陕西科技大学生物工艺综合实验教案

1、 生物工艺综合实验 课程教案 编写日期： 年 月 日章、节（或课题、单元）名称 固定化酵母的酒精发酵 授课学时 10 目的要求 1.要求学生掌握细胞固定化的方法； 2.糖化醪的制备方法； 3.掌握固定化酵母发酵生产酒精的技术。 重点、难点 重点 使学生掌握包埋固定方法，同时通过进行厌氧的酒精发酵使学生对整个生物工艺过程：培养基及其制备、微生物代谢产物的生物合成与调控、发酵产物的测定与分析等方面理论知识和实践得到了巩固和加强。 难点 通过酒精发酵，理解掌握厌氧发酵的关键控制方法；同时通过中间过程与发酵产物的测定与分析，掌握代谢调控的基本方法。 教学组织（包括主要教学方法、手段、参考书目文献等）

2、教学方法 生物工艺综合实验是一门系统综合性很强的实验课程。实验中通过创新性、系统性、高效性和科学性的实验实践环节，充分发挥学生的主观能动性，根据实验任务要求，完成制作培养基和试剂配制、安排实验计划、检测相关参数等，从而培养学生的动手能力、创新能力和综合分析能力。 参考书目 贾士儒主编，生物工程专业实验（第二版），中国轻工业出版社，2010年； 蒋群，李志勇主编，生物工程综合实验，科学出版社，2010年。 课后作业（课外复习预习内容） 1CaCl2在固定细胞过程中有何作用? 2.如果用固定化技术进行啤酒发酵，实验应如何？ 3记录试验结果，分析实验现象，写出试验报告。 授课小结 陕西科技大学教案

3、一、实验原理 固定化细胞的方法可分为吸附法、包埋法，共价交联法、凝聚法等。酒精酵母的固定化多采用包埋法，包埋法是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞中的酶处于原始状态，因此酶的活性高，活力耐久，所以目前对于微生物的固定化大多采用包埋法。做为固定化细胞的载体种类也很多，但从方便安全等角度考虑固定酒精酵母细胞，多采用海藻酸钠、卡拉胶等作包埋剂。其中海藻酸钙凝胶包埋法具有固化、成型方便，对微生物毒性小，固定化细胞密度高等优点，是最常用、也最为有效的方法之一。本实验采用海藻酸钙凝胶包埋法固定酵母细胞并进行酒精发酵试验。海藻酸钠是从海带中提取的天然多糖碳水化合物，广泛应用于食品、医药、

4、纺织、印染、造纸、日用化工等产品，作为增稠剂、乳化剂、稳定剂、粘合剂、上浆剂等使用。海藻酸钠为古洛糖醛酸（记为G段)和立体异构体甘露糖醛酸(记为M段)，两种结构单元构成的，以三种方式(MM段、GG段和MG段)通过-1,4糖苷键链接，从而形成一种无支链的线性嵌段共聚物。海藻酸很容易与一些二价阳离子结合，形成凝胶。P206参考海藻酸钙凝胶包埋法的优点如下：不同分子量和不同分子组成的藻酸盐，其凝胶形成性质一致，都可用于固定化；藻酸盐使用浓度较宽，可在0.510%之间任意选择；Ca2+浓度在0.052%之间改变，对凝胶形成影响不大；不同大小的凝胶珠粒的制备比较方便（0.15mm）；细胞固定量较高（可达

5、30g细胞/ml固定化催化剂）；工作温度可在080；适当的改进包埋方法后，可使被包埋的细胞在凝胶珠内形成克隆。微生物的细胞包埋于藻酸钙凝胶中的方法主要有两种类型，即外凝胶法和内凝胶法。其中以前者应用最广。外凝胶法的基本方法是将微生物细胞与海藻酸钠溶液混匀后，通过一注射器针头或相似的滴注器将上述混合液滴入CaCl2溶液中，Ca2+从外部扩散进入海藻酸钠-细胞混合液珠内，使海藻酸钠转变为不溶的海藻酸钙凝胶，由此将细胞包埋其中。内凝胶法应用较少，如需要可参考诸葛健等编著的工业微生物实验技术手册。将酵母细胞用载体固定起来进行酒精发酵不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母细胞增值所消耗的糖

6、分，增加了发酵强度，提高生产效率。目前用于酒精发酵生产的酵母菌种都可以用于固定化。 二、实验材料1菌种 酒精酵母。 2实验材料 麦芽汁，葡萄糖、无菌水、海藻酸钠。 3溶液 （1）4%的海藻酸钠溶液： 海藻酸钠 2g ； 水 50ml，高压灭菌，4保存（2）0.05mol/L CaCl2溶液：无水CaCl2 4.75g； 去离子水 1000 ml pH68，高压灭菌。 (3) 生理盐水 4器皿 烧杯、f15cm平皿，100 ml三角烧瓶（无菌）、500ml三角瓶，10 ml注射器外套及5#针头、电炉、天平，磁力搅拌器、水浴锅、量筒、糖度计、显微镜、酒精蒸馏设备、酒精计和玻璃仪等。 5麦芽汁培养基

7、：大麦芽20g，放入100蒸馏水中，60糖化4-6小时，过滤，澄清，获得麦汁，调整糖度至5Be时使用，pH自然。 三、方法步骤1制备固定化酵母 （1）酵母乳的制备：将0.5g干酵母按1:1020的比例投放于3638的24%的糖水中复水1520分钟。复水活化要使用洁净水，以防感染杂菌。 将复水后酵母菌种以0.4%种接量接种于麦汁培养基中，250ml三角瓶装40ml,在28下振荡培养24小时（200r/min），离心收集细胞（3000 r/min，10 min），用适当的生理盐水洗涤制备酵母悬液，稀释，使酵母细胞浓度达5.01095.01010个细胞/mL。 （2）将溶化好的海藻酸钠冷却至45左右

8、，与酵母乳以1:5的比例加入预热至35左右的酵母培养液，混合均匀。用滴管或无菌注射器（针头口径为1mm）将酵母和海藻酸盐的混合物以恒定速度缓慢的滴入0.05mol CaCl2溶液的烧杯中，并进行搅拌，即得到包埋酵母得海藻酸盐凝胶颗粒。 （3）将凝胶在CaCl2溶液中浸泡30分钟，然后转至500mL三角瓶中，用无菌水洗涤三次后备用。 2固定化酵母的酒精发酵：在麦汁中加入固定化酵母凝胶颗粒，采用8层纱布包口，置于28恒温培养箱中培养48h。发酵结束后取出三角瓶，测发酵醪pH，用糖度计测残糖。取醪液100ml加100ml水于蒸馏瓶中，进行蒸馏测酒精含量，计算100g原料的出酒率。 四实验结果与记录

9、记录发酵液0h、12h、24h、36h、48h、60h实验现象及糖度、酒度的变化。并分析糖度变化与酒精度变化的关系。 附表 还原糖的测定1 原理还原糖的测定采用快速法。其反应与粗淀粉测定相似，不同点为斐林试剂甲液中硫酸铜量较小，适用于含糖量较少的试样。另外，斐林试剂中加入亚铁氰化钾(黄血盐)，使红色氧化亚铜沉淀生成可溶性的复盐，反应终点更为明显。 Cu2O+K4Fe(CN)6+H2O=K2Cu2Fe(CN)6+2KOH (淡黄色) 2 试剂2.1 斐林试剂甲液：称取35g硫酸铜，0.05g次甲基蓝，用水溶解并定容至1000ml。 乙液：称取117g酒石酸钾钠，126.4g氢氧化钠，9.4g亚铁

10、氰化钾，用水溶解并定容至1000ml。 2.2 0.1%标准葡萄糖溶液 精密称取1.0000g经95105烘干的无水葡萄糖，用少量水溶解，加入5ml盐酸，用蒸馏水定容至1000ml，摇匀。 3 仪器与设备（1）三角瓶 （2）容量瓶 （3）分析天平 （4）干燥器 （5）电热恒温干燥箱 （6）滴定管 （7）称量瓶 （8）移液管 （9）电炉 4 测定步骤 4.1 斐林试剂的标定 吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加10毫升水，并从滴定管中预先加入约20毫升0.1%标准葡萄糖溶液(其量控制在后滴定时消耗0.1%标准葡萄搪溶液1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，立即以45秒钟1滴的

11、速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成，总耗糖量为V0毫升。 4.2 定糖 预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加入V1毫升试样稀释液(含葡萄糖量约为515毫克)及适量的0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V2毫升。 正式试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加V1毫升试样稀释液和(V2-1)毫升0.1%标准葡萄糖溶液，补加(V0+10)-(V1+V2)毫升水，摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V毫升。 重复测定两次，取总消耗标准葡萄糖液体积的平均值V ml。 5 计算 式中 V0：斐林

12、试剂标定值(毫升) V：斐林试剂测定值(毫升) C：标准葡萄糖溶液浓度(克/毫升) n：试样稀释倍数 v1：所取试样稀释液体积(毫升) 6 说明 (1)滴定速度、三角瓶壁厚度和热源的稳定程度等，对测定精密度影响很大。平行测定的滴定毫升数相差不应超过0.1ml，故在标定、预备、正式测定过程中，实验条件应力求一致。 (2)滴定过程应该始终保持在微沸状态下进行。沸腾后继续滴定至终点的毫升数应控制在0.5lml内，否则应重新测定。 (3)样品液中还原糖浓度不宜过高或过低，根据预备试验结果，应将样品液稀释至还原糖的含量在1%左右为宜。 (4)滴定至终点蓝色褪去之后，就不应再滴定，因四甲基蓝指示剂被还原褪

13、色后，当接触空气时，又会被氧化重现篮色。 (5)斐林溶液与还原糖之间的反应因受溶液碱性、加热湿度和时间以及副反应等影响，而没有严格的定量关系，不能由当量定律来求出试样中还原糖的含量，只熊根据在相同实验条件下消耗相应的标准还原糖量或由严格相同的实验条件下得出的还原糖检索表上查得相应的还原糖量来进行计算。所以用廉-爱农法定糖时，必须先用相应的标准还原糖标定斐林溶液。 生物工艺综合实验 课程教案 编写日期： 年 月 日章、节（或课题、单元）名称 黑曲霉发酵生产柠檬酸 授课学时 15 目的要求 1. 了解柠檬酸发酵原理 2. 掌握柠檬酸深层液体发酵 3.掌握发酵代谢产物参数分析方法。 重点、难点 重点

14、 使学生掌握初级代谢产物积累的代谢控制方法。同时通过进行好氧的初级代谢产物发酵使学生对整个生物工艺过程：培养基及其制备、微生物代谢产物的生物合成与调控、发酵产物的测定与分析等方面理论知识和实践得到了巩固和加强。 难点 通过柠檬酸发酵，理解掌握初级代谢发酵的关键控制方法；同时通过中间过程与发酵产物的测定与分析，掌握代谢调控的基本方法。 教学组织（包括主要教学方法、手段、参考书目文献等） 教学方法 生物工艺综合实验是一门系统综合性很强的实验课程。实验中通过创新性、系统性、高效性和科学性的实验实践环节，充分发挥学生的主观能动性，根据实验任务要求，完成制作培养基和试剂配制、安排实验计划、检测相关参数等

15、，从而培养学生的动手能力、创新能力和综合分析能力。 参考书目 贾士儒主编，生物工程专业实验（第二版），中国轻工业出版社，2010年； 蒋群，李志勇主编，生物工程综合实验，科学出版社，2010年。 课后作业（课外复习预习内容） 试以发酵时间为横坐标，以糖消耗量、柠檬酸生成量、糖酸转化率为纵坐标作图，说明三者随发酵时间的变化，并加以分析。 授课小结 陕西科技大学教案 柠檬酸(citric acid)又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸或2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸。商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C6H8O7H2O，相对分子质量为210.14。另一种为

16、无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C6H8O7，相对分子质量192.13。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收 n 和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗(洗涤)、建筑等工业部门。其中食品和饮料业占56，清洗(洗涤剂)业占20，医药和化妆品占1l，其他工业占13。 1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。 能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲

17、霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉、文氏曲霉和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。 本实验以玉米淀粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体(摇瓶)发酵产生柠檬酸。一、实验目的 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及中间分析方法。 二、实验原理 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径(EMP)和HMP途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶

18、氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶(柠檬酸缩合酶)的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的a-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为： C6H12O6+1.5O2 C6H8O7+2H2O 柠檬酸理论得率为106.7，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7。三实验装置与流程 (1)实验装置与材料： 实验装置：旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机(40006500rmin)。 菌种：黑曲霉柠檬酸生产菌株 材料：麸皮，蔗糖

19、，玉米淀粉，麦汁，琼脂，淀粉酶(中温酶与高温酶)。 器皿：15mL试管，100mL三角瓶，2000mL烧杯，500mL三角瓶 试剂：0.1429molL NaOH，1酚酞试剂，费林甲，乙溶液，001标准葡萄糖溶液。 (2)实验流程：保藏菌株活化种子菌株(斜面培养) 5001000mL三角瓶液体发酵 (3)培养基 斜面种子培养基(麦芽汁琼脂培养基) 麦芽汁(取啤酒厂未加酒花的麦芽汁)调整浓度50Bx，添加25g/L琼脂，分装于试管内。于121灭菌1520min取出摆成斜面备用。 麸曲培养基：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，按麸皮：水=1：(1013)比例加水，拌匀至无干粉又无结团，或用水洗麸皮

20、表面，挤去水分至有水感而水不下滴为宜。上述麸皮装入500mL三角瓶中，每瓶装801009湿料，塞入8层纱布并包扎好。于121下灭菌30min，趁热摇散，冷却至35备用。 摇瓶发酵培养基： 取玉米淀粉60g装入1000ml烧杯中，加入200mL水和7-8U a-淀粉酶(高温)/g玉米粉，于80液化l0min后，继续加热至90保温30min，碘检不变色后，再加热到100煮沸(5-l0min)，趁热经过二层纱布过滤，滤液加水冷却并调整糖度至15-20，补加KH2PO4 0.03%,MgSO4 0.025% ,NH4NO3 0.25% ，调整pH 3.5。取40mL分别装入500mL三角瓶中，每组做3

21、瓶,瓶口塞入8层纱布包扎好，于121灭菌1520min，冷却备用。淀粉被糊化后，体积膨胀很大，粘度增强，流动性很差，搅拌困难，影响传热，难以糊化均匀。因此淀粉质的柠檬酸发酵培养基在灭菌前必须先进行液化，使料液的流动性好，有利于料液的输送、灭菌完全、发酵初期菌体的生长、易于糖化、提高产酸率和淀粉的利用率。发酵成熟醪过滤性好、也有利于发酵罐搅拌功率的下降 四实验步骤及方法 (1)种子制备 斜面种子制备 用接种环挑取冰箱保存的斜面菌种一环于斜面培养基上，于35恒温箱中培养3-5d，待长满大量黑色孢子后，即为活化的斜面种子。 孢子悬浮液的制备 用无菌移液管吸取5mL无菌水至黑曲霉斜面上，用接种环轻轻刮

22、下孢子，装入含有玻璃球的三角瓶中,盖好塞子振荡数分钟。每支斜面的孢子悬浮液可接3-5瓶麸曲三角瓶。 吸取孢子悬浮液2mL接入上述麸曲种子培养基中，然后摊开纱布，扎好，并在掌心轻轻拍三角瓶，使孢子与培养基充分混合，于3032。C下恒温培养1d后，再次拍匀，于35。C下培养，每隔1224h摇瓶一次，孢子长出后停止摇瓶，这样继续培养34d，即成种曲。(2)摇瓶发酵培养：将吸取孢子悬浮液1mL接种于上述玉米淀粉的摇瓶发酵培养基中。于转速为200rmin(24h前为l00rmin，24h后为200rmin)旋转摇床上，35下培养3-4d。 (3)发酵过程检测 发酵0、24、48、72、96h分别各取下两

23、瓶检测总糖、残糖、柠檬酸含量，以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸生成速率。 柠檬酸含量检测：一般检测发酵过程中的总酸，采用0.1429molL NaOH溶液滴定发酵过滤清液。 总糖及残糖(还原糖)测定：采用费林试剂法。 五实验结果与记录 黑曲霉柠檬酸摇瓶液体发酵 发酵时间/h摇瓶总糖/%残糖/%柠檬酸（总酸）含量/%糖酸转化率/%0瓶1瓶224瓶1瓶248瓶1瓶272瓶1瓶296瓶1瓶2六实验数据处理 (1)平均耗糖速率(gh)：单位时间内黑曲霉消耗糖(还原糖)的克数。 (2)平均柠檬酸生成速率(gh)：单位时间内黑曲霉生成柠檬酸的克数。 (3)糖酸转化率()：黑曲霉生成柠檬酸的克数与消耗糖

24、(还原糖)的克数之比的百分数。 七思考题 试以发酵时间为横坐标，以糖消耗量、柠檬酸生成量、糖酸转化率为纵坐标作图，说明三者随发酵时间的变化，并加以分析。 附表 原料中粗淀粉的测定1 原理淀粉经酸或水解生成葡萄糖：所生成的葡萄糖用斐林试剂测定。斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙液分别贮存，测定时甲、乙液等体积混合。混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH+CuSO4=Cu(OH)2+Na2SO4所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反应，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解：酒石酸钾纳铜络合物中二价铜是一个氧化剂，能使还原糖中羰基氧

25、化，而二价铜被还原生成一价的氧化亚铜沉淀：反应终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原后，过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液蓝色消失以示终点：2 试剂2.1 斐林试剂甲液：称取69.3克硫酸铜(CuSO415H2O)，用水溶解并稀释至1000毫升，如有不溶物可用滤纸过滤。乙液：称取346克酒石酸钾钠，100克氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000毫升。2.2 2盐酸溶液量取4.5毫升浓盐酸，用95.5毫升水稀释。2.3 20盐酸溶液量取20毫升浓盐酸，缓慢倒入80毫开水中。2.4 20氢氧化钠溶液称取200克氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000毫升。2.5 1

26、次甲基蓝溶液称取1克次甲基蓝，加100毫升水，加热溶解，贮存于棕色瓶中。2.6 0.2标准葡萄糖溶液准确称取2克无水葡萄糖(预先于100l05烘干)，用水溶解，加5毫升浓盐酸，用水定容至1000毫升。3 仪器与设备（1）三角瓶（2）长玻璃管(约1米)（3）容量瓶（4）分析天平（5）干燥器（6）电热恒温干燥箱（7）滴定管（8）称量瓶（9）移液管（10）pH试纸试验（11）电炉（12）小铜锅4 测定步骤4.1 试样水解迅速将料液用酸将pH调至4.2-4.5，同时迅速降温至60。加入糖化酶（100u/g淀粉），60保温若干小时后，当用无水酒精检验无糊精存在。粗淀粉测定中试样水解：准确称取试样1.52

27、克，置入250毫升三角瓶中。加l00毫升2%盐酸溶液，轻轻摇动三角瓶，使试样充分湿润。瓶口按上回流冷凝器或长玻璃管(约1米)，于沸水浴中回流水解3小时(图2-1)。取出，迅速冷却，用20氢氧化钠溶液中和至中性或微酸性(用pH试纸试验)。滤纸过滤滤液用500毫升容量瓶接收，用水充分洗搽残渣，然后用水定容至刻度，摇匀，为供试糖液。4.2 斐林试剂的校正吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加20毫升水，并从滴定管中加入约24毫升0.2标准葡萄糖溶液(其量应控制在后滴定时消耗0.2标准葡萄糖溶液在1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟。加2滴1次甲基蓝溶液继续用0.2

28、2标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成。总耗糖量为v毫升。图1 水解装置校正值的计算：先求得10毫升斐林试剂相当的葡萄糖克数(F)，F=CV式中 C：标准葡萄糖溶液浓度(g/ml)再从斐林试剂糖量表(见附表2-1)查得V毫升时相当的葡萄糖克数(F0)，斐林试剂校正值f为：4.3 定糖吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加20毫升水，并从滴定管中预先加入适量的水解糖液(其量应控制在后滴定时消耗水解糖液在1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟。加2滴1次甲基蓝溶液，继续用水解糖液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成。5 计算从附表2-1查

29、得10毫升斐林试剂消耗水解糖液体积相当于100毫升水解糖液中所含葡萄糖量（G），则1毫升水解糖液中含葡萄糖量为G/100，再乘以斐林试剂校正值，即为1毫升水解糖液中实际含葡萄糖量：式中 500：试样稀释体积（ml） W：试样重量（g） 0.9：葡萄糖与淀粉的换算系数6 参考书（1）天津轻工业学院等，工业发酵分析，轻工业出版社，1980年附表2-1 斐林试剂糖量表消耗糖液体 积(毫升)相当葡萄糖 量(毫克)100毫升糖液中所含葡萄糖的量(毫克)消耗糖液体 积(毫升)相当葡萄糖 量(毫克)100毫升糖液中所含葡萄糖的量(毫克)15161718192021222324252627282930313249.149.249.349.349.449.549.549.649.749.849.849.949.950.050.050.150.250.2327307289274260247.4235.8225.5216.1207.4199.3191.8184.9178.5172.5167.0161.8156.9333435363738394041424344454