性平面结构的有机分子容易发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。n取代基的类型和位置；环境、溶剂、温度、pH等均会影响分子结构，从而影响荧光。2022-4-25南京农业大学 生命科学学院531.6. 天然荧光生色团和荧光探针

48、：天然荧光生色团和荧光探针：v 荧光探针：n总的来说，天然的荧光生物分子种类很有限，而且荧光强度较弱。为了研究多数的不发光的生物分子，人们广泛利用一类能产生稳定荧光的小分子，把这些小分子和大分子结合起来，或者插入大分子中，根据这些较小的荧光分子性质的改变，分析大分子的结构，这类小分子称为荧光探针。n荧光探针的分子的几个基本要求：n能产生稳定的，较强的荧光。n探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的 结合，而且结合得比较牢固。n探针的荧光必须对环境条件较敏感。n结合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。2022-4-25南京农业大学 生命科学学院541.7. 荧光分析光谱：荧光分析光谱：v

49、将激发光用单色器分光后，连续顺次测定每一波长由激发所引起的荧光的强度，然后以荧光强度为纵坐标，以激发光波长为横坐标作图所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱。激发光谱中最高峰处的波长能使荧光物质发射出最强的荧光。v 保持激发光的波长和强度不变，让物质所发射的荧光通过单色器照射到检测器上，调节单色器至各种波长，并测出相应的荧光强度，然后以荧光强度为纵坐标，以相应的荧光波长为横坐标作图，所得曲线称为该荧光物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱。v 对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时 ，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。v 在建立荧

50、光分析方法时，须根据荧光光谱来选择适当的测定波长。激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。2022-4-25南京农业大学 生命科学学院55第五节第五节 荧光分析法荧光分析法2. 荧光分析仪的原理和结构荧光分析仪的原理和结构v 荧光分析中常用的仪器主要有荧荧光计光计和荧光分光光度计荧光分光光度计两种。v 主要都是由光源、单色器（滤光片或光栅）、狭缝、样品室、信号检测放大系统和信号读出、记录系统组成。v 右图是荧光分光光度计的结构示意图，如果将激发单色器改为滤光片则为滤光片-单色器荧光计，如果将单色器全部改为滤光片则为滤光片荧光计。2022-4-2556南京农业大学 生命科学学院第五节第五节 荧光

51、分析法荧光分析法2. 荧光分析仪的原理和结构荧光分析仪的原理和结构v 三种荧光分析仪的区别：n滤光片荧光计不能测定光谱，但可用于定量分析。n滤光片-单色器荧光计不能测定激发光谱，但可测定荧光光谱及用于定量分析。n荧光分光光度计既可测量某一波长处的荧光强度进行定量分析，还可绘制激发光谱及荧光光谱。v 在荧光计和荧光分光光度计工作过程中，由光源发出的紫外可见光通过激发单色器分光后照射到样品溶液中，在特定波长的激发光激发下，样品荧光物质发出荧光，通过发射单色器后照射到检测器上，检测器将记录各荧光的波长及荧光强度。该过程中，为防止激发光的干扰，在与激发光垂直的方向检测样品的荧光。2022-4-2557

52、南京农业大学 生命科学学院第五节第五节 荧光分析法荧光分析法3. 荧光分析法的定性和定量荧光分析法的定性和定量v 定性分析：n每种荧光物质在一定条件下都有其特定的激发光谱和荧光光谱，相比只能得到被测物质的一种特征吸收光谱，荧光分析做定性分析时有更高的可靠性。荧光定性分析就是测定样品的两种特征光谱形状和波长范围，再与标准物质进行比较，从而确定待测样品与标准物质是否为同一种物质。v 定量分析：n样品溶液的浓度很低，其它条件一定时，荧光强度与样品浓度成正比例关系。n根据荧光强度与溶液浓度成正比的定量关系，在一定的浓度范围内，可采取标准曲线法、比例法、联立方程式法来进行荧光物质的定量测定，方法同分光光

53、度法类似。2022-4-2558南京农业大学 生命科学学院第五节第五节 荧光分析法荧光分析法4. 荧光分析法在生物学中的应用荧光分析法在生物学中的应用v 天然荧光物质的应用。天然荧光物质的样品，可以直接通达量测其荧光来确定其存在，分布及数量。n蛋白质的内源荧光。利用蛋白质内源荧光检测蛋白，其灵敏度高于紫外吸收法。蛋白质的荧光来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。n天然色素的内源荧光分析。维生素大多含有芳香环结构，本身具有较强的天然荧光，因此可以利用内源荧光检测维生素。还可以利用荧光强度的变化估算出光合效率的高低。v 外源荧光物质的应用。由于天然荧光分子种类有限，在生物学和医学的实际中，应用得更加广泛的

54、是荧光探针，即外源荧光技术。目前，荧光探针的种类已经成千上万，人们可以根据所研究问题的不同，选择不同的荧光探针。2022-4-2559南京农业大学 生命科学学院v 外源荧光物质外源荧光物质v 蛋白质的荧光探针：蛋白质的荧光探针：n共价标记。有些荧光探针可以与蛋白质上特定的基团共价结合，例如胺基和巯基就是蛋白质中容易结合的两种基团。n非共价标记。另外有一些荧光探针可以和蛋白质非共价结合。例如：1,8-ANS（1-氨基-8-萘磺酸酯）在水中基本不发荧光，但当结合到一些蛋白质上时，可以发出很强的荧光。v 利用蛋白质的荧光标记方法，可以研究荧光探针标记的部位微环境的极性、结构、分子运动、结合紧密程度等

55、。也可以利用共振能量转移原理测定基团之间的距离等。2022-4-25南京农业大学 生命科学学院60v 外源荧光物质外源荧光物质v 核酸荧光染料（探针）：核酸荧光染料（探针）：v 吖啶橙（AO）是三环杂芳香环类染料，既可以标记DNA，又可以标记RNA。通过嵌入核酸双链的碱基对之间，这时这种染料的荧光谱与荧光素很相似。v 常用荧光探针还有二联苯亚胺，溴化乙啶 EB等等。2022-4-25南京农业大学 生命科学学院61AO溴化乙啶二聚体溴化乙啶二聚体-1标标记的肠系膜动脉记的肠系膜动脉v 荧光技术与其它技术的结合荧光技术与其它技术的结合v 显微荧光光度技术：n利用显微分光光度计对细胞内的不同成分进行定性、定位或定量的荧光测量与分析，称为显微荧光光度术，又称细胞荧光光度术。用荧光染料标记细胞内的核酸，可以测定细胞内核酸的含量。用荧光探剂标记抗体蛋白，再用标记了荧光探针的抗体与细胞内的抗原作用，即能观察抗原的分布及相对含量。v 流式细胞术：n流式细胞术是荧光技术与激光技术、计算机技术结合的产物，是对单个细胞或其它生物微粒（如细菌、真菌、染色体、细胞聚合体等）进行快速定量分析与分选的一种技术。n在分析或分选过程中，包在液流（称为鞘液）中的单个细胞或颗粒顺序通过聚焦的探测光，对细胞或颗粒进行分类和分选；进行这种测量的仪器称为流式细胞仪。（更详