实验一实验准备和细菌培养

1、基因工程原理与方法基因工程原理与方法任课老师：刘振兰（实验部分）办公地点：生科院北楼607办公电话：85280200672473）邮 箱：zhenlan_公共邮箱：（密码：genetics）11）概述5%2）基因克隆的工具酶15%3）基因克隆的载体15%4）基因操作的基本技术15%5）基因工程实验原理与方法50%1）填空题25%2）名词解释15%3）判断题15%4）简答题25%5）分析题20%期末期末考试考试范围与题型范围与题型2实验一实验一 碱裂解法抽提质粒碱裂解法抽提质粒DNA实验二实验二 质粒质粒DNA的电泳检测的电泳检测实验三实验三 质粒质粒DNA的浓度测定和

2、酶切的浓度测定和酶切实验四实验四 酶切产物的电泳和目的片段的回收酶切产物的电泳和目的片段的回收实验五实验五 DNA的体外连接的体外连接实验六实验六 重组重组DNA的转化的转化实验七实验七 重组转化子的快速鉴定重组转化子的快速鉴定实验八实验八 多聚酶链式反应（多聚酶链式反应（PCRPCR）实验九实验九 植物基因组植物基因组DNA的提取的提取实验十实验十 基因组基因组DNA的的Southern杂交分析杂交分析实验内容实验内容3微型离心管（微型离心管（eppendorf管）管）96孔孔PCR板和板和96孔培养板孔培养板12 ml 细菌培养管细菌培养管PCR管和管和PCR八连管八连管吸头（吸头（tip

3、头）头）常常用用实实验验耗耗材材吸头盒吸头盒100 l -1 ml1 l -200 l 0.1 l -10 l 4吸头吸头套筒套筒容量显示窗容量显示窗吸头脱卸按钮吸头脱卸按钮体积调节旋钮体积调节旋钮移液器移液器（Pipettor）的基本结构的基本结构移液器容量移液器容量0.1-2.5 l 1- 10 l 2- 20 l 10 -100 l 20-200 l 100 -1000 l 200 -1000 l 5000 l 与 10 mLTip coneTip ejector collarDisplay coverTip ejectorPush button5移液器的使用移液器的使用移液器规范操作步

4、骤：移液器规范操作步骤：第一步第一步 设定移液体积设定移液体积 (Volume setting)从大体积调节至小体积时，为正常调节方法，逆时针旋转刻度即可，从小 体积调节至大体积时，可先顺时针调至超过设定体积的刻度，再回调至设 定体积，可保证最佳的精确度。第二步第二步 装配移液器吸头装配移液器吸头 (Sealing and ejecting tips)对于单道移液器，将移液器端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可。第三步第三步 吸液和放液吸液和放液 (pipetting techniques) 垂直吸液 吸头尖端需浸入液面以下 慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度 放液时吸头尖端靠在容器内壁移液器容

5、量移液器容量 入液深度入液深度 2 10 l 1 mm 20 100 l 2-3 mm 200 1000 l 3-6 mm 5000 l 10 ml 6-10 mm61、如如长时间不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧长时间不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧；处于松弛状态以保护弹簧；2、定期定期清洁移液清洁移液器器外壁，可以用外壁，可以用95%乙醇乙醇或或60%的异丙醇，再用蒸馏的异丙醇，再用蒸馏水擦拭，自然晾干；水擦拭，自然晾干；3、使用使用时要检查是否有漏液时要检查是否有漏液现象现象：方法方法是吸取液体后悬空垂直是吸取液体后悬空垂直放置放置15

6、秒秒，看看液面是否下降。如果漏液，则检查吸液嘴是否匹配和看看液面是否下降。如果漏液，则检查吸液嘴是否匹配和弹簧活塞是否正常；弹簧活塞是否正常；4、当当移液器吸嘴内有液体时，严禁将移液器水平或倒置放置，以防移液器吸嘴内有液体时，严禁将移液器水平或倒置放置，以防液体流入活塞室腐蚀移液器活塞；液体流入活塞室腐蚀移液器活塞；5、使用、使用正确的方法安装正确的方法安装吸头吸头，切记用力不能过猛，更不能采取剁吸切记用力不能过猛，更不能采取剁吸头的方法来进行头的方法来进行安装安装。移液器的日常维护保养移液器的日常维护保养7移液器的检测和校准移液器的检测和校准标准容量标准容量 最大允许误差最大允许误差 5 l

7、 0.3 l 10 l 0.3 l 20 l 0.4 l 100 l 1.5 l 200 l 2 l 500 l 5 l 1000 l 10 l 5000 l 50 l8标准容量标准容量 最大允许误差最大允许误差 5 l 0.3 l 10 l 0.3 l 20 l 0.4 l 100 l 1.5 l 200 l 2 l 500 l 5 l 1000 l 10 l 5000 l 50 l9超净工作台的使用超净工作台的使用1. 操作区内不允许存放不必要的物品，保持工作区的洁净气流流型不受干扰。操作区内不允许存放不必要的物品，保持工作区的洁净气流流型不受干扰。2. 使用前打开超净工作台的玻璃板，正确

8、的方法是，两手均匀用力托起玻璃板使用前打开超净工作台的玻璃板，正确的方法是，两手均匀用力托起玻璃板两端的把手到适当位置。两端的把手到适当位置。3. 用用75%乙醇对台面进行清洁后关闭玻璃板。乙醇对台面进行清洁后关闭玻璃板。4. 打开紫外灯，同时关闭日光灯进行紫外杀菌处理，一般处理打开紫外灯，同时关闭日光灯进行紫外杀菌处理，一般处理20分钟以上。分钟以上。5. 关闭紫外灯关闭紫外灯20分钟。分钟。6. 打开玻璃板和日光灯，调整风机到适当的速度进行无菌操作。打开玻璃板和日光灯，调整风机到适当的速度进行无菌操作。7. 操作完毕用操作完毕用75%乙醇对台面进行清洁，必要时打开紫外灯进行杀菌处理后再乙醇

9、对台面进行清洁，必要时打开紫外灯进行杀菌处理后再关闭电源。关闭电源。10大肠杆菌的液体培养和固体培养大肠杆菌的液体培养和固体培养液体细菌培养液体细菌培养小量培养小量培养：l 准备培养管：清洗管子和盖子后，放入500 ml或1 L的玻璃烧杯中，烧杯中加入约1/3体积的水，盖上保鲜膜微波加热至沸腾，约5-10 min）；l超净工作台操作：取灭菌 的12 ml细菌培养管，加 3 ml 液体LB 培养基，再加 100 mg/ml 氨苄青霉素 3 l；l 用镊子夹取无菌牙签挑取单菌落，送入培养基中；或取菌液 5 l ，转入培养液中，封好管口（牙签可去除或者保留）；l倾斜培养管放入 37摇床培养 200

10、rpm/min 震荡培养过夜，约 12 小时；l待菌液生长至饱和时取出抽提质粒，若暂时不用，可放入4冰箱保存。大量培养大量培养：取 500 ml 培养瓶内装培养基 100-200 ml，及相应抗生素。以 0.5-1 %浓度接种菌液，37 度摇床培养200 rpm/min至OD600值0.6-0.8。固体细菌培养固体细菌培养用于单一菌落的挑选，转化后抗性菌落的筛选。11LB培养基：培养基：一般被解释为Luria-Bertani培养基，这个名字来源於英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种，使菌种成倍扩增，达到使用要求。（图片引自：http:/zh.

11、/wiki/File:LBmedium.JPG）液体液体LB培养基培养基固体固体LB培养基培养基一瓶LB液体培养基和一块含有琼脂的LB固体培养平板12菌种活化：甘油法保存的含有质粒的菌种菌种活化：甘油法保存的含有质粒的菌种13划板后标识清楚，于37度恒温箱中将培养皿倒置培养过夜，待菌落长至合适大小时倒置放入4度冰箱保存（可放置一个月左右）。14培养皿上标识一般写底部边缘。培养皿上标识一般写底部边缘。15含质粒的大肠杆菌菌种的保存含质粒的大肠杆菌菌种的保存细菌保存于含有甘油的培养物中：细菌保存于含有甘油的培养物中：在液体培养基中生长的细菌培养物：取在液体培养基中生长的细

12、菌培养物：取0.5 ml细菌培养物放入细菌培养物放入1.5 ml灭菌灭菌的离心管内，加入的离心管内，加入0.5 ml高压灭菌高压灭菌30%甘油（甘油（W/V），振荡培养物使甘），振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的保存管内，密封，在乙醇干冰或液油分布均匀，然后转移到标记好的保存管内，密封，在乙醇干冰或液氮中冻结后再转至氮中冻结后再转至70度长期保存。在复苏时，用灭菌接种针刮取冻结度长期保存。在复苏时，用灭菌接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的的培养物表面，然后立即把黏附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面，于琼脂平板表面，于37度倒

13、置培养过夜。度倒置培养过夜。100 ml 30%甘油的配制：甘油的配制：称量称量30克甘油，然后用克甘油，然后用ddH2O定容到定容到100 ml，高压灭菌后保存于高压灭菌后保存于4度冰箱。度冰箱。16细菌培养注意事项细菌培养注意事项要保持培养物通气良好：要保持培养物通气良好：1、试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍；2、试管不宜盖紧；斜面培养用以增大培养基与空气的接触面积；3、培养物应在剧烈震摇下培养。大肠杆菌的菌落特征大肠杆菌的菌落特征：乳白色、圆形、菌落边缘整齐、表面光滑、表面和背面颜色一致。细菌培养物的处理：细菌培养物的处理：灭菌后丢弃。17细菌生长的典型曲线细菌生长的典型曲线(

14、.延迟期， .对数期， .稳定期， .衰亡期)18(1) 延迟期：少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进行繁殖，生长速度近于零。因此在开始一段时间，细菌数几乎保持不变，甚至稍有减少。这段时间被称为延迟期，又称为迟缓期、调整期或滞留适应期。处于延迟期细菌细胞的特点是分裂迟缓、代谢活跃。延迟期的长短与菌种、种龄、接种量和培养基成分有关。(2) 对数期：对数期又称指数期。这一阶段突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。(3) 稳定期：又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二

15、者处于动态平衡，此时生长速度又逐渐趋向零。稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数最高；这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。(4) 衰亡期：稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”，此阶段叫衰亡期。19分光光度计法测定大肠杆菌液体培养物的分光光度计法测定大肠杆菌液体培养物的OD600值值细菌细菌OD的测定原理是细菌颗粒的遮光，可以用来检测细胞数量，而通过数量能反映的测定原理是细

16、菌颗粒的遮光，可以用来检测细胞数量，而通过数量能反映出细胞生长的状态。菌液浓度太高，用培养基稀释可以降低出细胞生长的状态。菌液浓度太高，用培养基稀释可以降低OD值，但是太高浓度值，但是太高浓度OD值的菌液可能细菌的生长状态不符合要求，比如死的菌体会比较多等。值的菌液可能细菌的生长状态不符合要求，比如死的菌体会比较多等。1、在使用分光光度计时，测得的、在使用分光光度计时，测得的OD值在值在0 .1-0.4这个区间内最可靠，最好不要超过这个区间内最可靠，最好不要超过1.0。因此。因此OD尽量控制在尽量控制在0.1-1之间，最多不要超过之间，最多不要超过2.0。取值的时候要连续读数，。取值的时候要连续读数，重复重复3次的数最好。次的数最好。2、空白用不接种的培养基，但是不接种的培养基要和接种的同时培养，以求条件一、空白用不接种的培养基，但是不接种的培养基要和接种的同时培养，以求条件一致。致。3、OD与体积或者说稀释倍数不一定成正比，如果与体