第九章 蛋白质相互作用与定量蛋白质组学

1、 蛋白质相互作用与定量蛋白质相互作用与定量 蛋白质组学研究技术蛋白质组学研究技术第九章第九章n蛋白质相互作用主要研究技术蛋白质相互作用主要研究技术n酵母双杂交技术进展酵母双杂交技术进展nTAPTAP（T Tandemandem A Affinityffinity P Purificationurification) )技术进展技术进展n自动化、高通量酵母双杂交技术和自动化、高通量酵母双杂交技术和TAPTAP技术技术n定量蛋白质组学研究技术定量蛋白质组学研究技术主要内容：主要内容：一、蛋白质相互作用一、蛋白质相互作用 Protein-Protein Interactions 蛋白质相互作用蛋白质

2、相互作用控制着生命过程的各个方面控制着生命过程的各个方面Yeast Two HybridMass Spectrometry二、酵母双杂交技术及进展二、酵母双杂交技术及进展 Yeast Two-Hybrid，Y2H. Fields S. and Song O.: Nature, 1989, 340: 245-246 研究蛋白质相互作用的方法研究蛋白质相互作用的方法, ,利用转利用转录因子组件式（录因子组件式（modularmodular）结构的性）结构的性质。质。Y2H Y2H 就是将需要研究的蛋白质设就是将需要研究的蛋白质设计成计成“诱饵诱饵”，以钓出能与，以钓出能与诱饵蛋白诱饵蛋白发生物理相

3、互作用的蛋白质（发生物理相互作用的蛋白质（被捕食被捕食蛋白质蛋白质）。）。一个单转录因子有：一个单转录因子有： DBD: DNA binding domainDNA binding domain DNA DNA结合结构域。结合结构域。 AD:Activation domain,:Activation domain, 转录激活转录激活结构域：能激活结构域：能激活RNA聚合聚合酶起始转录。酶起始转录。 诱饵蛋白诱饵蛋白B + DBD:B + DBD:不能不能起始转录起始转录被捕食蛋白的被捕食蛋白的ORF + AD:ORF + AD:不能不能起始转录。起始转录。当当诱饵蛋白和被捕食蛋白诱饵蛋白和被捕

4、食蛋白在同一细胞中在同一细胞中表达，如发生相互作用，表达，如发生相互作用， RNARNA聚合酶将聚合酶将启动启动报告基因报告基因His3转录，合成组氨酸，转录，合成组氨酸，如如His3不表达，细胞不能生长。不表达，细胞不能生长。Fields S. and Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340: 245-246优点：优点： 酵母细胞几乎能表达所有生物基因。酵母细胞几乎能表达所有生物基因。缺点：缺点： 并非所有蛋白质能在酵母核内正常并非所有蛋白质能在酵母核内正

5、常行使功能，不正确的蛋白质折叠结构：行使功能，不正确的蛋白质折叠结构：n假阳性假阳性n假阴性假阴性Y2HY2H开始以转录因子开始以转录因子Gal4Gal4为基础，依靠为基础，依靠招募招募RNARNA聚合酶聚合酶IIII激活转录。激活转录。19971997：MarsoliterMarsoliter等建立以等建立以RNARNA聚合酶聚合酶IIIIII为基础的为基础的Y2HY2H，假阳性率更低。假阳性率更低。反向双杂交系统：反向双杂交系统：reverse two-hybrid system. 构建反向筛选的报告基因（构建反向筛选的报告基因（URA3，U合成所必需），蛋白质互作激活报告基因合成所必需）

6、，蛋白质互作激活报告基因表达，使细胞不能成活。表达，使细胞不能成活。分离杂交系统分离杂交系统，split-hybrid system 利用利用2个相互整合的报告基因。个相互整合的报告基因。细胞质中的双杂交系统：细胞质中的双杂交系统： SOS招募系统：招募系统： SOS recruitment system利用利用Ras信号传导途径的基本性质：信号传导途径的基本性质： 两种蛋白相互作用，就会将两种蛋白相互作用，就会将hSos(人的鸟苷酸交换因子人的鸟苷酸交换因子)招募到膜上，激活招募到膜上，激活Ras,使酵母细胞在限制温度下成活和使酵母细胞在限制温度下成活和增殖。增殖。其他新的双杂交系统：其他新

7、的双杂交系统： 分离的泛素系统分离的泛素系统 split-ubiquitin syatem. (PNAS, 1996,91:10340-10344)利用利用泛素泛素的功能特点。的功能特点。 当分别与当分别与泛素泛素N端和端和C端部分融合的两端部分融合的两个蛋白质相互作用时，使分离的个蛋白质相互作用时，使分离的泛素泛素的的两部分靠近，两部分靠近，泛素泛素专一性的蛋白酶就会专一性的蛋白酶就会识别识别泛素泛素，导致报道蛋白的解离释放。，导致报道蛋白的解离释放。单杂交系统，单杂交系统，one hybrid systemDNA和蛋白质间相互作用。和蛋白质间相互作用。鉴定与特定鉴定与特定DNA序列直接作用

8、的蛋白质。序列直接作用的蛋白质。三杂交系统，三杂交系统，three hybrid system RNA或小分子配体和蛋白质的相互作用或小分子配体和蛋白质的相互作用三者共同作用，才能激活转录。三者共同作用，才能激活转录。三、酵母双杂交技术在蛋白质组三、酵母双杂交技术在蛋白质组学中的应用学中的应用 Interactome 互作组：全面详尽的互作组：全面详尽的蛋白质相互作用图谱。蛋白质相互作用图谱。 病毒、细菌、酵母、线虫等。病毒、细菌、酵母、线虫等。T7噬菌体：噬菌体：首先用于大规模首先用于大规模Y2H分析：分析： 55个有个有25个相互作用。个相互作用。丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒HCV：编码编码1

9、0个成熟蛋白，个成熟蛋白，有有5个相互作用。个相互作用。 酿酒酵母：酿酒酵母：6000多个多个ORF, 1996完成完成基因组计划，阵列筛选法得到基因组计划，阵列筛选法得到281个相个相互作用；文库筛选法得到互作用；文库筛选法得到692个相互作个相互作用：用：Uetz,P. et al., Nature, 2000,403:623-627.线虫：线虫：148个相互作用：个相互作用： Walhout A.J. et al.: Science, 2000, 287: 116-122.四、噬菌体展示技术四、噬菌体展示技术 （Phage display） 噬菌体展示技术是利用噬菌体的外壳蛋白与目的噬菌

10、体展示技术是利用噬菌体的外壳蛋白与目的蛋白或多肽融合表达，将目的蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白或多肽融合表达，将目的蛋白表达在噬菌体颗粒的外部，在蛋白质水平上进行的外部，在蛋白质水平上进行“Biopanning”体外筛体外筛选，十分适用于酶与其配体或抑制剂、抗原决定簇、选，十分适用于酶与其配体或抑制剂、抗原决定簇、细胞表面受体的筛选等等。这个筛选的过程很简单，细胞表面受体的筛选等等。这个筛选的过程很简单，将目标肽或蛋白质固定于平板上，铺上噬菌体，噬菌将目标肽或蛋白质固定于平板上，铺上噬菌体，噬菌体外壳融合蛋白与目标肽结合，不能结合的噬菌体颗体外壳融合蛋白与目标肽结合，不能结合的噬菌体颗粒将被洗掉，再

11、将结合的噬菌体洗下，进行扩增培养，粒将被洗掉，再将结合的噬菌体洗下，进行扩增培养，再进行一到两次的轮回，就能够分离到特定的噬菌体再进行一到两次的轮回，就能够分离到特定的噬菌体颗粒。颗粒。 噬菌体展示技术噬菌体展示技术（Phage display） Ph.D.-7 Phage Display Peptide Library Kit Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library KitPh.D. Peptide Display Cloning System五、表面等离子体共振技术

12、五、表面等离子体共振技术 SPR Surface Plasmon Resonance 研究蛋白质相互作用的新方法。如研究蛋白质相互作用的新方法。如瑞典瑞典BIACORE的单元蛋白质芯片。的单元蛋白质芯片。 将诱饵蛋白作为配基，固化在几十将诱饵蛋白作为配基，固化在几十纳迷厚的金属膜表面，加入含猎物蛋纳迷厚的金属膜表面，加入含猎物蛋白的溶液，如有相互作用会特异性结白的溶液，如有相互作用会特异性结合形成蛋白质复合物，使金属膜与溶合形成蛋白质复合物，使金属膜与溶液界面的折射率上升，导致共振角度液界面的折射率上升，导致共振角度改变。改变。特点：特点： 快速、安全，不需标记物和染料，快速、安全，不需标记物

13、和染料，还可检测蛋白还可检测蛋白-核酸及其它分子间的相核酸及其它分子间的相互作用。互作用。 SPR DNA生物传感器可用于基因生物传感器可用于基因突变的检测、突变的检测、PCR产物测定、病毒检产物测定、病毒检测等。测等。六、蛋白质间连锁图的建立六、蛋白质间连锁图的建立 已建立已建立酿酒酵母酿酒酵母1548个蛋白质间个蛋白质间2358个相互作用网络个相互作用网络:Fields, S. Lab: Nat. Biotechnology 2000,18:1257-1261.七、酵母双杂交技术方法七、酵母双杂交技术方法首先是选择适当的载体系统：首先是选择适当的载体系统： BD, AD BD, AD 载体

14、：载体：Gal4,LexAGal4,LexA系统，多系统，多已商业化。然后将待鉴定的蛋白分别已商业化。然后将待鉴定的蛋白分别构建到载体上。构建到载体上。 筛选文库的双杂交实验流程。筛选文库的双杂交实验流程。阵列筛选法：阵列筛选法：用不同结合型（用不同结合型（a,a,）的）的表达表达“猎物猎物”和和“诱饵诱饵”蛋白的酵母菌蛋白的酵母菌株一一结合，可推测已知的蛋白质间的株一一结合，可推测已知的蛋白质间的相互作用。相互作用。文库筛选法：文库筛选法：用表达一种用表达一种“诱饵诱饵”蛋白蛋白的酵母细胞和一个表达复杂的文库的酵母细胞和一个表达复杂的文库“猎猎物物”蛋白的酵母细胞直接结合。可发现蛋白的酵母细

15、胞直接结合。可发现未知蛋白。未知蛋白。八、双杂交系统及其应用八、双杂交系统及其应用主要商业公司：主要商业公司：nAPPLIED BIOSYSTEMSnBIOSIGNAL PACKARD INC.nCLONTECHnINVITROGENnORIGENE TECHNOLOGIES INC.nPROMEGA CORPnQBIOGENEnSTRATAGENEClontech 公司的酵母双杂交系统n诱饵基因的扩增和表达载体的构建诱饵基因的扩增和表达载体的构建n诱饵表达载体转化到酵母中诱饵表达载体转化到酵母中, ,验证对酵母的毒性和验证对酵母的毒性和自激活实验自激活实验n猎物文库的选择猎物文库的选择( (

16、预转化的文库和预制的文库预转化的文库和预制的文库),),文文库扩增库扩增, ,质粒提取质粒提取n诱饵和猎物用共转化或交配诱饵和猎物用共转化或交配(Mating)(Mating)的方法转化的方法转化到同一酵母中到同一酵母中n涂布到约涂布到约5050个筛选平板上个筛选平板上n菌落长出后，挑取阳性菌落作菌落长出后，挑取阳性菌落作beta-galbeta-gal报道基因报道基因实验实验n菌落菌落PCRPCR扩增猎物基因，测序扩增猎物基因，测序nBlastBlast分析得到猎物基因序列分析得到猎物基因序列n阳性相互作用的重新验证阳性相互作用的重新验证(Co-IP,pull-down,(Co-IP,pul

17、l-down,共定共定位等功能实验）位等功能实验）从事大规模酵母双杂交的研究机构n Alliance for Cell Signalingn Myriad Genetics Inc.n Hybrigenicsn CuragenProtein ComplexBacterianRain J.C ., etal. nThe protein-protein interaction map of Helicobacter pylori. nNature 409,211-215( 2001)幽门螺旋菌（导致胃病）幽门螺旋菌（导致胃病）OrganismTechnologyNumber of assays(b

18、aitprey)Detected interactionsAlready knownS.cerevisiae(6000ORFs)Protein arraysPools of prey192 proteomeproteome proteome281692109S.cerevisiae(6000ORFs)Pools of baits and prey430 assays of pools 969617512S.cerevisiae(6000ORFs)Pools of baits and prey3844 assays of pools 9696841105S.cerevisiae(6000ORFs

19、)Library screening15proteome1703S.cerevisiae(6000ORFs)Library screening11 proteome11334S.cerevisiae(6000ORFs)Library screening68proteome191128YeastViral genomeOrganismTechnologyNumber of assays(baitprey)Detected interactionsAlready knownVaccinia vrius (266ORFs)Protein arrayproteome proteome379HCV(10

20、ORFs)Protein arrayLibrary screening10 proteome22 fragments proteome0522T7Library screeningRandom Random254McCraith S.,et al. Genome-wide analysis of vaccinia virus protein-protein interactions. Proc.Natl. Acad.Sci. 97,4879-4884 (2000) Flajolet M.,et al. A genomic approach of the hepatitis C virus ge

21、nerates a protein interaction map.Gene 242,369-379 (2000) Bartel P.,et al.A protein linkage map of Escherichia coli bacteriophage T7. Nature Genetics 12,72-77(1996)Caenorhabditis elegans 线虫OrganismTechnologyNumber of assays(baitprey)Detected interactionsAlready knownC.elegans(20000ORFs)Protein array

22、Library screeing292927 proteome812463Walhout A.J.M.,et al. Protein interaction mapping in C.elegans using proteins involved in vulval development. Science 287,116-122 (2000). 九、九、TAP（Tandem Affinity Purification)技术进展技术进展NATURE BIOTECHNOLOGY VOL 17 OCTOBER 1999特点：特点：n高纯度高纯度n一次实验可以鉴定多个组分一次实验可以鉴定多个组分n体

23、内纯化复合体体内纯化复合体n材料需要量少材料需要量少n花费低、时间少花费低、时间少n靶蛋白可能含有靶蛋白可能含有TEV TEV 蛋白酶切位点蛋白酶切位点nEGTAEGTA可能影响复合体的稳定可能影响复合体的稳定Nature,415:141-147,January,2002十、自动化、高通量十、自动化、高通量酵母双杂交技术和酵母双杂交技术和TAPTAP技术技术HyNet: Yeast Two-Hybrid StrategyHySpec: Protein Science and Mass SpectrometryBioinformatics AnalysisMyriad Genetics Inc.

24、Myriad, Hitachi, Oracle & Friedli Join Forces To Map The Entire Human Proteome $185 Million Collaboration to Determine All Human Protein Interactions And Decipher Biochemical PathwaysAutomated Plating and Colony PickingLiquid mating and plating Picking Tool Retrieving a Colony Inoculating a Plat

25、e of Liquid Culture Automated PCR set up and Sequence Analysis High Throughput PCR of ORFsGateway Cloning and Clone ArchiveHuman cell lysate preparationGene deliveryBacterial ExpressionProtein Purification Protein PulldownsMultidimensional chromatography separation Combined ESI-MS and MALDI-MS在药物开发中

26、的应用nAwarded US Patent on p10 Tumor Suppressor GenenCholesterol Disorders Represent Novel Drug Targets nDiscovers Novel Hepatitis C TargetnDiscovers High Cholesterol GenenNovel Drug Target for Colorectal CancernNovel Drug Target for Hepatitis BnNovel Prostate（前列腺）（前列腺） Cancer GenenMajor Cause of Here

27、ditary Obesity nMajor Depression（抑郁）（抑郁） Gene Automated yeast two hybrid screening 100,000 clones per day Array format Full data trackingMegaMateGenetix十一、定量蛋白质组学研究技术十一、定量蛋白质组学研究技术 Quantitative proteomics Mann M.: Nat. biotechnol.,1999,17:954-955. 把一个基因组表达的全部蛋白质或一个把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精复

28、杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门科学。确的定量和鉴定的一门科学。（Trends Biotechnol.,1999,17:121-127） 蛋白质染色强度：定量蛋白质染色强度：定量要求：要求： 染色强度与蛋白质量成正比；染色强度与蛋白质量成正比； 通用性好（不同蛋白质具有相同染通用性好（不同蛋白质具有相同染 色能力）色能力） 高灵敏度高灵敏度 染色不影响后续鉴定（如不影响染色不影响后续鉴定（如不影响MS 中蛋白质分子的离子化过程）中蛋白质分子的离子化过程）定量蛋白质组学方法：定量蛋白质组学方法： 多维色谱多维色谱-质谱联用技术质谱联用技术 蛋白质荧光染色技术蛋白质荧光染色技术

29、 同位素标记技术同位素标记技术 同位素亲和标签技术同位素亲和标签技术 蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术1、荧光染色定量技术、荧光染色定量技术 有两种染料：有两种染料： 共价结合：共价结合：花青染料花青染料 多位点结合，蛋白质溶解度降低，用量多位点结合，蛋白质溶解度降低，用量少，灵敏度低。少，灵敏度低。 非共价结合：非共价结合：（1）与蛋白质没有特定的亲和力，在疏水）与蛋白质没有特定的亲和力，在疏水性环境中才产生荧光：如苯乙烯基染料：性环境中才产生荧光：如苯乙烯基染料： Sypro Orange, Sypro Red, Sypro Ruby 尼罗河红：尼罗河红：Nile Red. （2）与蛋白质有特

30、定的亲和力）与蛋白质有特定的亲和力 RuBPS：一种钌螯合剂。：一种钌螯合剂。Amersham: 2-D DIGE: Fluorescence Two-dimensional Differential Gel Electrophoresis荧光双向差示凝胶电泳技术。荧光双向差示凝胶电泳技术。 利用与蛋白质利用与蛋白质共价结合共价结合的染料。的染料。 Proteomics, 2001,1:377-396.2 2、采用同位素编码亲和标签技术、采用同位素编码亲和标签技术 Isotope Coded Affinity Tags, Isotope Coded Affinity Tags, ICAT: G

31、ygi et al: Nat.Biotechnol.,1999,17:994-999.关键：关键：ICTAICTA试剂试剂: :三部分组成。三部分组成。 可定量分析：可定量分析： 蛋白质标记蛋白质标记 酶切酶切 亲和色谱分亲和色谱分离离 MS MS 信号强度信号强度 定量定量 测序。测序。3、稳定同位素代谢标记技术、稳定同位素代谢标记技术 Oda et al., PNAS, 1999,96: 6591-6596.方法：方法： 两组酵母细胞：两组酵母细胞：14N 99.6% + 15N 0.4% 15N 96% (Mr大大). 2-D、染色找出差异蛋白，酶解后进行、染色找出差异蛋白，酶解后进行M

32、ALDI-TOF-MS 分析：精确定量。分析：精确定量。缺点缺点（1）只适合于微生物）只适合于微生物 （2）同位素影响微生物生长与蛋白合成）同位素影响微生物生长与蛋白合成 （3）同位素标记）同位素标记Mr增加，加大数据检增加，加大数据检 索难度。索难度。4、蛋白质芯片技术、蛋白质芯片技术 将蛋白质组的部分或全部蛋白质种将蛋白质组的部分或全部蛋白质种类制作成蛋白质芯片（诱饵蛋白，如类制作成蛋白质芯片（诱饵蛋白，如抗体）抗体）,这样的芯片可以用于筛选特定这样的芯片可以用于筛选特定分子的相互作用分子。实质上是大规分子的相互作用分子。实质上是大规模的模的ELISA技术。技术。技术关键：技术关键：（1）

33、空间上固定能辨别单一蛋白成）空间上固定能辨别单一蛋白成分的分子。分的分子。（2）检测混合物中单个蛋白与它们）检测混合物中单个蛋白与它们相应的识别分子间的相互作用。相应的识别分子间的相互作用。类型：类型： 玻璃板芯片玻璃板芯片 3D胶芯片（胶芯片（3D gel pad chip） 微孔芯片（微孔芯片（micro-well chip）Ciphergen公司：公司： ProtenChip 蛋白质芯片蛋白质芯片Clontech 抗体芯片抗体芯片Ab Microarray 380Ab Microarray芯片上的抗体包含针对信号传导、癌症、细胞周期调芯片上的抗体包含针对信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞

34、结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关蛋白，跨度大、适用范围广相关蛋白，跨度大、适用范围广, , 在毒性实验、疾病研在毒性实验、疾病研究和药物开发上有广泛的应用前景。究和药物开发上有广泛的应用前景。传统芯片技术传统芯片技术分子间固相分子间固相-液相相互作用液相相互作用LIQUIDCHIP分子间在液相中相互作用分子间在液相中相互作用(分子间相互分子间相互作用的最有效方式作用的最有效方式) LiquichipLiquichip System System 是在是在xMAPxMAP技术的基础上建立起来的蛋技术的基础上建立起来的蛋白质分析平台。反应

35、在悬浮于液白质分析平台。反应在悬浮于液体中的球形基质上进行，提供了体中的球形基质上进行，提供了在一次样品分析中同时进行多达在一次样品分析中同时进行多达100100种不同的分析的可能性。种不同的分析的可能性。 使用使用LiquichipLiquichip System System 可以可以完成蛋白组学研究和药物研发中完成蛋白组学研究和药物研发中的许多种蛋白质分析。整个系统的许多种蛋白质分析。整个系统包括仪器，软件，球形反应基质包括仪器，软件，球形反应基质和检测试剂和检测试剂。Liquichip System 的应用的应用w免疫分析 (e.g., ELISA)w酶分析w受体-配基分析w蛋白质 -

36、 蛋白质w蛋白质 - 核酸十二、免役共沉淀技术十二、免役共沉淀技术 检测蛋白质检测蛋白质- -蛋白质间物理作用的方蛋白质间物理作用的方法。使用抗体时即为法。使用抗体时即为免役共沉淀。免役共沉淀。 基本方法：基本方法：利用蛋白质间特异亲和的原理。利用蛋白质间特异亲和的原理。 细胞裂解在非变形条件下制备总蛋细胞裂解在非变形条件下制备总蛋白，以一种蛋白的抗体特异地免疫沉淀白，以一种蛋白的抗体特异地免疫沉淀这种蛋白，然后用第二种蛋白或更多种这种蛋白，然后用第二种蛋白或更多种蛋白的抗体做免疫印迹，检测它们是否蛋白的抗体做免疫印迹，检测它们是否被第一种蛋白共沉淀，以对照检测相互被第一种蛋白共沉淀，以对照检

37、测相互作用的特异性。作用的特异性。1、检测蛋白质的存在、检测蛋白质的存在 Western blot 检测参与免役共沉淀检测参与免役共沉淀的蛋白质的表达或存在。的蛋白质的表达或存在。2、制备总蛋白提取物、制备总蛋白提取物3、相互作用特异性对照实验、相互作用特异性对照实验4、免役共沉淀技术的其他分析、免役共沉淀技术的其他分析 灵敏度高、能反映体内的相互作用灵敏度高、能反映体内的相互作用情况，可与情况，可与Y2H结合使用。结合使用。 两个方向分别共沉淀：两个方向分别共沉淀： 以蛋白以蛋白A的抗体免役共沉淀，以蛋白的抗体免役共沉淀，以蛋白B的抗体免疫检测；的抗体免疫检测； 同时以蛋白同时以蛋白 B的抗体免役共沉淀，以的抗体免役共沉淀，以蛋白蛋白A的抗体免疫检测。的抗体免疫检测。十三、细胞共定位技术十三、细胞共定位技术 1 1、荧光蛋白融合技术、荧光蛋白融合技术 Green fluorescent protein, GFP: 238个氨基酸，维多利亚水母中克隆。个氨基酸，维多利亚水母中克隆。Chaflie,M. et al.: Science, 1994, 263:802-805.一种独特的报告基因。一种独特的报告基因。晶体结构：晶体结构：11条链的条链的桶型结构包围一个桶型结构包围一个中央螺旋。中央螺旋。 将将GFP和某一基因的编码区相连形成和某一基因的编码区相连形成融合体，可研究