药学中的生物技术和方法2015-3-抗体和免疫分析

1、抗体 -生物体自造的“magic bullet”国际抗体药物 2009年美国市场上的抗体药物成为生物技术药物销售额最大的类别。 2010年美国市场的单抗药物销售额为185亿美元 2011年，全球单抗药物的市场总量已经达到628亿美元， 世界范围内的单抗药物销份额约是整个生物制药市场份额的36%。国内抗体药物 目前我国的上市抗体品种中,国外进口单抗占据多数 2011年国内市场规模超过10亿元 我国抗体药物产业化的主要限制因素： 动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生物医药产业化的核心竞争点物医药产业化的核心竞争点 抗体下游纯化成本已占抗体下游纯化成本已占45

2、%到到70%高质量纯高质量纯化工艺研究刻不容缓化工艺研究刻不容缓 QbD（质量源于设计）理念的应用（质量源于设计）理念的应用抗体偶联药物(Antibody Drug Conjugates，ADC) 结合单克隆抗体的靶向性和小分子药物的高度细胞毒性，可以有效地杀伤肿瘤细胞，在临床前研究、甚至人体临床研究中，取得了良好的抗肿瘤效果，成为生物药物研究的热点领域之一; ADC药物为疾病的“精准医疗”提供有效的武器。抗体-药物偶联剂（ADCs）的研究进展与产业现状: http:/ and structure特点：2个基因决定一个蛋白质 与抗原的结合力强，高度专一性抗原和抗原决定簇 一个抗原分子上可能有数

3、个数个抗原决定抗原决定簇簇 每個 抗原决定簇至少誘生一至少誘生一种种专一性抗体 蛋白质抗原的决定簇含有六含有六个个以上以上氨氨基基酸酸 。 克隆选择学说单抗和多抗 多克隆抗体（polyclonal antibody）指由不同B细胞产生的针对多种抗原决定簇的多种抗体混合物，如免疫血清。 单克隆抗体（ monoclonal antibody）指由一种 B 细胞生产，针对某一抗原决定簇的单一抗体。Preparation of polyclonal antibodies传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫混合抗混合抗体体1 234BALB/ c12341 234免疫前要先把抗原作成乳剂约在两月內注

4、射五到八次Preparation of monoclonal antibodiesPreparation of recombinant antibodies单链抗体 在重链与轻链之间加上一段连接肽，连成一条单链 如果仅是两条链的可变区，称为ScFv 连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是GGGGS3Ab as antigen- Primary and secondary antibodyPrimary AbSecondary AbPrimary AbProtein A二抗针对一抗的物种特异性Protein A针对所有动物抗体

5、FcImmunoassays 抗体的标记方法 放射性同位素标记 酶标记 荧光标记 有机分子荧光标记 绿色荧光蛋白标记 稀土荧光标记 通用标记放射性碘标记HRP酶标记NCH简单化学偶联方法： 1过碘酸钠法：仅用于HRP的标记。HRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基，再与抗体蛋白的游离氨基结合，结合反应后，再加人硼氢化钠(NaHB4)还原后，形成稳定的HRPCH2NHIgG酶标记物。为防止酶蛋白氨基与醛基反应发生自身偶联，常在标记前知用二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白上的和氨基。 2戊二醛交联标记法：戊二醛具有两个活性醛基，分别与酶分子和抗体分子上的氨基结合。 HNH2C

6、NaHB4HRPLabeling with isoFITCGFP labelingGFP geneScFv geneVectorexpressionGFP geneProtein A geneVectorexpressionAb-Fc通用标记+Avidin/streptA+Anti-digoxin Ab 2nd AbProtein APrimary AbPrimary AbImportant assays Immunostaining Western blot Fluorescent microscopy Quantification of immunostaining Quantitativ

7、e assays: Radioimmunoassay, RIAcompetent binding Fluorescence immunoassay, FIA FPIA-homogeneous assay TRFIA Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISAImmunostainingFluorescence/luminescenceColorizationor组织切片或培养细胞单层细胞/组织固定免疫染色（荧光）显微镜观察免疫荧光标记的c-Myc phalloidin荧光标记的微丝 荧光染色的细胞核 合成图像 Immunoblot - Western Bl

8、otElectroblottinggelPVDF membraneImmunostaining封闭分析抗体显色抗体显色数字化灰度数字化灰度图像分析图像分析051015202530020406080100120140160180200220240Level of expression (Arbitrary unit)Time (h) c-myc Clin D1 p530.5 1 2 4 6 8 12 16 24 30 (h)c-mycp53Cyclin D1ActinCaNCaM:La3+HRPStreptAvidinBiotinRIA Assay免疫竞争结合分析免疫竞争结合分析-小分子抗原小分

9、子抗原分析的基本方法分析的基本方法Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag*AgAb: Precipitant放射性计数放射性计数常用分离沉淀技术 盐析法：饱和硫酸铵、硫酸钠 聚乙二醇法（w=6000） 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大 抗体免疫沉淀法 特点： 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但成本高 固相吸附剂RIA测量步骤 恒量的* Ag、Ab加入反应管中 加入待测样品、或标准品（已知浓度） 37或4 温育 加入分离剂分离结合及游离部分 测定以总放射性为分母，测定* AgAb 为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为坐标，制作标

10、准曲线 待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度Calibration curveELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay）Sandwich ELISA竞争法（略）High ConvenienceHigh Sensitivity96-well plate包被封闭结合显色酶标仪测定hv洗涤洗涤洗涤终止酶的底物酶的底物 邻苯二胺邻苯二胺(OPD) + H2O2 TMB ABTSHRP的底物的底物氧化产物氧化产物(橙红色橙红色)492nm吸收吸收2mol/L硫酸终止反应AP的底物的底物 硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯 对硝基酚对硝基酚(黄色黄色) NaOH终止反应 405

11、nm吸收峰吸收峰磷酸磷酸4-甲基伞酮甲基伞酮（荧光底物）（荧光底物）荧光偏振免疫分析Principle of fluorescence polarization emittingdipoleabsorbingdipole excitation light polarized along zxzyII detector)/(10rr)cos3 (5120rIIIIr2RTVFluorescence polarization immunoassayAg + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag High polarized fluorescenceLow polari

12、zed fluorescence偏振度r时间分辨荧光免疫分析荧光物质荧光物质荧光寿命荧光寿命(ns)(ns) 荧光物质荧光物质荧光寿命荧光寿命(ns)(ns)非特异荧光背非特异荧光背景景1 11010SmSm3+3+ -NTA -NTA 6500065000人血清蛋白人血清蛋白4.14.1SmSm3+3+-PTA-PTA6000060000球蛋白球蛋白3.03.0EuEu3+3+-NTA-NTA714000714000细胞色素细胞色素C C3.53.5EuEu3+3+-PTA-PTA925000925000FITCFITC4.54.5TbTb3+3+-PTA-PTA9600096000丹黄酰氯丹黄酰氯1414DyDy3+3+-PTA-PTA10001000罗丹明罗丹明B B3.03.0荧光背景和常用探针分子的荧光寿命Lanthanide labelingProteinNH2+NOHONNOOOOOOProteinNHNHOONNOHOOOOOHOEuOLa