乳酸细菌于干酪生产

1、第二节 乳酸细菌于干酪生产一、 乳酸细菌的肽酶（一） 乳酸细菌在干酪后熟中的作用 乳酸菌在乳品发酵中起着十分重要的作用，并对产品的质量和保藏有很大的影响。乳酸菌最主要的作用是将乳糖转化为乳酸，降低PH，并通过水解蛋白质，释放短肽和游离氨基酸，影响乳制品的风味和品质。 乳球菌是干酪生产中广泛使用的发酵剂，与凝结剂、乳内源酶一起参与酪蛋白的转化。酪蛋白水解是干酪成熟过程中品质和风味形成的关键。未产生料号的风味，干酪需要较长的成熟期。在干酪生产中除了作为发酵剂的乳酸菌外，还有一些非发酵剂乳酸菌（NSLAB），NSLAB能减少苦味，增加游离氨基酸含量，促进干酪成熟，NSLAB产生的氨肽酶具有降解苦味肽

2、的能力，可降干酪苦味。目前添加高活性蛋白水解能力的乳杆菌已被用来增强风味，缩短干酪成熟期。 一般而言，乳制品中游离氨基酸和小肽浓度较低，乳酸菌生长时难以达到较高菌体密度，但乳酸菌能依靠自身蛋白水解系统将乳蛋白降解为有利氨基酸以满足生长需要。乳酸菌的蛋白水解系统包括蛋白酶、酶结合运输系统以及细胞质肽酶，对形成干酪风味和质构非常重要。乳球菌和乳杆菌是干酪生产中广泛使用的发酵剂，在乳酸菌中发现有10多种不同类型的肽酶，并从乳酸菌和乳杆菌中克隆到多个肽酶基因。瑞士乳杆菌（lactobacillus helveticus）中的大多数肽酶，在乳酸乳球菌中均有相同类型的对应物。但瑞士乳杆菌的总蛋白水解活性要

3、比乳酸乳球菌高。因此在用其他发酵剂加工干酪时，常常加入瑞士乳杆菌作为风味添加剂。有利氨基酸不仅与形成干酪基本风味有关，二姐还是形成芳香物质的前体。瑞士乳杆菌的蛋白质水解酶不仅可缩短干酪成熟时间，还可用于生产新风味的干酪，改善低脂干酪的品质。 对肽酶在分子水平上的研究，使其在不同乳酸菌中异源表达成为可能。如将瑞士乳杆菌编码氨肽酶N(PEPN)、氨肽酶C（PEOC）、X脯氨酰二肽氨基肽酶（PEPD）的基因分别克隆到乳酸乳球菌MG1363中，研究这些基因在乳酸乳球菌中的表达能力。Luoma（2001）将瑞士乳杆菌的肽酶基因科龙到乳酸乳球菌中，研究蛋白水解活性的变化。讲工业用瑞士乳杆菌53/7中的肽酶

4、基因pepN、pepX、pepC、pepI、pepD和pepR分别克隆到乳酸乳球菌及其肽酶突变株中，构建具有新型能的生产菌株。（二） 肽酶的作用 瑞士乳杆菌肽酶pepN和pepC的底物是L-赖氨酸对硝基苯胺，pepI的底物是L-脯氨酸对硝基苯胺，pepX的底物是L-甘氨酸-脯氨酸对硝基苯胺，pepD的底物是亮氨酸-亮氨酸，pepR的底物是脯氨酸-亮氨酸。通过酶和底物的作用，对肽酶进行分析研究。 乳杆菌能水解酪蛋白，给菌体提够生长必需的氨基酸，通过构建单个和多个肽酶缺失突变体，可以了解肽酶对乳酸乳球菌生长的影响，由于突变体不能凤姐酪蛋白，会导致菌体在乳中生长缓慢，这说明了太美的重要性。 在含葡萄

5、糖的M17（GM17）培养基上，各个菌株的生长曲线无显著差异。在牛乳中生长时，乳酸乳球菌肽酶突变株的数量减少。瑞士乳杆菌pepN（Pkth2172）能使肽酶突变株恢复或接近野生型君主的生长水平，这表明生长缺陷乳酸乳球菌太没突变株可用相应的瑞士乳杆菌基因补充。瑞士乳杆菌pepN能补充乳酸乳球菌的5种肽酶缺陷型，这与pepN广谱的水解能力相一致。但瑞士乳杆菌的pepX或pepC不能使MG1363XTOCN突变菌在牛乳中正常生长。在含pepN、pepX、pepC、pepI的重组子的酶活增高，而含有pepD和pepR的重组子的酶活没有变化。在GM17和牛乳中的两种培养基中pepN的活性均约为1U/mg

6、蛋白。在低拷贝数数载体中，瑞士乳杆菌的肽酶基因（pepN）的表达水平最高，与野生型乳酸乳球菌相比，pepN的活性增加了25倍。 在GM17培养基中，重组子pepX的活性是宿主乳球菌pepX的5倍，而在牛乳中重组体活性显著下降。在GM17和牛乳中重组体的pepC活性均是宿主菌株的2倍，而pepI在GM17和牛乳中的活性几乎相同。 无论是在野生型还是在肽酶负突变株乳酸乳球菌中，瑞士乳杆菌pepN、pepX、pepC转录水平无显著差异。pepN在乳酸乳球菌中的转录产物是在瑞士乳杆菌中的10倍，而pepX、pepC在乳酸乳球菌中的转录水平比瑞士乳杆菌中低。不是所有来自瑞士乳杆菌肽酶的启动子都能在乳酸乳

7、球菌中起作用，有些启动子在乳酸乳球菌中不能识别，这与两者的启动子共有序列不同有关。对pepD和pepR在PnisA控制下的表达进行研究，当nisin浓度为5ng/ml时，重组体中肽酶活性最高，但nisin浓度继续增加会导致生长受阻和太没活性下降。Wegmann(1999)在PnisA控制下，成功地讲德氏乳杆菌乳亚种的4个肽酶基因pepI、pepL、pepW、pepG在乳酸乳球菌中表达，这些基因在乳酸乳球菌中均无对应物。这表明乳酸乳球菌的蛋白水解系统能用乳杆菌中肽酶基因调解。二、食品及重组体的肽酶活性 Joutsjoki等（2002）模拟干酪成熟过程的环境，对肽酶活性进行了研究。以L-赖氨酸硝基

8、苯胺为第五测定pepN、pepC的活性，以L-甘氨酸-脯氨酸硝基苯胺为第五测定PepX的活性，以L-脯氨酸硝基苯胺为底物测定pepI的活性。pepN的反应条件是50mmol/LMES，ph6.5,45；pepI的反应条件是50mg/L Tris-HCL,ph7.5,37。在测定PepC时，用5mmol/L EDTA抑制PepN的活性。同时在模拟干酪成熟条件下（4%Nacl、125mmol/LCaCl2、pH5.2）测定肽酶的活性。 含有pepN、pepC、pepX和pepI积阴德转化子乳酸乳球菌DN209在不含嘌呤的合成培养基17h后，菌体内的肽酶活性显著增加。含肽酶基因的乳酸乳球菌NM1在牛

9、乳培养基上尽管比乳酸乳球菌DN209的稍低，但其肽酶活性明显增加。 在模拟切达干酪成熟的条件下（4%Nacl、125mmol/LCaCl2、pH5.2），分别测定pepN、pepX和pepI在重组体中的活性。在合适pH（6.57.5），不含Nacl或4%NaCl时，重组体中pepN的活性是不加Nacl时的一半，而在干酪成熟条件下，活性为最适pH的5%。与pepN、pepX不同的是pepI在有NaCl时活性增加，在干酪成熟条件下，其活性也比pepN、pepX高很多。由于pepC在重组体中活性很低，没有进行分析。 比较食品级重组体与非食品及重组体的肽酶活性，两者的pepN活性很近，食品级重组体的p

10、epC活性只有非食品级重组体的一半，而pepX和pepI活性显著高于非食品级重组体，这可能是食品级重组体中增量调节pepX和pepI活性所致。 调控乳球菌蛋白水解系统是获得优良生产菌种的有效途径，如瑞士软杆菌的肽酶基因克隆到乳酸乳球菌中，能显著促进干酪成熟过程中蛋白的水解。单把水解产生的氨基酸是芳香物质的主要来源，所以改变不同类型氨基酸释放代谢水平，对改善产品的风味有着很大影响。第三节 活性物质的合成与调控 一、叶酸（一）叶酸的性质叶酸是含有蝶酰谷氨酸结构的一类化合物的统称，天然食品中的叶酸多以蝶酰多谷氨酸的新方式纯在。也算是一种人体必需营养素，在体内的活性形式是四氢叶酸，它是体内重要生化过程

11、中碳单位的运载体，元计算、嘌呤和嘧啶的合成有关。叶酸缺乏会导致生理失调，此外，叶酸还有抗心血管疾病和抗癌作用。叶酸缺乏是一个比较普遍的现象，成人每日也算推荐摄入量为400ug,孕妇推荐摄入量为600ug。许多植物、真菌和细菌都能合成叶酸，一些乳酸菌也能产生叶酸，因此发酵乳制品中叶酸的含量要高于非发酵乳制品。 代谢工程可通过是某些基因失活，或者所需基因的超量表达，已达到调控代谢的目的。NICE系统在调控乳酸乳球菌的异源或同源基因的表达十分有用。要设计合理的代谢工程途径，首先需要了解相关的代谢途径和基因。近年来报道了应用代谢工程来产生代谢途径复杂的胞外多糖和叶酸等产物。也算的合成包括糖酵解途径、戊

12、糖磷酸途径、生成对氨基酸苯甲酸的莽草酸途经和生成鸟苷三磷酸的飘零代谢，在最终组装叶酸和其衍生物还需要许多特异的酶反应步骤。四氢叶酸生物合成途径。 乳酸乳球菌能够合成叶酸，主要以聚谷氨酰叶酸的形式积累在细胞内，仅仅有少量叶酸释放到胞外。乳酸乳球菌乳酸亚种IL1403基因组中有编码叶酸生物合成图景基因的叶酸基因簇。乳酸乳球菌乳酸亚种MG1363和乳酸乳球菌乳酸亚种IL1403在基因组水平上有很高的同源性，但并不完全相同。Sybesma(2003)研究了MG1363中的叶酸基因簇，并通过代谢工程来提高叶酸产量。（二） 叶酸基因簇及有关基因的克隆乳球菌治理pNZ8048是一个转录融合载体，可应用于ni

13、sin调控的表达系统中。该载体含有一个nisA启动子和一个NcoI克隆位点。用引物FolKE-F和FolKE-R从染色体DNA上扩增到folKE基因，扩增产物酶切后克隆到pNZ8048上，得到pNZ7010。从染色体DNA上扩增到folC基因，扩增产物酶切后克隆到pNZ7010 folKE的下游，得到pNZ7011.从染色体DNA上扩增到folP基因，扩增产物酶切后克隆到pNZ7010 folKE的下游，得到pNZ7012.从染色体DNA上扩增到folA基因，扩增产物酶切后克隆到pNZ8048 上，得到pNZ7013，在克隆folA的发表一RNA基因，得到质粒pNZ7014，该质粒含有一个组成

14、型启动子和nisin诱导启动子，两者被一个终止子分开（pNZ8161）。具体方法是从染色体DNA上扩增到pepV的终止子，扩增产物酶切后克隆到pNZ8048上，得到pNZ8160，然后扩增得到pepN的组成启动子，扩增产物酶切后克隆到pNZ8160上，得到pNZ8161。从染色体DNA上扩增到folA基因，扩增产物用SphI8161上，得到pNZ7017，folKE基因在pepN的组成启动子调控之下。所有之力都分别转化NZ9000中（三） 也算基因和叶酸合成的关系在叶酸基因簇中只有56个基因与叶酸生物合成有关，folA编码二氢叶酸还原酶，folB可能编码新喋呤醛缩酶，folK可能编码2-氨基-

15、4-羟基-6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶，folE可能编码GTP环水解酶，folP可能编码二氢蝶酸合成酶folC可能编码叶酸合成酶或叶酰聚谷氨酸合成酶，cipX可能编码ATP结合蛋白，dukB可能编码脱氧核苷激酶，hom编码高丝氨酸脱氢酶，ysxC和ylgG均编码为脂蛋白。clpX、dukB、hom、ysxC和ylgG与叶酸生物合成无关。 GTP环水解酶I是叶酸生物合成途径的第一个酶。与未诱导菌株相比，含pNZ7010的pNZ9000的菌株超量表达folKE引起细胞外液酸浓度增加1080ng/ml，产量增加10倍，而含pNZ8048的pNZ9000对照株在nisin诱导时胞外叶酸浓度没有变化，细

16、胞内也没产生聚谷氨酰叶酸。同样的诱导条件下，与对照菌株以及未诱导菌株相比，超量表达folKE基因只因其细胞内叶酸少量增加，而超量表达folKE的乳酸乳球菌叶酸总量增加2倍。增加的叶酸主要以单谷氨酰叶酸、二谷氨酰叶酸和三谷氨酰叶酸的形式存在于细胞外，只是因为超量表达folKE，叶酸合成酶或聚谷氨酰叶酸合成酶不能将杜宇的叶酸转变成聚谷氨酰的形式。使用诱导启动子系统可以研究叶酸生物合成酶的表达水平的作用，发酵菌株最好使用组成型启动子，pepN组成新启动子表达folKE与NICE系统的结果相同，表达组成新启动子不仅可以表达叶酸合成的有关基因，而且可以提高叶酸含量。 细胞内外的叶酸分布受单谷氨酰叶酸和聚

17、谷氨酰叶酸比例的调控，有folC编码的聚谷氨酰叶酸合成酶负责合成聚谷氨酰叶酸。含pNZ7011的pNZ9000菌株同时超量表达folKE和folC，叶酸总量增加与单独超量表达folKE相同，但两者产生的叶酸分布不同。folKE和folC同时超量表达时增加的叶酸主要存在于胞内，这是因为同时超量表达folKE和folC时，叶酸合成酶促进了聚谷氨酰叶酸的形成并存在于胞内，对胞内叶酸进行脱聚合处理，未见叶酸浓度增加，说明同时超量表达folKE和folC对3个以上谷氨酸残基的聚谷氨酰叶酸的量没有明显影响。 诱导含有pNZ7011的pNZ9000菌株，超量表达folA，与对照菌株后为诱导的菌株相比，叶酸产

18、量降低2倍，表明叶酸在生物合成时有反馈抑制作用。胞内叶酸的分布和聚谷氨酰叶酸的量均没有变化。未了解folA反义RNA超量表达对叶酸产量的影响，将folA编码链的互补序列克隆到pNZ8048上，5端开始于folA终止密码子的互补序列，3端终止于folA起始密码子的互补序列，得到pNZ7014，并转化到pNZ9000中。在诱导条件下，与对照菌株相比，叶酸总量增加20%。含pNZ7014的pNZ9000菌株细胞提取物Hong二氢叶酸还原酶活性降低2倍，而超量表达folA的乳酸乳球菌的二氢叶酸还原酶活性比对照菌株增加1000倍。因此，通过选择性调控叶酸合成有关酶的表达，可以获得产叶酸水平较高的乳酸菌，

19、不仅可以用于叶酸的发酵生产。二、共轭亚油酸（一） 共轭亚油酸的结构和性质 共轭亚油酸是指一组位置和几何异构体的十八碳共轭二烯酸的统称。自然界中，CLA主要传在于瘤胃动物的肉和乳中，其中主要是9c，11t异构体，以及t10，c12异构体。CLA可利用微生物生物合成，也可用化学方法合成，但得到的都是几种异构体的混合物。化学合成的CLA异构体的组成更加复杂。 1987年Pariza等发现牛肉提取物具有抑制诱变剂作用的活性，进一步证实这种活性物质就是CLA。此后的研究表明CLA具有多种生物活性：抗癌抗突变；免疫调节；改变身体组成，如减少脂肪，增加肌肉；康动脉粥样硬化和型糖尿病，以及减肥、促进骨组织代谢

20、等。 CLA可抑制苯芘诱导小鼠前胃癌，其可能的抗癌机制是通过原位防御作用来防止膜收到自由基的攻击。对1,2-二甲基肼处理过的大鼠饲喂CLA，可显著降低结肠癌发病率，CLA抑制DMH诱导的结肠的机制可能和促进细胞凋亡有关。 动物实验表明CLA有减肥作用，分别研究9c，11t-CLA和t10，12c-CLA对小鼠身体成分的影响，发现CLA的减肥作用与t10，12c-CLA有关。用PPARa失活的雄性小鼠与野生型小鼠进行研究，发现CLA能提高编码脂质代谢和线粒体解偶联蛋白mRNA的水平，这可能是CLA调控脂质体内平衡的主要机制（二） 乳酸细菌与共轭亚油酸的生产已从乳酸菌种筛选到一些能形成共轭亚油酸的

21、菌株。Pariza等从饲喂亚油酸的老鼠肠道菌群中筛选到一株路氏乳杆菌能将亚油酸异构化成9c，11t-CLA，但不生成10t，12t-CLA。Ham等从健康婴儿粪便中分离到一株产生较高CLA的发酵乳杆菌。Kishino发现一株能将亚油酸转化成CLA的植物乳杆菌AKU1009a，在含12%（m/M）亚油酸的反应液中反映108h，CLA的产率为33%，其异构体有2种组成，9c，11-CLA（或9t，11c-CLA）占38%，9t，11c-CLA占62%；在含2.6%（m/M）亚油酸的反应液中反映96h，CLA的产率为80%，9c，11t-CLA(或9t，11c-CLA）占2%，9t，11t-CLA占98%。 研究了14株乳酸菌的发酵条件，发现乳酸乳球菌在添加剂葵花籽油的全脂乳培养基上形成CLA的能力最强，最适葵花籽油添加量为0.1g/L，CLA的形成受菌体量、培养时间、第五浓度、pH等因素影响。（三） 乳酸细菌中亚油酸异构酶的性质和基因克隆 对嗜酸乳杆菌和费氏丙酸杆菌中亚