生物分离工程课件

1、第一章 生物分离工程概述1.1生物分离在生物技术中所占位置1 生化分离工程的定义：为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程。 2、单元操作：完成一道工序所需的一种方法和手段。 3、生物技术：即有机体的操作和应用有机体生产有用物质、改善人类生存环境的技术。4、生物技术的目标：就是指利用培养微生物、动物细胞、植物细胞来生产对人有用的产品。生物技术的主要目标是生物物质的高效生产，分离纯化是生物产品工程的重要环节，因此生物分离是生物技术的重要组成部分。 5、狭义生物技术的产物仅为化学产

2、品，约有100年的历史。6、获得产品的有效途径：原材料、预处理、生物反应、生物分离、产物7、传统发酵与现代发酵比较1.2 生物物质和生物分离 种类繁多，包括自然界存在的各种生物资源。现代生物技术主要通过生物反应过程生产各种物质。 现代生物技术产品的主体是蛋白质药物。1.3生物分离的特点：A生物工程的主要特点是生物制品多种多样。产品的多样性导致分离方法的多样性。B绝大多数生物分离方法来源于化学品的分离方法。C生物分离一般比化工分离难度大。a成分复杂,固体成分包括完整有机体、培养基及底物中的不溶物，液体成分包括底物可溶物、代谢中产物及目标产物。b悬液中的目标产物浓度低.1.4生化产品的类型：按用途

3、分类：食品类。保健品类。医用类产品。农业用产品。生物试剂类。按分子量大小分类：Mass 1000D：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类按发酵时目的产物所在的位置分类：cell内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质 cell外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（-淀粉酶）等 2.生物分离与一般化学分离方法的比较2.1、分离过程的分类： 机械分离（离心、过滤） 传质分离（平衡分离、速率分离） 平衡分离萃取、吸附、沉淀、结晶、层析等 速率分离膜分离、电渗析、透析2.2生物产品特点： 产物浓度低的水溶液 (原因： a 氧传递限制； b 细胞量; c 产物抑制 组分复杂(a 大分子; b 小分子; c

4、可溶物; d 不可溶物; e 化学添加物 产物稳定性差( a 化学降解(pH , 温度); b 微生物降解 （酶作用， 染菌） 分批操作，生物变异性大 质量要求高 （药品或食品）2.3生物产品要求高质量：纯度、卫生、生物活性分离过程的成本占产品总投资的大部分，因此必须仔细考虑和设计产品的回收和纯化过程。设计中应考虑下列问题？1. 产品价值2.产品质量3.产物在生产过程中出现的位置4.杂质在生产过程中出现的位置5. 主要杂质独特的物化性质是什么？6.不同分离方法的技术经济比较上述问题的考虑将有助于优质、高效产物分离过程的优化。2.4方法选择的基本原则：1)、尽可能简单、低耗、高效、快速。2)、分

5、离步骤尽可能少。Why? A) n 为总回收率，n 为各单元回收率。意义？分离步骤越多，回收率越低；如10 = 0.9510 = 0.63，5 = 0.955 =0.77B)、分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长 How ?3)、避免相同原理的分离技术多次重复出现比如，分子筛和超滤技术按分子量大小分离，重复应用两次以上，意义就不大了。4)、尽量减少新化合物进入待分离的溶液。 A)、引起新的化学污染；B)、蛋白质的变性失活5)、合理的分离步骤次序。 原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。2.5设计前应了解的信息：1、在设计前，首先要

6、掌握的产物物化性质，主要包括：(1)、溶解度及影响因素，包括温度、pH值、有机溶剂和盐等；(2)、分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义；(3)、沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义；(4)、极性大小；(5)、分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等；(6)、功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据；(7)、免疫原性。设计亲和色谱；(8)、稳定性及其影响因素，包括温度、pH值、毒性试剂等(如青霉素低pH不稳定)；(9)、分子的淌度及影响因素，包括pH值、离子强度和盐等；(10)、等电点pI2、成品规格（或产品质量标准） 表1.3 五肽胃泌素的上海市药品标准（1993年版32页

7、） 指标名称 指标 含量（C37H49N7O9S） 97.0-103.0 比旋光度 -25 -29 吸收值比 A(280nm):A(288nm) = 1.12-1.22 氨基酸 各氨基酸之比为1 干燥失重，% 0.53、进料的组成和物性 (1) 目的产物的浓度。 高？ 低？ (2) 物料中的与目的产物相近物质组成的物理化学性质。 (3) 目的产物的定位。是胞内还是胞外？ (4) 菌种的种类和形态。 (5) 微生物的含量和发酵液的黏度。4、生产规模 5、危害性(1)、离心产生的气溶胶、发酵产生的废气、干燥产生的粉尘等。(2)、目的产物本身的危害性；抗肿瘤代谢类药物，类固醇类抗生素，激素类药物等。

8、(3)、试剂危害。萃取试剂CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。(4)、微生物的危害。重组DNA工程菌不能任意排放。这一菌种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害。6、分批分离还是连续纯化2.6对环境的考虑1）、废水 A、除菌过滤和灭菌处理； B、符合BOD的要求；2）、废料 A、灭菌处理； B、综合利用：动物饲料、饲料添加剂，有机肥料3）、废气 A、除菌过滤和灭菌处理； B、废气（有机溶剂）回收4）、溶剂的回收 A、减少环境排放，减少污染；B、循环利用，减低成本 2.7生物分离一般包括四步：A不容物的去除：过滤，离心，细胞破碎 B产物分离：离子交换，萃取（以上分离过程不具备特异性，只是进行

9、初分，可提高产物浓度和质量。C产品的纯化：色谱，电泳，沉淀 D产品的精制：结晶，干燥1.4 生物分离技术和原理物质分离的本质是识别混合物中不同溶质间物理、化学和生物性质的差别，利用能识别这些差别的分离介质和扩大这些差别的分离设备实行溶质间的分离或目标组分的纯化。性质不同的溶质在分离操作中具有不同的传质速率和（或）平衡状态，从而实行分离。1) 物理性质 力学性质：重力、离心力、膜分离； 热力学性质：状态变化、相平衡； 传质性质：粘度、扩散、热扩散； 电磁性质：电泳、电渗析、磁化； 2）化学性质 化学热力学：化学平衡； 化学反应动力学：反应速率； 光化学特性：激光激发的离子化进行同位素分离3）生物

10、学性质 生物分子识别：生物亲和作用； 生物输送性质：生物膜输送； 生物反应、控制：酶反应、免疫系统。 平衡分离：定义：根据溶质在两相间分配平衡的差异实现分离。溶质达到分配平衡的推动力仅取决于系统的热力学性质。溶质达到相间平衡的过程为扩散传质过程，平衡分离又称扩散分离。蒸馏、蒸发、吸收、萃取、结晶（沉淀）、泡沫分离、吸附和离子交换等是典型的平衡分离过程。差速分离：定义：利用外力驱动溶质迁移产生的速度差进行分离的方法。传统的机械分离方法：过滤、重力沉降、离心沉降。典型的差速分离法：超滤、反渗析、电渗析、电泳和磁泳。1.5 分离效率的评价1）、浓缩率（富积率， 原料 分离器 产品 意义：1）、如mT

11、 1，则目标产物得到富积； 2）、如mT = mX，则目标产物未得到分离纯化。 2) 分离因子(separative factor)，或分离系数(separative coefficient) 意义：A、目标产物浓度，杂质浓度，则分离因子大，分离效率；B、a = 1时，则未分离。故在分离为主要目的时,a 3) 回收率(recovery)：4) 纯化因子 对于具有生物活性的蛋白质或酶，常常用分离前后目标产物的比活 2. A in U/mg之比表示目标产物的分离纯化程度， 非蛋白类杂质的去除：（1） DNA A 阴离子交换（pH 4.0) B 亲和层析（不被吸附） C 疏水层析（2） 热原 （蛋白

12、质溶液中的去热原） A 生产过程无菌 B 所有层析介质无菌 C 所用溶液无菌D 亲和层析（多粘菌素）（3）去病毒 A 加热 （60 C) B 过滤 C 灭活剂目标蛋白的表征和分析方法：（1） HPLC（2） SDS-PAGE（3） 氨基酸顺序分析（4） 氨基酸，肽图，免疫化学（5） 与标准品对照分析下游加工过程的沿革： 传统产业（第一代） 19世纪60年代-20世纪50年代 酒精，丙酮，丁醇 第二代生物技术产品 20世纪40年代 抗生素，有机酸，核酸，酶制剂，单细胞蛋白 第三代 20世纪70年代中期 动物细胞培养 植物细胞培养 基因工程发酵产品生化分离技术的发展趋势：存在的问题：研发费用高、成

13、本高、周期长 生物工程发展的瓶颈如何解决？1)、加强基础理论研究 A、研究非理想溶液中溶质与添加物料之间的选择性机制、影响因素 1. B、研究界面的结构、动力学和传质机制，以及影响因素 2. C、下游加工过程的数学模型的建立和计算机模拟。难 2)、完善老技术：正确对待“新”、“老”分离技术3)、发明新技术 研发新型高效经济的分离技术 推进各分离技术的杂交 分离技术与发酵技术结合 强化化学对分离技术的影响 1.4)、高效分离技术的工程化5)、分离技术的环保化生物分离工程的发展动向： （1） 操作集成化（扩张床，两水相） （2） 方法集成化（亲和与膜结合） （3） 大分子与小分子相互渗透（两水相

14、大分子向小分子分配） （4） 亲和技术推广与配基合成（分子印迹） （5） 优质层析介质开发（大孔亲水介质，贯注层析介质） （6） 下游技术与上游技术相结合(藕合分离） （7） 改进上游因素（改进菌种，培养基与发酵条件） （8） 改善环境相容性 Chapter 1 思考题1. 生物分离工程在生物技术中的地位？2.生物分离工程的特点是什么？3.生物分离工程可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？4.在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？第二章 细胞分离与破碎6一、固液分离的类型： 1、过滤(重力过滤器、压滤器、真空过滤器) 2、离心 3、重力沉降二、悬浮液

15、：指固体颗粒在0.1mm以上的固液分散体系。生物细胞培养液基本上也是悬浮液。三、培养液的组成：水70-80% + 固体细胞及碎片20-30%(对微生物发酵)+ 少量的代谢成物 + 细胞破裂后的内容物 +残存的培养基成分四、培养液的基本特征A、细胞成分及碎片大小不一，颗粒大小，分离成本。B、固液密度相近，黏度高：沉降和离心分离困难C、固体成分可压缩可变形 + 高黏度：过滤困难，黏附在滤布，错流过滤形成凝胶层D、动植物细胞抗剪切力差：错流膜过滤和离心等不适E、流变性复杂，非牛顿型流体，青霉素发酵液为卡森型流体，120h链霉素发酵液为拟塑性流体，灰色链丝菌发酵液为塑性流体。 备注： 在高分子液体范畴

16、内，可以粗略地把非牛顿型流体分为： 纯粘性流体，但流动中粘度会发生变化，如某些涂料、油漆、食品等。 粘弹性流体，大多数高分子熔体、高分子溶液是典型的粘弹性流体，而且是非线性粘弹性流体。一些生物材料，如细胞液，蛋清等也同属此类。 流动性质有时间依赖性的流体。如触变性流体，震凝性流体。 对微小而形状多变的微生物细胞，发酵液和其它生物溶液的固液分离就变得复杂了 。 一般，由于料液通常都是高的非牛顿粘度流体或者是高度可压缩滤饼，发酵液和其它生物溶液是极其难以过滤的，因此，必须对这些生物分离程序进行修改。五、预处理的目的:（1） 改变发酵液的物理性质 (黏度、颗粒大小、颗粒稳定性等)，固液分离速度，分离

17、器分离效率；）（2） 目标产物转移其中一相(多数为液相)；（3） 六、目标产物转移其中一相(多数为液相)；六、预处理的方法：1加热：.最简单、最经济的预处理方法是加热。加热不仅可以增加料液的操作特性，也可以对其进行灭菌。但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。加热可产生： 黏度、促凝聚、固体成分体积、破坏凝胶结构、增加空隙率、去蛋白2、调pH值：方法简单有效、成本低廉 pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH可改善其过滤特性。 对于氨基酸、蛋白质等两性物质作为杂质存在于液体中时，常采用调pH至等电点使两性物质沉淀。另外，在膜分离中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，常通

18、过调整pH，改变易吸附分子的电荷性质，以减少吸附造成的堵塞和污染。此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于固液分离。3、凝聚和絮凝1).通过电解质的加入促进原始溶液的凝聚和絮凝2).主要作用为增大混合液中悬浮粒子的体积，提高固液分离速度，同时可除去一些杂质。3).凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成mm 大小块状凝聚体的过程。胶体粒子(10-100nm)中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）机理：a 中和粒子表面电荷 b 消除双电层结构凝聚剂种类：A、无机盐类：如硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、FeC

19、l3、AlCl3、ZnCl2、硫酸镁等；B、无机碱：如Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、CaO等；C、聚合无机盐，如聚合铝、聚合铁。 机理：A、破坏双电层，B、水解后胶体吸附，C、氢键结合等。4).絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程。 机理：架桥作用絮凝剂种类：A、阳离子类，如聚丙烯酰胺(+)、聚苯烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺；B、阴离子类，如聚丙烯酸纳、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺(-)；C、非离子类，如聚丙烯酰胺(0)、环氧化乙烯。

20、机理：絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用 凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态,使其聚集起来,增大体积以便固液分离,常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中.4、惰性助滤剂 5加入反应剂发酵液的带电现象发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。4、惰性助滤剂： 一种颗粒均匀、质地坚硬的粒状物质，用于扩大过滤表面的适应范围，减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介质的堵塞。

21、 使用方法：A、预涂层；B、按一定比率混合。 助滤剂种类：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的炭、炉渣、重质碳酸钙，及它们的混合物等。 用量标准：A、单位质量助滤剂所产生的最大滤液产量(最常用)；B、或最长周期；C、或最快流速；D、或滤饼的最大空间利用度。5加入反应剂有时加入某些不影响目的产物的反应剂，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。 加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4 、磷酸铝 等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。七、发酵液的相对纯化1.无机离子的去除

22、Ca2+ 、Mg2+ 、Fe2+等Ca2+离子浓度较高时，可采用可溶性盐，如草酸钠等Mg2+离子的去除一般采用加入三聚磷酸钠磷酸盐处理，也能大大降低Ca2+ 、Mg2+离子的浓度铁离子，可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去2杂蛋白的去除利用各种沉淀方法，可以去除液相中各种蛋白质。常用的有等电点沉淀法、变性沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、反应沉淀法等。这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法，也可以作为提取目标产物的技术手段。3多糖的去除 酶解法可将混合液中的不溶性多糖物质酶解，使其转化为溶解度较大的单糖，从而改变流体的流动特性，提高过滤速率。4有色物质的去除 发酵液中有色物质可能是由于微生物生长

23、代谢过程分泌的，也可能是培养基（如糖蜜、玉米浆等）带来的，色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。 色素物质的去除，一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附法来脱色最为普遍。2.1 细胞分离大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变化范围很宽。浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低至每单位体积仅含0.1%。粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为1mm的不溶性物质。对于这些浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，我们可以采用过滤方法分离。当发酵液不易被过滤纯化时，我们可以采用离心的方法来分离。与过滤设备相比，离

24、心设备的价格昂贵。但当固体颗粒细小而难以过滤时，离心操作往显得十分有效。离心分离是基于固体颗粒和周围液体 密度 存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程，当静置悬浮液时，密度较大的固体颗粒在重力作用下逐渐下沉，这一过程称为沉降。由于沉降和离心相似，这儿就放在一块讨论。离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同。通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体。而过滤可获得的水分含量较低的滤饼。但是，对大多数生物发酵液可以离心但不能有效地过滤分离，所以离心往往是很有效的方法。1、颗粒的沉降当一固体微粒通过无限连续介质时，它的运动速度受两种力的影响：一是微粒受到因微粒和流体介质间密

25、度不同而产生的浮力作用；二是微粒所受到的流体阻力作用。根据沉降作用力可分为：重力沉降、离心沉降根据沉降粒子间相互影响程度可分为：自由沉降和干扰沉降4.1 重力沉降（Gravitational sedimentation） （1）球形颗粒的自由沉降速度 以重力的方向为正方向 什么情况下颗粒在流体中会发生沉降过程？ 直径为d、颗粒密度为s的球形颗粒在密度为流体中的重力和浮力分别为： 颗粒做匀速运动，沉降速度恒定不变，该速度称为自由沉降速度。达到恒定的沉降速度时，合力为（球形颗粒的自由沉降速度）（2）阻力（曳力）系数（Drag coefficient） 与流体的流动阻力系数类似，阻力（曳力）系数与颗

26、粒沉降雷诺数有关，即注意：其中d为颗粒直径，u0为颗粒的沉降速度，、分别为流体的密度与粘度。 通过实验得到曳力系数与雷诺数的关系绘成算图,将他们回归成关联式为： 层流区（Stokes区，Re0 2或0.3） 过渡区（Allen区， 2 Re0 500） 湍流区（牛顿区， 500 Re0 200000后，骤然下降，在Re0 =(310)105范围内可近似取= 0.1。 以上的沉降过程为在重力作用下球形颗粒的自由沉降： 颗粒为球形； 颗粒沉降时彼此相距较远，互不干扰； 容器壁对沉降的阻滞作用可以忽略； 颗粒直径不能小到受流体分子运动的影响。在实际情况中还需考虑以下因素的影响： 干扰沉降； 端效应；

27、 分子运动； 非球形； 液滴或气泡的运动 。离心力： Stocks Force(粘滞力)：离心沉降速度：分离因子定义Fr：离心力/重力加速度(g)的比值意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数，用于离心机的分类 注意：离心沉降与重力沉降的类比。颗粒离心沉降的速度方向是由圆心沿径向指向外周，但由于颗粒和流体同时做圆周运动，颗粒的实际运动轨迹是一个半径逐渐扩大的螺旋线。离心沉降速度并不是颗粒的实际运动速度，只是其在径向上的分量。 对于沉降，重力沉降加速度为重力加速度）g= d2(s-)g/(18) (2.6)离心沉降加速度则不同a=r2 s= d2(s-)r2/(18) (2.16)-转鼓回转角

28、速度，r/s） r为转鼓中心轴线与微粒间距离，m 代入得 （2.15）s= d2(s-)r2/(18) (2.16)还可以用 表达其中S称为沉降系数，是溶剂物性的常数沉降系数S计算：颗粒在20C 水中的Sw,20为v 为溶质(颗粒)的单位质量的体积, h w,20和h L,T分别为20 C 的水和T C 溶剂的黏度，rw,20和rL,T 分别为20 C 的水和T C 溶剂的密度。 Sw,20与溶质（颗粒）浓度有关： 为c0时的沉降系数(20 C 的水), k为常数可以得到溶质完全沉降所需的时间：1） 差速离心分级2）区带离心 （密度梯度离心）：差速区带离心、平衡区带离心 按分离因子Fr分类 1

29、)、常速离心机Fr 8000-15000g 4)、超速离心机，Fr = 20,000 1,000,000g用途分类 1)、分析性：超速离心机 2)、制备性：A、实验室用；B、工业用工业应用分类 1)、管式离心机 2)、多室离心机（管式离心机的变形） 3)、碟式离心机：、人工排渣式, 、喷嘴排渣式, 、活塞排渣式 4)、螺旋卸料沉降离心机 5)、离心过滤 6)、三足式离心机离心过滤 计算流量方程：注：流量为非常数，时间增加，滤饼厚度增加，而流量减小。滤饼形成时间方程： 意义：得到滤饼厚度(R0-RC)所需时间，用于工艺放大 Q超速离心机：分离因子在100,000g以上的离心设备 应用：A. 测定

30、分子量:B. 大分子的纯度鉴定C. 大分子的构相变化D. DNA半保留复制概念： 过滤是在外力作用下，利用过滤介质使悬浮液中的液体通过，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的一种单元操作。过滤介质具有多孔结构，可以截留固体物质，而让液体通过；我们把待过滤的悬浮液成为滤浆（Slurry），而过滤后分离出的固体称为滤渣或滤饼（Filter cake），通过过滤介质的液体称为滤液（Filtrate）。 （1）过滤介质（Filter medium）： 过滤介质应具有以下特性：多孔性，足够的机械强度，尽可能小的流动阻力，耐腐蚀性，耐热性，易于再生。 工业上常见的过滤介质：织物介质、堆积介质、多孔固

31、体介质、多孔膜。 （2）过滤分类： 深层过滤、滤饼过滤 （3）过滤推动力：重力（漏斗过滤）、压力（加压过滤）或真空（抽滤）、离心力（离心过滤）。 （4）滤饼的可压缩性 （5）助滤剂：助滤剂本身就是一性能良好的过滤介质，是一种坚硬、不规则的小颗粒，它能形成结构疏松、空隙率大、不可压缩的滤饼，很大程度改善过滤难度。助滤剂使用方法主要有两种：混合、预涂。过滤过程数学描述 达西方程： 1、适用于不可压缩和简单的可压缩滤饼 2、普遍使用于生物分离过程过滤基础理论;Darcy定理U = 流体的速度(in: m/s)，Dp = 压力差(in: Pa)，l = 床层厚度(in: m)，K = Darcys 渗

32、透系数，与流体和床层的性质有关。Kozenys 方程 对于发酵液的过滤,要用Kozenys方程 K = Kozenys 常数，一般K = 5（在大量均匀的球形颗粒中），其他颗粒K = 3.5-5.5，颗粒，K；S = 单位体积颗粒中颗粒的表面积；h = 发酵液黏度(in: Pa s)；e = 床层的空隙率，即空隙体积与总体积的比值。方程适应条件：A、薄层区域表面的流速，B、非常高的孔隙率，C、非常广的颗粒尺寸的分布，D、纤维状的、可压缩的和吸湿性的填充物。意义：过滤的基础方程，揭示了过滤流速与各因素的关系过滤速度：滤饼阻力与滤饼干重之间的关系: 为滤饼的平均比阻，不可压缩性滤饼的为常数，可压缩

33、性滤饼的为压差的函数，经验表达式为：比阻(平均质量比阻 m/kg)定义式 S = 单位体积颗粒中颗粒的表面积rs：干滤饼的密度(in kg/m-3)。意义：A、反映过滤的难易程度，越大，越困难；B、与颗粒大小、孔隙率等的关系。n滤饼可压缩度，当滤饼不可压缩时，n = 0；对于高度可压缩滤饼，则n 1。b = 湿滤饼的质量：干滤饼的质量。意义：A、对于可压缩料液，高压不一定增加流量B、比阻与压力的关系随着过滤操作的进行，滤饼量不断增加，与滤液体积Q之间关系如下：=湿滤饼/干滤饼；cs=干滤饼/液料 cs=湿滤饼/液料；1- cs= 滤液/液料；Q滤液体积Q/（ 1- cs）= 液料体积LQ/ （

34、 1- cs）= 液料质量所以Ruths 方程 在过滤操作中，被截留的固相颗粒在介质形成滤饼。过滤的阻力来自过滤介质和滤饼。过滤流量可表达为 Q：滤液体积(in m3)，A：过滤面积(in m2)，b 湿滤饼:干滤饼，cs：料液中干固相成分的浓度(in: kg/kg)，r：滤液密度，Q0：相当于过滤介质阻力时的虚拟滤液体积(in m3)，一定过滤介质的Q0为常数。 意义：过滤的流量方程恒压过滤方程(最常用模式)恒压条件下对Ruths方程积分：t0：为透过虚拟体积所要的虚拟时间。在一般条件下Q0可忽略，上式为：意义：中试后放大的理论依据恒速过滤恒速条件下对Ruths方程积分：过滤设备过滤设备从传

35、统的板框式过滤机到旋转式真空过滤设备，种类很多。常用新型过滤器：转鼓真空过滤器应用：大规模生物分离的主要过滤设备，用于较难分离的低黏度发酵液优点：、大规模，、自动化、操作简单，、滤布装卸容易、易保养维护。缺点：、占地大，单位体积利用率低，、周期性中断进料、滤布利用率低，、压力低，仅应用于低黏度发酵。圆盘真空过滤器应用：同上。优点：、超大规模(400 m2)，极易实行大型化分离，、占地小，单位体积利用率高，、自动化、操作简单。缺点：、压力低，仅应用于低黏度发酵液，B、设备投资高。 带式真空过滤器应用：大规模分离的主要过滤设备，可分离较难分离的低黏度的发酵液，对滤饼洗涤要求高。 优点：)、发酵液处

36、理量大，滤饼厚达200mm， )、滤饼洗涤容易，效果好，无须搅拌， )、自动化、操作简单，清洗保养容易。 缺点：)、占地大，有效过滤面积低， )、压力低，仅应用于低黏度发酵液， )、设备投资高。 压力系列：带式、板框、加压、气压罐式压滤机应用：用于很难处理的、高黏度、高细颗粒含量的发酵液的固液分离。优点：、操作压高.Mpa以上，的 颗粒含量，高含量的细颗粒， 、滤饼含水量低，滤液澄清， 、自动化、操作简单，清洗保养容易。缺点：、占地大，有效过滤面积低，、设备投资高，能耗高。如何选择过滤器？1、滤液的澄清度2、颗粒大小的分布3、发酵液的黏度4、固体颗粒的浓度5、滤饼的干燥度6、滤饼的洗涤7、生产

37、能力中试实验设计的路线 ：1、确定生产能力（例：150T/d） 2、确定中试实验的规模（一般按生产能力缩小100倍，即150/100 = 1.5T/d） 3、 测定重要参数，如 a，Q0等 4、优化实验条件确定不同的实验条件：预处理、助滤剂、压力等滤饼的厚度与时间关系滤饼的孔隙率与压力关系不同压力下滤液的体积与时间的关系滤饼的洗涤、脱水、排脱等滤液的澄清度，以及上述方程要求的数据利用方程等 5、计算：A、过滤面积A，确定型号(以恒压为例) 6、放大100倍 生产能力(= 100A)结论： 离心和过滤是去除不溶物的主要方法，生物分离工业首先要去除不溶物，大的、硬的不溶物可用过滤方法去除， 对于大

38、部分发酵液，助滤剂或者其它预处理方法有利于过滤，但也有没有效果的。另外一些小的、难过滤的固体颗粒可用离心分离。2.2细胞破碎 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物细胞本身： 单细胞蛋白（SCP）胞内产品:碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等2 .2.1 细胞的结构 细胞壁的组成和破碎阻力细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。细胞破碎和产物释放原理 物理法化学法固体剪切法(珠磨法)酶溶法液体剪切法化学降解法（

39、酸碱法）撞击法表面活性剂法超声法有机溶剂膨胀法渗透法萃取法细胞破碎理论 1)、细胞破碎A 压撞 B 剪切 Ca 渗透 Cb 冻胀 D 破壁破膜2)、产物释放：主要有高压匀浆、珠磨、撞击破碎和超声波破碎等方法1)、固体剪切法(珠磨法, c最有效的物理破碎法)影响因素：a) 转盘外缘速度b) 珠粒添量和大小c) 温度：温度在5-40C范围内对破碎影响较小。但研磨产热，功率 ，温度 。如产物热不稳定，必须控温。d) 细胞浓度x：最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的降低而下降，但单位细胞重量的能耗 。通常悬液中细菌细胞质量浓度在60-120g/L、酵母细胞质量浓度在140-10g/L时破碎效果较理

40、想e) 破碎效率：f) 流量Q：破碎为一级反应。Q, E，R；Q，E，R。2)、液体剪切法(最常用的方法之一)影响因素：操作压力p：p, R ;相反, R 。温度 2C /10MPa 。破碎次数N：N，R 。温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。细胞抗破碎系数a：a酵母=2.9，a大肠杆菌 = 2.1。细胞种类：影响k值。细胞浓度：优点：A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多;B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌;C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.3) 撞击破碎法优点：A、细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间，破碎程度均匀，避免反复和过度破碎；B、破碎的程度

41、可无级调节，避免细胞内部结构的破坏，特别适合于细胞器的回收；C、实验室和工业规模均可应用。 4) 超声破碎法(1525kHz)l 超声波破碎法利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。l 超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。机理：在超声作用下产生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。优点：适合于多种细胞的破碎缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、液体体

42、积和流速、探头材料和形状；B、超声产生超氧离子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、产热大，需控温；E、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。化学破碎法酶溶法、酸碱法、有机溶剂胞溶法、表面活性剂法酶溶法：利用酶分解细胞壁上特出的化学键，使细胞壁破碎。优点：A、产品释放的选择性；B、提取速度和收效高；C、产品的破坏小；D、对外界环境，如pH和温度等要求低；E、不残留细胞碎片。酶解（酶溶法 Enymatic lysis)l 利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。溶菌酶（lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞的

43、分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。l 真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。l 自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。可是，改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。 l 酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等 l 合成的表面活性剂可分离子型和非离子型，离子型如十二烷基

44、硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化铵（阳离子型）。非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 l 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 渗透压冲击法l 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 冻结-融化法l 将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增

45、加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。 1、机械法和化学法的比较 机械破碎法缺点：A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活；B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；C、细胞碎片大小不一，难分离。化学破碎法缺点：A、费用高；B、引起新的污染，尤其是其他化学方法；C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。2、破碎方法的选择选择的一般原则：A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎B、提取产物在细胞膜附近，用化学法C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 破碎技术杂交研究应注意的问题：A、

46、杂交技术可产生很大优势。B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物的分离纯化C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的影响D、菌种的培育，胞内产物 胞外产物3、细胞破碎的评价 直接计数法方法：样本稀释 - 染色 - 上样 计数。计算：同上。优点：方法简单。缺点：A、计数时间长，B、只有活细胞才被计数，误差大，C、细胞聚集时，不利计数，D、染色误差。间接计数法方法：样本离心 - 取上清液 - 测特定蛋白质或酶 - 与理论的最大值比较。计算：Rm：理论最大值，R：实验测得值。优点：A、方法客观可靠，尤其对蛋白质和酶，B、有多种选择的指标，胞内位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，

47、灵活性大。缺点：影响因素多，如温度、pH值、剪切力、溶液的稀释等。解决办法：筛选相对稳定和恒定的指标。1、利用珠磨法破碎酵母细胞时，酵母内各种酶的释放速率常数不同。一般靠近细胞壁和细胞膜的酶释放速度快，而细胞内部或细胞器内的酶随破碎的进行缓慢释放出来。因此，选择发现地释放目标产物是可能的，关键是要知道目标产物的性质和在细胞同存在的位置，选择适当的破碎方法和操作条件。2、选择性释放目标产物的一般原则仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法（包括自溶法）、渗透压冲击法和冻结融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法（2）选择性

48、溶解目标产物当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液PH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。同时，溶液性质应使其他杂质不易溶出。另外机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。第三章初级分离63.1 沉淀分级 沉淀是物理环境的变化引起溶质溶解度降低、由液相变成固相析出生成固体凝聚物的现象。常用加入试剂的方法，改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度，使产物离开溶液生成不溶性颗粒，沉降析出。沉淀具有浓缩与分离的双重作用。与结晶联系：在本质上都是 新相 析出的过程，主要是物理变化，

49、当然也存在化学反应的沉淀或结晶。区别：结晶为同类分子或离子以有规则 排列形式析出，沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出。优点：A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高； B、原料液体积很快地减小1050倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；C、使中间产物保持在一个中性温和的环境；D、及早地将目标pro.从其pro.水解酶分离出来，避免pro降解，提高产物稳定性；E、用沉淀法作为pro色谱分离前处理，可使使用色谱分离的限制因素降低到最少。缺点：A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低；B、过滤较困难蛋白质的表面特性蛋白质溶解：相似

50、者相溶aa的亲水性和疏水性：有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水aa所占的比例等。如白蛋白不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水aa所占的比例等。如纤维蛋白原。1、蛋白质的溶解与什么有关呢？2、蛋白质的溶解特性：蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象 以及分子周围的环境 所决定。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric polymer），主要由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基

51、具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。3、蛋白质溶液的稳定因素：蛋白质周围的水化层（hydration shell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。l 吸引力l 颗粒间的相互作用l 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。l Van der Waals 力l Keeson 引力（偶极力）l Debye 引力 （诱导力）l London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它