多糖的研究方法及其进展1

1、多糖的研究方法及其现状多糖的研究方法及其现状活性多糖的研究活性多糖的研究 -正在形成中的热点正在形成中的热点2004.11.2004.11.生命的四大物质：生命的四大物质： 蛋白质蛋白质核酸核酸脂类脂类多糖多糖 六十年代以后六十年代以后, , 随着随着现代仪器现代仪器分析方法分析方法的飞速发展的飞速发展, ,使人们能成使人们能成功的分离纯化和鉴定生物体内功的分离纯化和鉴定生物体内微量微量活性物质活性物质, , 从而对糖特别是多糖的从而对糖特别是多糖的认识产生了飞跃。认识产生了飞跃。 愈来愈多的研究发现愈来愈多的研究发现, , 人的生命过程几人的生命过程几乎都与糖链有关乎都与糖链有关: : 如如

2、 细胞间通讯细胞间通讯, , 识别和相互作用识别和相互作用 细胞的运动和粘附细胞的运动和粘附 病原与宿主细胞的作用病原与宿主细胞的作用 等等等等. . 这是因为这是因为糖链携带着生物信息糖链携带着生物信息. . 它在细它在细胞表面的分子识别过程中起着决定性作用胞表面的分子识别过程中起着决定性作用. . 血型血型 -红血球表面糖链末端糖基的不同红血球表面糖链末端糖基的不同 恶性肿瘤细胞与正常细胞的不同恶性肿瘤细胞与正常细胞的不同 -糖链的不同糖链的不同 19951995年年HirabayashiHirabayashi提出提出 “ “类似于基因密码类似于基因密码, , 可可能也存在能也存在多糖密码

3、多糖密码”的论点的论点. .多糖的研究己愈来愈受到人们的关注多糖的研究己愈来愈受到人们的关注. . 国内外正在形成国内外正在形成热点热点生物细胞生物细胞 特征特征: : 繁殖繁殖( (复制复制) ) 凋亡凋亡 -平衡平衡 平衡破坏平衡破坏: : 细胞细胞过度过度增生增生-组织表组织表 面大体积堆积面大体积堆积( (肿瘤肿瘤)-)-增生增生 细胞基因突变细胞基因突变( (癌癌) )癌细胞源于正常细胞癌细胞源于正常细胞 找既抑制癌细胞又不找既抑制癌细胞又不伤正常细胞伤正常细胞-困难困难 多糖是一种免疫调节剂多糖是一种免疫调节剂 ( (激活机体免疫反应激活机体免疫反应) ) 但也有少数多糖具直接杀死

4、癌细胞作用但也有少数多糖具直接杀死癌细胞作用 或两者俱存或两者俱存- - 治疗机体免疫功能受到严重损伤的治疗机体免疫功能受到严重损伤的癌症癌症和和爱滋病爱滋病 - -治疗多种免疫缺损疾病和某些细菌治疗多种免疫缺损疾病和某些细菌, ,病病毒引起的疾病毒引起的疾病 多糖作为药物的最大特点是毒副作用很小多糖作为药物的最大特点是毒副作用很小 -多糖还具有明显的抗病毒、抗感染、降多糖还具有明显的抗病毒、抗感染、降血糖、降胆固醇、降血脂以及最近我们实验室血糖、降胆固醇、降血脂以及最近我们实验室发现的发现的刺激神经细胞生长作用刺激神经细胞生长作用徐徐, 冯教授冯教授: 抗心肌缺血作用抗心肌缺血作用但是但是

5、多糖的研究必竟起步较晚多糖的研究必竟起步较晚-各方面尚须进行深入的研究各方面尚须进行深入的研究-大量大量新的活性多糖新的活性多糖有待于研究与开发有待于研究与开发-作用机制有待于完善作用机制有待于完善 多糖的构效关系的研究是寻找高活性多糖的构效关系的研究是寻找高活性多糖及深入研究多糖作用机制的基础多糖及深入研究多糖作用机制的基础目前研究得较为深入：目前研究得较为深入：高等真菌高等真菌( (主要是蘑菇类主要是蘑菇类) )产生的产生的 -葡聚糖葡聚糖 某些植物产生的具抗补体作用的某些植物产生的具抗补体作用的 果胶类多糖果胶类多糖影响构效关系研究影响构效关系研究: :1) 1) 多糖的化学平面结构测定

6、比较困难多糖的化学平面结构测定比较困难, , 特特别是含有几种糖残基的杂多糖别是含有几种糖残基的杂多糖, , 至于决定多至于决定多糖活性的高级结构糖活性的高级结构( (三维结构三维结构) )测定更难测定更难. .因为因为多糖是水溶性胶状物质不能结晶多糖是水溶性胶状物质不能结晶, ,这样限制了这样限制了用通常用通常X-X-衍射方法去测定立体结构衍射方法去测定立体结构. . 2) 2) 多糖的体内药物代谢动力学研究困难多糖的体内药物代谢动力学研究困难3) 3) 多糖在分子水平下与蛋白质多糖在分子水平下与蛋白质, ,核酸等其核酸等其他分子相互作用的认识还不清楚他分子相互作用的认识还不清楚. . 由于

7、目由于目前有关多糖的药理研究主要局限于观察多前有关多糖的药理研究主要局限于观察多糖在体外或体内的生物效应糖在体外或体内的生物效应, , 要达到分子要达到分子水平水平, ,细胞水平还需大量研究细胞水平还需大量研究. . 己有的实验证明影响多糖生物活性的主要己有的实验证明影响多糖生物活性的主要因素：因素： 分子量分子量, ,分枝度分枝度, ,高级结构高级结构, ,溶解度溶解度, ,粘度粘度等等 多糖多糖-大分子大分子-分子内的分子内的糖苷键糖苷键有较强有较强的旋转性的旋转性 -决定了多糖的二级结构决定了多糖的二级结构 氢键氢键, ,范德华力范德华力, ,色散力色散力和和疏水性疏水性等非共等非共价作

8、用价作用 -决定了多糖的三级结构决定了多糖的三级结构蘑菇类产生具抗肿瘤作用的多糖蘑菇类产生具抗肿瘤作用的多糖: :分子量分子量 1010万至万至100100万万分枝度为分枝度为2:32:3至至1:51:5三股螺旋立体结构的三股螺旋立体结构的-葡聚糖葡聚糖 香菇多糖香菇多糖, ,云芝糖肽云芝糖肽, ,裂褶菌多糖裂褶菌多糖 -正式在临床上应用正式在临床上应用 证明在证明在提高机体免疫提高机体免疫功能上特别是功能上特别是肿瘤辅助治疗肿瘤辅助治疗中具有显著作用中具有显著作用-受到受到临床医生的青睐临床医生的青睐 但是但是, ,人们期待更有效的活性多糖人们期待更有效的活性多糖的问世的问世 特别是具有抗炎

9、作用特别是具有抗炎作用, ,抗病毒作用抗病毒作用, ,降降血糖作用血糖作用, ,刺激神经细胞作用的多糖问世刺激神经细胞作用的多糖问世目前主要可从二方面着手目前主要可从二方面着手: : 一是继续从一是继续从高等真菌高等真菌( (如灵芝如灵芝, ,猪苓猪苓, ,猴头菇猴头菇, ,冬虫夏草冬虫夏草, ,姬松茸姬松茸) )中寻找活性多中寻找活性多糖糖. . 同时重点从动植物特别是从传统的同时重点从动植物特别是从传统的中中草药草药及及海洋生物海洋生物（如海藻）（如海藻）中寻找高效的中寻找高效的活性多糖活性多糖. . 实验证明实验证明: : 许多属去邪扶正的中药许多属去邪扶正的中药-发挥主要作用的大多是发

10、挥主要作用的大多是多糖多糖成份成份-从中草药及海洋生物中寻找有效的从中草药及海洋生物中寻找有效的活性多糖活性多糖-方向方向 最新报道最新报道藻类中主要存在的硫酸酯多糖藻类中主要存在的硫酸酯多糖可以抑制可以抑制HIV-I表面糖蛋白表面糖蛋白gp120与免疫与免疫细胞表面细胞表面CD4受体的结合受体的结合抑制合胞体的形成抑制合胞体的形成特别适合制成一种外用型杀菌剂以防止特别适合制成一种外用型杀菌剂以防止Aids通过性交途径的感染通过性交途径的感染具有成本较低，水溶性好，不产生机体不良具有成本较低，水溶性好，不产生机体不良 我们认为影响发现活性多糖的我们认为影响发现活性多糖的关键关键: : 分离纯化

11、方法及检测手段分离纯化方法及检测手段, , 多糖是水溶性大多糖是水溶性大分子物质分子物质, ,它的分离纯化方法它的分离纯化方法不同于一般小分子物不同于一般小分子物质质, ,而且常用的而且常用的检测手段又不灵敏检测手段又不灵敏, ,所以常会将微量所以常会将微量高活性成份的多糖高活性成份的多糖作为杂质而丢弃作为杂质而丢弃. . 结构改造结构改造及及结构修饰结构修饰-结构改造或结构修饰可以提高或改变多结构改造或结构修饰可以提高或改变多糖的活性糖的活性. .如如 具有抗肿瘤作用但无抗爱滋病毒作具有抗肿瘤作用但无抗爱滋病毒作用的用的香菇多糖香菇多糖, ,如分子中引入如分子中引入 硫酸基硫酸基 后后, ,

12、则几乎不再具抗肿瘤作用则几乎不再具抗肿瘤作用, ,却具显著抗爱却具显著抗爱滋病毒作用滋病毒作用. . 同样结构修饰或改造也可以改变给同样结构修饰或改造也可以改变给药途径药途径, ,如高等真菌产生的具提高兔疫功如高等真菌产生的具提高兔疫功能的能的-葡聚糖葡聚糖, ,一般注射有效一般注射有效, ,口服无效口服无效. .但如果连接有少量但如果连接有少量 肽肽 成为多糖肽成为多糖肽, ,或连或连接一些其他糖残基成为杂多糖接一些其他糖残基成为杂多糖, ,则口服有则口服有效效. . 这是制作真菌来源的保健品中值得注意这是制作真菌来源的保健品中值得注意的问题的问题. .却被许多人疏忽却被许多人疏忽. .譬如

13、说市场上已有的譬如说市场上已有的香菇多糖保健品香菇多糖保健品, ,实质上香菇多糖实质上香菇多糖(Lentinan)(Lentinan)口服是口服是无效无效的的, ,那么为什么这些保健品确实还那么为什么这些保健品确实还是对人体有良好作用呢是对人体有良好作用呢? ? 这是因为香菇提取物这是因为香菇提取物中不仅存在香菇多糖中不仅存在香菇多糖, , 还存在其他对人体有效还存在其他对人体有效的活性物质的活性物质, ,而真正起作用的就是这些活性物而真正起作用的就是这些活性物质质, ,可以这么说保健品中香菇多糖含量越高可以这么说保健品中香菇多糖含量越高, ,其其效果越差效果越差. .所以如果将香菇提取物命名

14、为香菇所以如果将香菇提取物命名为香菇多糖保健品是不恰当的多糖保健品是不恰当的. . 目前对于多糖进行目前对于多糖进行结构改造结构改造或或修饰修饰常用的方法常用的方法: :过碘酸盐氧化过碘酸盐氧化 SmithSmith降解降解 部分水解部分水解 衍生化衍生化 硫酸化硫酸化, ,羧甲基化羧甲基化, ,羧乙基化羧乙基化, ,磷酸化磷酸化, ,棕榈酰化棕榈酰化 多糖的多糖的羧甲基化羧甲基化可以提高多糖的水溶可以提高多糖的水溶性性, ,一般水溶性提高其抗肿瘤活性也提高一般水溶性提高其抗肿瘤活性也提高 多糖中引入多糖中引入硫酸基硫酸基一般均可显著提高一般均可显著提高其抗爱滋病毒的活性其抗爱滋病毒的活性,

15、,且其活性随主链中的且其活性随主链中的氨基糖及分枝度的增加而增加氨基糖及分枝度的增加而增加, ,但随主链中但随主链中去氧已糖及分枝度的增加而减少去氧已糖及分枝度的增加而减少 从从高等真菌高等真菌中获得的中获得的-葡聚糖葡聚糖大多具明大多具明显的免疫活性显的免疫活性, ,但它们在消化道内难以被肠道但它们在消化道内难以被肠道壁直接吸收而进入血液壁直接吸收而进入血液, ,所以必须通过注射才所以必须通过注射才能发挥作用能发挥作用. .如果进行结构修饰如果进行结构修饰, ,使其能被消使其能被消化道吸收化道吸收, ,变注射为口服变注射为口服, ,则将大大简化给药则将大大简化给药途径途径. . 从从植物植物

16、及及海藻海藻中获得的活性多糖一般是中获得的活性多糖一般是杂多糖杂多糖-它们大多口服也有效它们大多口服也有效. .-植物及海藻来源的活性多糖可以植物及海藻来源的活性多糖可以作为保健品的优越之处作为保健品的优越之处 多糖是亲水性大分子多糖是亲水性大分子, ,难以透过由脂质难以透过由脂质构成的细胞膜构成的细胞膜, ,所以口服有效常受到质疑所以口服有效常受到质疑. .有人认为多糖主要与肠道细胞表面的相应有人认为多糖主要与肠道细胞表面的相应受体分子起作用受体分子起作用, ,或者通过胞饮内吞作用或者通过胞饮内吞作用(pinocytosis)(pinocytosis)由消化道进入血液由消化道进入血液, ,然

17、后刺然后刺激人体免疫细胞的成熟激人体免疫细胞的成熟, ,分化和繁殖分化和繁殖, ,诱导诱导专一性细胞因子的产生与激活专一性细胞因子的产生与激活( (所谓多糖是所谓多糖是多细胞因子诱导剂多细胞因子诱导剂),),结果由这些免疫细胞结果由这些免疫细胞去吞噬或杀死肿瘤细胞或阻断细菌去吞噬或杀死肿瘤细胞或阻断细菌, ,病毒的病毒的吸附或繁殖吸附或繁殖. . 有人认为有人认为-葡聚糖是一种葡聚糖是一种融合诱融合诱导导剂剂, ,它能诱导免疫细胞与肿瘤细胞的它能诱导免疫细胞与肿瘤细胞的融合融合, ,从而使肿瘤细胞消失从而使肿瘤细胞消失. .上述这些上述这些作用机制的理论有的虽被初步实验证作用机制的理论有的虽被

18、初步实验证实实, ,有的却是推测有的却是推测, ,有待人们去进一步有待人们去进一步完善完善. . 由此可见由此可见, ,至今活性多糖的研究至今活性多糖的研究尚属初级阶段尚属初级阶段. .多糖的应用可分为两个方面多糖的应用可分为两个方面一类是利用多糖的独特理化性质，一类是利用多糖的独特理化性质，如易形成凝胶、高渗透压、高粘度和吸如易形成凝胶、高渗透压、高粘度和吸水性，制备医药材料、药物缓释剂、血水性，制备医药材料、药物缓释剂、血浆代用品等浆代用品等另一类利用多糖的抗原性、抗肿瘤、另一类利用多糖的抗原性、抗肿瘤、降血糖、促进免疫功能等生物功能或活降血糖、促进免疫功能等生物功能或活性制备疫苗或新药。

19、性制备疫苗或新药。至今从多糖中寻找至今从多糖中寻找具有抗爱滋病的新药已引起人们很大的具有抗爱滋病的新药已引起人们很大的兴趣。兴趣。 美国学者美国学者M.YalpaniM.Yalpani认为认为: :“至今多糖在生物技术领域仍是一个至今多糖在生物技术领域仍是一个沉睡的巨人沉睡的巨人, ,有待于大家去唤醒有待于大家去唤醒.”.”可以预言可以预言: : 活性多糖的研究与开发将成为生命活性多糖的研究与开发将成为生命科学中的重要课题科学中的重要课题. . 多糖多糖多糖是由十个以上单糖通过糖苷键以共价键形式多糖是由十个以上单糖通过糖苷键以共价键形式结合起来的聚糖结合起来的聚糖（Polysaccharide

20、或或glycan）可用可用(C6H10O5)n表示，其中表示，其中n10自然界很少存在自然界很少存在n为为10-30的多糖的多糖匀多糖匀多糖只有一种类型的单糖组成的多糖只有一种类型的单糖组成的多糖杂多糖杂多糖几种类型的单糖组成的多糖几种类型的单糖组成的多糖 表表1记录了来自天然界的一些重要多糖。记录了来自天然界的一些重要多糖。天然界存在的单糖种类很多天然界存在的单糖种类很多,但组成多糖的单糖大致由表但组成多糖的单糖大致由表2 所示的一些单糖组成。所示的一些单糖组成。取代线状型取代线状型直线型直线型分枝型分枝型环状型环状型多糖结构多糖结构 表1. 几种天然存在的多糖 表表2. 构成多糖的通常的单

21、糖构成多糖的通常的单糖 多糖研究与开发的关键多糖研究与开发的关键 多糖多糖均一组分均一组分 深入研究结构分析、构效关系深入研究结构分析、构效关系多糖的多糖的纯度标准纯度标准：不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量多糖纯品微观是不均一的，纯度只代表同一种多糖纯品微观是不均一的，纯度只代表同一种多糖的相似链长的平均配布多糖的相似链长的平均配布 通常符合下列标准即可肯定为均一多糖：通常符合下列标准即可肯定为均一多糖：1.在重复的纯化过程中其单糖的组成及摩尔比恒在重复的纯化过程中其单糖的组成及摩尔比恒定或其它理化性质不变化。如分步沉淀定或其它理化性质不变化。如分步

22、沉淀（如（如30%,50%乙醇沉淀）得到的两组分其乙醇沉淀）得到的两组分其比旋度或单糖摩尔比不变。比旋度或单糖摩尔比不变。2.超离心后，具有相同沉降速率，即具有一个对超离心后，具有相同沉降速率，即具有一个对称峰。称峰。3.高效凝胶层析（高效凝胶层析（HPGPC）得到的一个对称）得到的一个对称峰峰 。 HPGPC目前检测多糖均一性最常用也是误差最小的一种目前检测多糖均一性最常用也是误差最小的一种方法方法多糖专用柱多糖专用柱（不是通常的反相柱及氨基柱）（不是通常的反相柱及氨基柱）检测仪（示差检测器或激光光散射仪）检测仪（示差检测器或激光光散射仪）过去常用常压凝胶层析过去常用常压凝胶层析/分步收集分

23、步收集/硫酸硫酸-苯酚法苯酚法检测检测误差很大。误差很大。一一.多糖的分离提取方法多糖的分离提取方法通过分离纯化不使原有的多糖性质改变通过分离纯化不使原有的多糖性质改变（如结构改变、降解等）。（如结构改变、降解等）。存在于动植物细胞壁外存在于动植物细胞壁外胞外多糖胞外多糖存在于细胞壁内存在于细胞壁内胞内多糖（大多数多糖）胞内多糖（大多数多糖）超声波气流粉碎技术超声波气流粉碎技术将动植物或真菌孢子的细胞壁破裂，大大提高了将动植物或真菌孢子的细胞壁破裂，大大提高了多糖的提取效率多糖的提取效率动植物的细胞大多由脂质包围，用机械粉碎后还动植物的细胞大多由脂质包围，用机械粉碎后还必须脱脂（沙氏提取器，乙

24、醇回流）必须脱脂（沙氏提取器，乙醇回流）脱脂后就可以进行提取脱脂后就可以进行提取第一步第一步动植物体的粉碎动植物体的粉碎A. 热水提取法热水提取法：根据大多数多糖在热水中溶解度较大且稳根据大多数多糖在热水中溶解度较大且稳定的性质进行提取定的性质进行提取这种方法提取多糖这种方法提取多糖的破坏最小。的破坏最小。即经过上述方法处理过的植物用沸水提取即经过上述方法处理过的植物用沸水提取2-6小时。提取小时。提取液如粘度不大，则可采用过滤法过滤去残渣，对于粘度大液如粘度不大，则可采用过滤法过滤去残渣，对于粘度大的提取液则必须采用离心法去残渣，即得到多糖提取液或的提取液则必须采用离心法去残渣，即得到多糖提

25、取液或上清液。有时可在热水中加入上清液。有时可在热水中加入2-10%尿素，使多糖的构型尿素，使多糖的构型改变（这种改变是可逆的），粘度降低，增加其在热水中改变（这种改变是可逆的），粘度降低，增加其在热水中的溶解度。的溶解度。 多糖的提取常用四种方法：多糖的提取常用四种方法：B. 稀碱水溶液提取法稀碱水溶液提取法：酸性多糖或分子量较大的多糖在热水中溶解酸性多糖或分子量较大的多糖在热水中溶解度不大，所以常用度不大，所以常用5-15% NaOH或或Na2CO3水水溶液提取。溶液提取。不过用稀碱溶液提取时，温度必须保持在不过用稀碱溶液提取时，温度必须保持在10以下，以下，否则多糖容易发生降解反应。通常在冷却的条件下否则多糖容易发生降解反应。通常在冷却的条件下（4），放置），放置6-8小时，然后过滤或离心，滤液用小时，然后过滤或离心，滤液用稀盐酸调节稀盐酸调节pH至中性即得碱性多糖提