实验七亲和层析纯化和SDSPAGE鉴定目蛋白质学习教案

1、会计学1实验七亲和层析纯化实验七亲和层析纯化(chn hu)和和SDSPAGE鉴定目蛋白质鉴定目蛋白质第一页，共38页。第1页/共38页第二页，共38页。第2页/共38页第三页，共38页。外源凝集素外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞多糖、糖蛋白、细胞表面受体表面受体核酸核酸-互补序列（互补序列（Oligo-dT）第3页/共38页第四页，共38页。亲和层析原理亲和层析原理(yunl)(yunl)第4页/共38页第五页，共38页。第5页/共38页第六页，共38页。第6页/共38页第七页，共38页。第7页/共38页第八页，共38页。第8页/共38页第九页，共38页。第9页/共38页第十页，共38页。第1

2、0页/共38页第十一页，共38页。第11页/共38页第十二页，共38页。n每组取每组取3-5 mL上清上清(shn qn)液，上柱纯化。液，上柱纯化。第12页/共38页第十三页，共38页。于于 GSH-Sepharose 4B 第13页/共38页第十四页，共38页。第14页/共38页第十五页，共38页。 1-3号分别加入号分别加入20 uL 5上上样缓冲液，混匀后在沸水中样缓冲液，混匀后在沸水中加热加热3 min。第15页/共38页第十六页，共38页。 1 2 3 M 1 2 3 M 样品加样品加30 uL30 uLMarkerMarker加加10 uL10 uL第16页/共38页第十七页，共

3、38页。加水定容到加水定容到5000 mL。第17页/共38页第十八页，共38页。0.15366 g50 mL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。）中。第18页/共38页第十九页，共38页。第19页/共38页第二十页，共38页。第20页/共38页第二十一页，共38页。n logMW=K-bm实验实验(shyn)(shyn)原理原理第21页/共38页第二十二页，共38页。第22页/共38页第二十三页，共38页。第23页/共38页第二十四页，共38页。1. 凝胶孔径的不连续性（凝胶孔径的不连续性（2种孔径）种孔径）2. 缓冲液离子成分及缓冲液离子成分及pH值的不连续性（值的不连续性（

4、2种缓种缓冲体系，冲体系，3种种pH）：浓缩）：浓缩(nn su)胶，胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比，蛋白质分子的迁移率比Cl- 低，比低，比Gly高。高。浓缩浓缩(nn su)(nn su)效应效应第24页/共38页第二十五页，共38页。3. 电位梯度不连续性：快离子（电位梯度不连续性：快离子（ Cl- ）后面）后面形成高电位梯度区，慢离子（形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方间的地方(dfng)，形成一个稳定而不断向阳，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成极移动

5、的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。一个狭小的中间层。浓缩浓缩(nn su)(nn su)效应效应第25页/共38页第二十六页，共38页。第26页/共38页第二十七页，共38页。试剂名称试剂名称加液量加液量ddH2O2.5 mL30% Acr-Bis（29:1）3.0 mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）2.0 mL10% SDS75 uLTEMED（加速剂）（加速剂）10 uL10% AP（催化剂，最后加）（催化剂，最后加）75 uL总体积总体积7.5 mL第27页/共38页第二十八页，共38页。试剂名称试剂名称加液量加液量ddH2O3.4 mL30% Acr

6、-Bis（29:1）0.86mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50 uLTEMED20 uL10%AP（最后加）（最后加）50 uL总体积总体积5.0 mL第28页/共38页第二十九页，共38页。第29页/共38页第三十页，共38页。10. 观察胶中的蛋白质条带。观察胶中的蛋白质条带。第30页/共38页第三十一页，共38页。 纯化纯化(chn hu)(chn hu)前前 纯化纯化(chn (chn hu)hu)后后 Marker Marker第31页/共38页第三十二页，共38页。第32页/共38页第三十三页，共38页。作横坐标，做标准曲线。根据目作横坐标，做标准曲线。根据目的蛋白的迁移率以及标准曲线，的蛋白的迁移率以及标准曲线，可以计算相对可以计算相对(xingdu)分子量。分子量。第33页/共38页第三十四页，共38页。蒸馏水，用蒸馏水，用1.0 mol/L HCl调节调节pH到到8.8，用蒸馏水稀释到，用蒸馏水稀释到100 mL。第34页/共38页第三十五页，共38页。5. 10 %（W/V）过硫酸铵（现用现）过硫酸铵（现用现配）配）第35页/共38页第三十六页，共38页。uL上样缓冲液。上样缓冲液。第3