麻纺韧皮纤维脱胶用碱性果胶酶的制备及表征

1、麻纺韧皮纤维脱胶用碱性果胶酶的制备及表征Preparation and Characterization of Pectate Lyase for Bast-fibre Degumming摘要：麻类纤维作为一种高档的天然纤维素纤维，有其他纤维难以比拟的优势：质地轻、强力大、防虫防霉、静电少、吸湿散湿、透气舒适、具有完全的生物降解性。在众多的纺织纤维中，麻类纤维是极具发展潜力的绿色环保纤维。然而，作为麻类纤维原料的原麻中含有大量的胶质，如果胶、半纤维素、木质素和蜡脂质等，不能直接用于纺纱工艺，必须经脱胶处理才能进行后续加工。目前，常用化学方法进行脱胶，但化学脱胶工艺过程不仅消耗大量的化工原料和能

2、源，增加生产成本，造成严重的环境污染，而且化学试剂还损伤纤维结构，使麻类纤维更加粗糙，可纺性降低。生物技术的发展为改变落后的脱胶工艺提供了契机。以生物酶为基础的生物脱胶方法能够克服化学脱胶的诸多缺点，工艺过程快速高效、低能耗、无污染，更为重要的是，具有底物专一性的生物酶能够最大程度地保留麻类纤维的原有品质。本课题一方面分离纯化了实验室筛选的Bacillus subtilis A5发酵液中的碱性果胶酶；另一方面利用分子生物学方法，获得了Bacillus subtilis A5在麻类脱胶过程中发挥重要作用的碱性果胶酶基因(pel)，进一步构建基因工程菌以表达可高度纯化的重组碱性果胶酶。最后对所获得

3、的两种酶进行酶学性质及脱胶效果的比较研究。主要研究内容结果如下：1、从中国湖南腐烂苎麻上筛选得到的Bacillus subtilis A5是一种能产生具有脱胶活性的碱性果胶酶的微生物。其发酵液经硫酸铵盐析分级沉淀、透析、离子交换层析、交联葡聚糖凝胶层析纯化，得到分子量约为45kD的碱性果胶酶。比酶活为5284.43 U/mg，整个纯化过程酶活回收率为4.24%，纯化倍数为6.05倍。酶最适反应温度为50，最适pH为9.6，较能够耐受高温和碱性环境。Ca2+对其有一定的激活作用。Co2+，Ba2+和EDTA对其有强的抑制作用。 2、根据GenBank上Bacillus subtilis 编码碱性

4、果胶酶（pectate lyase）的基因(pel)序列，设计合成一对引物，以Bacillus subtilis A5基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增得到1260bp的DNA片段。序列测定表明，Bacillus subtilis A5的pel基因序列与GenBank: X74880.1序列相比存在9处碱基差异，同源性为99.3%。经过氨基酸密码子翻译后，除去氨基酸密码子同义突变处，共有2处突变，氨基酸序列同源性为99.5% 。Bacillus subtilis A5的pel氨基酸序列与文献中所报道的pel活性位点（钙离子结合位点）以及邻近钙离子的保守氨基酸均为一致。将PCR扩增获得的pe

5、l片段通过T载体连接，构建克隆质粒pMD-pel，转化大肠杆菌DH5，获得重组转化子。双酶切克隆质粒pMD-pel，得到具有SalI和NotI酶切位点的粘性末端片段pel。通过定向克隆技术，将表达载体pET-28a-c(+)和粘性末端片段pel进行T4连接反应，构建表达质粒pET-pel，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，筛选后获得表达宿主菌株。3、利用含表达质粒pET-pel的大肠杆菌BL21 (DE3)宿主进行诱导表达，产物经Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和纯化及稀释复性，得到分子量约为49kDa的重组果胶酶。比酶活为873.45 U/mg，获得的酶总量较大（3.6L发

6、酵液中至少含4.4mg酶蛋白），纯度很高。酶最适温度为55，最适pH为9.6。与Bacillus subtilis A5所产酶相比，重组果胶酶的耐高温程度及耐碱性均有所提高。Ca2+同样对其有激活作用，Ba2+对其有强的抑制作用 。4、利用实验制备的两种酶在最适条件进行脱胶效果测定，通过立体显微镜、光学显微镜观察，酶处理后的苎麻表面胶质基本去除，纤维分散程度好。Bacillus subtilis A5产果胶酶和重组果胶酶脱胶效果相差不大。由扫描电子显微镜观察，未经酶处理的原麻表面凹凸不平，有大量片状胶质，经过酶处理后的纤维成分散状，脱胶效果较好，纤维表面仅存在少许颗粒残余，Bacillus s

7、ubtilis A5产果胶酶与重组果胶酶相比脱胶效果较好，表面更光滑。本课题从野生菌发酵产物的分离纯化和基因工程菌的构建表达两方面对碱性果胶酶进行制备，并研究了所获得的两种酶的酶学性质及脱胶效果的比较。奠定了进一步研发高效脱胶酶制剂的基础，为麻纺纤维原料的绿色加工提供理论和技术支撑。关键词：碱性果胶酶，生物脱胶，分离纯化，克隆表达，酶学性质。Key words: Pectate lyase,bio-degumming,Isolation and purification, Clone and expression, Property of enzyme.第一章 前言11 麻类纺织品及麻纺纤维麻

8、类纺织品被誉为绿色高档纺织品，这种功能性纺织绿色产品以其天然的本质和独特的功能，在注重高品质、个性化、时尚化、舒适性、健康环保的当代纺织品消费观念的影响下备受青睐。同时，麻类纤维还是产业用的优质材料，可制作植物培育垫、高速传送带、过滤材料、医用纺织品、非木材纸、复合板材等。麻纺纤维是从各种麻类植物取得的纤维。其同棉纤维相同都属于天然纤维，所不同的是麻纤维除主要成分为纤维素外，其非纤维素成分含量高，这些非纤维素成分统称为胶质。胶质内含有半纤维素、果胶、木质素、水溶物、脂蜡质、灰分等几种物质1。纺织用麻纤维即是指从原麻中脱去部分或全部胶质而分离出的纤维。在植物学上麻纤维分为韧皮纤维和叶纤维两大类2

9、：韧皮纤维是指从双子叶植物的茎杆韧皮部分剥取的纤维。这种纤维一般较为柔软，也称“软质纤维”。苎麻、亚麻、黄麻、洋麻、大麻、苘麻及罗布麻均属于这类纤维。叶纤维是指从单子叶植物的叶梢部得到的纤维。这种纤维一般较为粗硬，故亦称“硬质纤维”。剑麻、西沙尔麻、蕉麻、马尼拉麻、菠萝麻均属于这类纤维。韧皮纤维中的苎麻、亚麻是优良的麻种，其纤维木质化程度低，强度高，伸长小，柔软细长，可纺性能好，用它们织成的织物挺括，吸汗，不贴身，透气，凉爽，是织造夏季衣料的良好材料。黄麻、大麻、洋麻等纤维较粗，且短，适宜于包装材料：麻袋、麻绳等。叶纤维中剑麻和蕉麻在经济上较有实用价值，因纤维细胞壁木质化程度高，长度较长，伸长

10、小，强度好，耐腐蚀，耐海水浸泡，常用于做航船和矿井用的绳缆，也可编粗麻袋或包装用布。（软质纤维和硬质纤维在制备麻纺织物时有何区别？）麻类韧皮纤维开发的功能性麻纺织品不仅是符合绿色消费的环保产品，而且已被公认为是一种典型的原料型保健纺织品。具有纤维长、强度高；透气性好，传热快，吸水多而散湿快；纤维强力大而延伸度小；不容易受霉菌腐蚀和虫蛀等特点。12中国麻纺织业概况我国是世界上麻类资源最丰富的国家，有亚麻、剑麻、大麻、罗布麻、苎麻，在品种、质量和数量上都占有明显的优势。我国的原麻种植、纺织加工和技术开发等均处于世界先进水平。我国的麻纺织工业具有完整的生产体系和相当的规模，是世界麻纺织大国，苎麻纺织

11、、亚麻纺织的生产和贸易居世界首位。主要麻纺织品产销量，麻纱线、织物、制成品及服装出口持续增长3。中国近几年来我国政治、经济良性发展，促进了我国麻纺织行业的发展。在国家的“十一五”发展纲要中，提到了“加快非棉类织纺织资源的开发和利用”这一条，尤其是提到了加快麻纺织品发展的相关问题。国内棉花的原料缺口以及化纤原料居高不下的进口依存度所构成的“结构性矛盾”为麻纺产业的发展提供了空间。而我国麻类纤维资源非常丰富，因此，大力发展麻类纤维原料、加快麻产业的发展、对于改善纺织天然纤维原料结构具有积极意义。另一方面，麻作为天然纤维的高舒适性并深受人民群众喜爱等一系列优势也使整个行业的发展具备潜力。然而，“绿色

12、环保”是21世纪社会发展的一大标志，麻类纤维属于生态纤维，但麻纺织加工尚未达到生态标准，麻类脱胶生产中的废水污染等问题仍普遍存在，并急需解决。要使麻类纺织品成为真正的生态纺织品，麻类脱胶污染是当前我国麻纺织行业攻关的方向，也是我们迎接新世纪经济竞争的重要手段。因此，对于有着生态特征的麻纺产业，把排污和清洁生产做好对促进行业的健康发展，提高竞争力，加速产业升级有着十分重要的意义。（请增加原麻解剖结构和化学组成方面的内容！）13 原麻的脱胶及其方法半纤维素、果胶物质和木质素等杂质包围在纤维的外表，使纤维胶结在一起而呈坚固的片条状物质，即原麻。干燥后的原麻含有60-70%纤维素和30-35%非纤维素

13、的胶质成份。这些胶质都是高分子化合物，多半是多聚糖类碳水化合物，少量为芳香族化合物。主要含有半纤维素、果胶质、木质素、水溶物、脂蜡质、灰分等。其中果胶质、半纤维素、木质素是主要成分。原麻是不能直接用来纺纱的，在纺纱之前必须将韧皮中的胶质去除，并使麻单纤维相互分离，这一过程就称“脱胶”。 一般有如下方法：131 天然水沤麻微生物脱胶法将砍下来的麻株或剥下来的麻皮就地浸泡于天然水域中进行微生物厌氧发酵脱胶，利用水中各种微生物的联合作用将高分子化合物的胶质分解成为小分子的化合物，从而将纤维素提取出来的方法。天然水沤麻脱胶中所用菌种都是自然界中天然存在的，不需另外单独培养，脱胶过程主要是厌氧性微生物在

14、起作用。这种方法主要有以下缺点：需要大量的水，因此限制了麻在缺水地区的加工；受季节、气候的影响很大，产量、质量不稳定；脱胶时间太长；会对农村水域造成严重污染。132 化学脱胶法该方法为麻脱胶所采用的主要方法。它是利用麻中的胶质和纤维素对酸、碱、氧化物的作用性质不同通过煮练水洗等化学、物理机械手段使胶质与纤维分离。化学脱胶法分为高温高压和常温常压两大类，视原麻品质和纺纱工艺的不同要求采取不同的脱胶工艺，高温高压煮练，脱胶速度快，胶质去除多，精干麻品质较好，但是纤维制成率较低，制成的工艺纤维长度较短。常温常压煮练，脱胶速度慢，胶质去除较少，精干麻纤维分离度较差，纤维制成率较高，但制成的工艺纤维长度

15、较长。目前国内外苎麻脱胶广泛采用以烧碱煮炼为中心的化学脱胶方法4-9，即“浸酸、二煮”的老工艺。流程如下：扎把装笼水解处理水洗煮练(I) 水洗煮练(II) 水洗打纤漂酸洗脱水抖松装笼给油脱油抖松烘干。“浸酸、二煮”是指韧皮经酸浸泡后，在碱液中煮两次制得其纤维(精干麻)的工艺过程。这个老工艺存在流程长、工序多、手工操作多、劳动强度大、脱胶工艺时间长、能耗高、脱胶质量影响织物外观等问题，不能适应高档、高支织物纺织的需要。133 微生物脱胶法10微生物脱胶是把经过筛选的脱胶菌进行扩大培养后接种到麻上，在适宜环境条件下，培育针对麻的高效专用脱胶细菌来分解胶质，而保留纤维素成分。以麻上的胶质为营养源，让

16、脱胶菌在麻上大量繁殖，在脱胶菌繁殖过程中，分泌出酶物质来分解胶质，使高分子量的果胶及半纤维素等大分子分解成低分子物质而溶于水中，最后实现纤维的相互分离，即在缓和的条件下进行的一系列“胶养菌，菌产酶，酶脱胶”的生化反应。134 酶法脱胶11，12酶法脱胶就是将脱胶菌培养到菌生长的衰老期后进行过滤或离心等处理，再用得到的粗酶液浸渍原麻，也可将粗酶液提纯，浓缩为液剂，或者将该浓缩液干燥成为粉剂。使用时将液剂稀释或将粉剂溶于水，把原麻浸渍在酶稀释液中进行酶解脱胶。酶法脱胶研究较晚，主要面向苎麻、亚麻、红麻、黄麻等。酶法脱胶工艺无需专用设备，快速高效，无污染，生产的精干麻质量好。但就目前来说，产酶菌种或

17、酶制剂的酶活力太低，酶制剂价格过高，导致脱胶成本过高。135 生物化学联合脱胶法13随着生物技术的发展，出现了对麻进行预微生物或酶处理的生物与化学相结合的脱胶方法，使麻类的脱胶研究取得了一定的突破。生物化学联合脱胶就是将经过微生物脱胶法或酶制剂脱胶法处理后的脱胶麻再用化学脱胶法处理一次，以提高纤维质量。我国苎麻脱胶几十年来一直沿用化学方法，虽然在脱胶工艺和助剂方面作了许多改进，但是没有脱离化学脱胶的范畴。传统的化学脱胶利用原麻中纤维素和胶质成分对碱、无机酸和氧化剂作用稳定性的不同，以去除原麻中的胶质成分，而保留纤维素成分。该脱胶方法不仅消耗大量的碱、酸等化工原料和能源，增加了生产成本，而且化学

18、脱胶废水造成严重的环境污染，国内还没有一家麻纺厂治理脱胶废水已经完全过关。其次，化学脱胶破坏了麻纤维的结构，使麻纤维更加粗糙，可纺性差、制成率低。当今世界高新技术迅速发展，生物技术己经渗透到各个行业，利用生物技术进行苎麻脱胶不但可以节约大量的化工原料和能源，降低生产成本，而且可以大大减轻脱胶废水造成的污染，还可以提高苎麻纤维的可纺性，应用生物技术将彻底改变苎麻脱胶的落后面貌。因此，发展生物脱胶是麻纺行业可持续发展的保证。为了解决麻纺纤维化学脱胶工艺存在的成本高、污染严重等难题，国内外许多科技工作者已经在生物脱胶方面进行了多年的探索。总体来说这类探索目前仅局限于实验室中或停留在中间试验阶段，至今

19、还没有在工业生产中大量的推广应用。14 果胶质及果胶酶141 果胶质果胶质是由不同酯化度的半乳糖醛酸以-1,4糖苷键聚合而成的多糖链，常具由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链14。它存在于植物细胞壁和细胞间层中，为细胞的支撑物质，使两个相邻细胞结合在一起。根据果胶质分子酯化度不同，果胶质可分为三类1：(1)果胶酸（PGA）：是由D-半乳糖醛酸脱水缩合，以-1,4糖苷键连接形成的直链状半乳糖醛酸聚合物。(2)果胶（PMGA）：是由鼠李糖与多个PGA连结成的鼠李糖-半乳糖醛酸聚糖为主链，由D-半乳糖、L-阿拉伯糖及木糖等分别组成长短不同的侧链的多支链分子。酯化程度不高，可以

20、是胶体或具有溶解性。(3)原果胶（Protopectin）：果胶分子与细胞壁的其他糖类组分、多价金属离子、蛋白质分子等连接在一起的大分子物质。在天然植物中，果胶质的分子结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同2。麻类植物中果胶质的主要成分为果胶酸及其衍生物，主要有果胶酸的钙、镁盐及果胶酸甲酯。果胶质与其他胶杂质如半纤维素、木质素等大分子之间具有广泛的联系，相互间形成具网络体系的复合体结构，将麻纤维一根根地粘连在一起，形成纤维束，这些纤维束又进而粘在一起形成厚厚的韧皮部。麻类脱胶的目的就是要破坏韧皮部纤维束与周围组织的粘结程度，使果胶大分子链断裂，进而使胶杂质复合体结构松散，提高胶杂质

21、在水中的溶解度，以达到彻底去除的目的。麻类在进行纺织前，必须把果胶类物质处理掉，以便能进行后续加工，而果胶酶能够满足这些工艺的要求。同时也对麻的质量也有所提高，使得果胶酶在纺织行业中得到广泛的应用（是否可删掉这一段？应该重点谈果胶酶，特别是微生物产生的果胶酶。）。142 果胶酶几十年来人们根据经验及大量的试验，筛选出了一系列的高效脱胶菌株，如： Erwinia sp 15, Rhizomucor pusillu 16, Bacillus sp. MG-cp-2 17, Bacillus No. P-4-N18 等，应用范围几乎包括所有主要麻类。虽然属于不同的种属，脱胶作用基本上都是利用它们所产

22、生的果胶酶来实现的，所以人们将果胶酶作为脱胶的关键酶及衡量标准。通常情况下，果胶酶一般可分为以下三种类型：(1)原果胶酶(Protopectinase，PPase)，能将不溶性原果胶有限地水解为水溶性果胶（如糖醛酸的甲酯）和切断聚甲氧基半乳糖醛和阿拉伯糖之间的化学键。(2)果胶酯酶(Pectinesterase，PE)，能随机切除甲酯化果胶中的甲氧基团，形成果胶酸。(3)果胶解聚酶(Depolymerizing enzymes)，能够降解果胶糖苷键。按作用类型又可细分为果胶水解酶(hydrolyzing glycosidic linkages)和果胶裂解酶(cleaving glycosidi

23、c linkages)。其中，果胶水解酶的作用是水解果胶糖苷键，包括聚半乳糖醛酸酶(polygalacluronases，PG)和聚甲基半乳糖醛酸酶(polymethyl-galacturoases，PMG)；果胶裂解酶的作用是通过消除反应使糖苷键断裂，该酶攻击底物的糖苷键在邻近羧基或酯化的羧基一边发生消除，包括聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonate lyases，PGL)和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(polymelhyl- galacturonate lyases，PMGL)。果胶水解酶和果胶裂解酶均有内切酶(endo-)和外切酶(exo-)之分。 产果胶酶的真菌主要有曲霉属(A

24、spergillus)，青霉属(Penicillium)，盾壳霉属(Coniothyrium)，镰孢属(Fusarium)，克鲁维氏酵母(Kluyveromyoes)等。产果胶酶的细菌主要有假单胞杆菌属(Pseudomonas)，黄单胞杆菌属(Xanthomonas)，欧文杆菌属(Erwinia)，芽胞杆菌属(Bacillus)，梭菌属(Clostridium)。由于真菌中的黑曲霉（Aspergillus niger）属于公认安全级(GRAS,General Regarded As Safe)，其代谢产物是安全的，因此目前市售的食品级果胶酶主要来源于黑曲霉，最适pH值一般在酸性范围19。而最适

25、合用于麻类脱胶碱性环境的碱性果胶酶通常指内切聚半乳糖醛酸裂解酶(endo- PGL)（EC4.2.2.2）20，其最适pH在8-10。这类酶能够随机裂解果胶酸的-1,4糖苷键，将多聚半乳糖醛酸降解为半乳糖醛酸产物（图1）。用碱性果胶酶处理，代替碱对棉、麻等织物进行煮练加工和整理工艺，以去除初生胞壁中的果胶物质，在比较缓和的pH值和温度条件下使处理后的织物手感柔软，强度高，取代了耗能大、污染严重的传统热碱脱胶工艺另外，可避免因微生物处理造成的纤维素的降解18,21。图1 内切聚半乳糖醛酸裂解酶（EC4.2.2.2）作用模型近年来，人们筛选发现了许多来源于微生物的碱性果胶酶如Aspergillus

26、 flavus 22 、Acrophialophora nainiana23 、Bacillus pumilus BK224等。果胶酶除了在纺织工业中有重要应用外，在造纸25、食品加工26、饲料加工27、植物抗病28、治疗胃石29等方面都有重大的应用价值。1.5碱性果胶酶的分离纯化现有的酶的分离纯化方法都是以酶与其它蛋自在理化性质、稳定性上的差异以及酶的生物特性为依据而建立起来的30,31，包括：(1)根据溶解度不同，有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法、液-液分离法以及结晶法等。(2)根据分子大小的差别，有凝胶过滤(层析)法、透析、超滤法及超离心法等。(3)根据电学

27、、解离性质，有吸附层析法、离子交换层析法、电泳法以及聚焦层析法、疏水层析法等。(4)基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点而建立的亲和层析法、亲和电泳法、融合蛋白亲和分离法、金属整合层析法、染料配体亲和层析法、共价层析法和免疫吸附层析法等。(5)利用稳定性差异而建立的选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法等。(6)高效液相色谱法(HPLC)是近年来层析技术上的一大进展。它是凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析和亲和层析等技术应用上的一个发展新阶段，它以这些层析的原理为基础，但是具有更高的效率、更高的分辨与更快的速度。它已成为蛋白质分离、纯化的有力工具。近年来，国内外对一些微生

28、物来源的碱性果胶酶进行了分离纯化方面的研究。颜涛等32通过丙酮沉淀，阳离子交换层析，凝胶过滤，从苎麻脱胶菌Bacillus subtilis No.16A发酵液中纯化了分子量为30.2KD的聚半乳糖醛酸酶（PGase），该酶最适作用pH为9，最适作用温度为50，在55以下、中性pH(6-8）范围内稳定，Ca2+、Mg2+对该酶有激活作用，Co2+、Hg2+有抑制作用。Kobayashi等33纯化Bacillus sp.KSMP576碱性高分子量外切聚半乳糖醛酸酶，研究了其酶学性质，并得到N端氨基酸序列为：Thr Glu Val Ser Pro Lys Ser Pro Ala Ser Pro V

29、al 。Suryakant等34对Fusarium moniliforme碱性果胶酶进行了分离纯化，并研究了其性质和酶反应动力学参数。Maria等23对Acrophialophora nainiana碱性果胶酶进行了分离纯化，并着重进行了物理化学研究。Barbara等24对Bacillus pumilus BK2碱性果胶酶进行了分离纯化及酶学性质研究，并进行了生物精练试验（实验结果？）。总的来看，碱性果胶酶的分离纯化一般先用沉淀法或超滤法将粗酶液中的杂质大部分去除，减小后续分离纯化步骤的负荷，再用柱层析的方法如离子交换、凝胶过滤等进行较细致的分离纯化，最后用电泳检测酶的纯度和分子量。16 碱性

30、果胶酶的基因表达随着分子生物学技术的不断提高，基因克隆技术已经能够成熟地实现某个基因导入其它宿主细胞中进行表达。近年来，碱性果胶酶的分子生物学研究在不断地深入，己从许多种属微生物中克隆了基因并测序，对其结构、功能、调控等方面进行了深入探讨。Nikaidou 等35克隆并测序了Pseudomonas marginalis N6301 的果胶裂解酶的核酸序列。Hatada等36从Erwinia carotovora 中克隆了果胶酶基因，并在Escherichia coli中进行了表达。Wagner等37克隆了Penicillium sonii的两个PG基因pg1和pg2，它们分别由370和380个

31、氨基酸组成，并研究了对基因pgl和pg2定点破坏后其表达的PG酶活变化。Hatada 等38克隆并测定了一个源于Bacillus的高度适应碱性的果胶酶基因。Berensmeier 等39从Bacillus licheniformis 14A中克隆了一个pelA基因，并对重组蛋白进行了生物化学性质及热稳定性测定。Matsumoto等40在 Escherichia coli中高效表达了来源于Bacillus subtilis的果胶裂解酶融合蛋白，并进行了一步纯化的研究。Nasser等41克隆了 Bacillus subtilis基因，并研究了基因的分子生物学性质。Stephen等42克隆并表达了T

32、reponema pectinovonon ATCC 33768PL的pelA基因，并比较了重组与未重组果胶裂解酶具有相同的性质，比如：最适pH值、酶活对Ca2+的依赖以及酶活被Zn2+所抑制。Jeffrey等43克隆和鉴定了Aspergillus pavasiticus的一种新PG编码基因，利用PCR合成探针从Aparasiticus cDNA文库分离到PG编码基因pecA，并以DNA序列分析和氨基酸序列分析证明其与其他真菌的PG在核酸和氨基酸水平上的相似性。1.7 大肠杆菌表达系统及融合表达1.7.1大肠杆菌基因表达系统目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵

33、母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。对于原核来源的目的基因而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。大肠杆菌表达体系的优越性：全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架；基因克隆表达系统成熟完善，特别是对于基因表达调控的分子机理有深刻的了解；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定、成本低廉，易用于批量生产；被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体。一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达

34、菌株。如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂；融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等。在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体

35、的形式存在于细菌细胞内。包涵体表达形式的优点：在一定程度上保持表达产物的结构稳定；能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集；简化外源基因表达产物的分离操作；包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来；能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原

36、来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低， 一般不超过 30%。复性处理工艺使目标蛋白的制备成本上升。172融合表达随着生物技术的进步，特别是基因工程的迅猛发展，表达蛋白已经变得很容易，相对而言，纯化却是一个非常繁杂的工作，所以越来越多的研究者把需要表达的目标蛋白和亲和纯化用的标签融合表达。生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基

37、质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。所谓标签融合表达，是指表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继亲和纯化步骤。

38、对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。常见的融合标签、纯化用的填料或配基及纯化洗脱方法见表1。标签纯化用的填料或配基纯化洗脱方法多聚组氨酸（6XHis）螯合镍、铜、钴离子填料咪唑或降低 pH谷胱甘肽硫转酶（GST）键合谷胱甘肽亲和填料10-20mM 还原谷胱甘肽麦芽糖结合蛋白（MBP）淀粉琼脂糖凝胶麦芽糖金黄色葡萄球菌蛋白A IgG 琼脂糖凝胶低 pHFlag peptide抗 Flag 抗体 ,M1,M2低 pH 或 EDTA多聚精氨酸（Poly-Arg）SP 琼脂糖凝胶高盐多聚半胱氨酸（Poly-Cys）活化巯基琼脂

39、糖凝胶DTT多聚苯丙氨酸（Poly-Phe）苯基琼脂糖凝胶乙二醇钙调蛋白结合肽钙调蛋白EGTA纤维素结合域纤维素盐酸胍或脲几丁质结合域几丁质巯基乙醇，半胱氨酸表1：常见的融合标签、纯化用的填料或配基及纯化洗脱方法173 His-Tag融合蛋白His-Tag（组氨酸标签）融合蛋白是目前最常见的表达方式，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。固定金属离子亲和色谱（IMAC）是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，利用这个原理可

40、以把富含这类氨基酸的蛋白质吸附，从而达到分离的目的。由于这个原因，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。而组氨酸是与固定化金属离子作用最强的氨基酸,组氨酸的咪唑环作为电子供体容易与固定的金属离子形成配位键.基质材料洗涤之后,可通过调节柱缓冲液的pH使组氨酸充分质子化，或者添加游离咪唑，使组氨酸不再与Ni2+结合，洗脱下含多聚氨基酸序列的肽类。氮川三乙酸镍（nickel-nitrilotriacetic acid，Ni-NTA），是金属亲和层析填料，有4个金属螯合位点，能更牢固定Ni离子，避免其他同类填料容易在清洗过

41、程中因固定不牢离子脱落而造成的产物回收率低等问题。Ni-NTA及其与组氨酸配位键形成见图2。图2 Ni-NTA及其与组氨酸配位键形成金属镍离子被螯合到固相支持物共价结合的反应性基团上，当融合蛋白溶液流经亲和纯化介质时，融合蛋白被特异亲和吸附，杂质被洗掉后再洗脱目标蛋白。组氨酸标记在一般或变性条件（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以分离纯化。18 本课题的研究意义及内容181 本课题的研究意义以生物分离工程的基本原理为依据，为寻找高效环保的生物脱胶方法，从实验室自行筛选的Bacillus subtil

42、is A5发酵液中分离纯化出碱性果胶酶；并通过对野生型高效脱胶菌种进行分子生物学解析，获得在脱胶过程中发挥重要作用的碱性果胶酶基因，在此基础上构建基因工程菌表达可高度纯化的重组碱性果胶酶。以碱性果胶酶的制备为切入点，构建快速高效、无污染的实验室水平酶法脱胶体系，为麻纺纤维原料的绿色加工提供理论和技术支撑。182 本课题的研究内容1）通过盐析、透析、离子交换层析、交联葡聚糖凝胶层析从Bacillus subtilis A5发酵液中分离纯化出碱性果胶酶，并SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化组分。2）通过在NCBI上查找碱性果胶酶基因序列，设计引物，从Bacillus subtilis A5中扩增，

43、进行亚克隆。3）从亚克隆载体上获得碱性果胶酶基因，构建带有His-Tag的融合蛋白，并用亲和层析进行纯化。4）从最适温度、最适pH、温度稳定性、pH稳定性及金属离子的影响等方面对野生菌纯化酶及重组酶进行酶学性质研究。并进行脱胶试验。第2章 Bacillus subtilis A5产碱性果胶酶的分离纯化2.1实验设备、材料和试剂2.1.1 主要仪器设备玻璃仪器：试管，量筒，培养皿，锥形瓶，烧杯，玻璃棒，研钵（所有玻璃仪器出自海门海博）其他实验仪器：主要设备生产厂家4冰箱/-20低温冰箱西门子Themo scientific Forma-86 UTI FreezerThemoWP800 TL23-

44、K3微波炉佛山市顺德区格兰仕微波炉电器EL104电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）托盘天平马头牌JYT-5pHS-J4 PH/mv计上海天达仪器DYY-6B型电泳仪北京六一仪器厂雪花制冰机CommercialQT-1漩涡混合器上海琪特分析仪器WFZ UV2100紫外可见光光度计尤尼柯（上海）仪器隔水式电热恒温培养箱GHP-9080上海齐欣医疗器械DK-8D电热恒温水槽上海森信实验仪器生物洁净工作台博讯实业医疗仪器厂微量加样器Thermo LabSystem（2、20、200、1000、5000l）Thermo LabSystem计时器TIANGEN 公司81-2 恒温磁力搅拌器上海闵行虹浦仪器

45、厂九阳电磁灶山东九阳家电高速台式离心机上海安亭科学仪器厂HITACHI CR21G高速离心机Hitanhi Koki.Co.,Ltd , made in Japan大容量全温振荡培养箱DQHZ-2021 B型太全市华美生化仪器厂YXQ-LS-50SI立式压力蒸汽灭菌锅上海博讯实业医疗设备厂电热恒温鼓风干燥箱黄石市恒丰医疗器械循环水式真空泵于华牌干燥器启东市吕四玻璃厂透析袋（截留分子量25kD）上海生工BioLogicTM LP 系统BIO-RAD离子交换层析柱（26mm600mm）上海锦华交联葡聚糖凝胶层析柱（10mm300mm）上海锦华2.1.2 材料实验用原麻采自夏末秋初，湖南农业大学苎麻

46、研究所麻园，苎麻干燥后，用手轻捻掉其上残留的少量黑皮，剪掉苎麻的较硬的头部和细碎的梢部，只留纤维均一的中间部分用于试验。2.1.3 常用试剂和培养基的配制2.1.3.1 试剂蛋白胨UNIPATH LTD.牛肉膏国药磷酸氢二钾国药硫酸铵BBI无水乙醇上海玻尔硫酸国药氯化钙国药磷酸国药磷酸二氢钾国药亚硫酸钠江苏永华甘氨酸国药氢氧化钠国药D-半乳糖醛酸Sigma 聚半乳糖醛酸Sigma 三羟甲基氨基甲烷（Tris）BBIBSABBI公司氯化钠国药Prestained Protein Molecular Weight MarkerFermentas 丙烯酰胺(Acr)BBI甲叉双丙烯酰胺(Bis)BB

47、I过硫酸铵AMRESCON,N,N,N，一四甲基乙二胺(TEMED)AMRESCO考马斯亮蓝G250上海生工BME(-巯基乙醇)上海捷瑞溴酚蓝Sigma甲醇国药冰乙酸国药2.1.3.2实验用溶液甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L，pH 9.0）：50ml 0.2mol/L甘氨酸+8.8ml0.2mol/L氢氧化钠，加水稀释至200ml。底物聚半乳糖醛酸：在500ml甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L，pH 9.0）中溶解1g聚半乳糖醛酸和24.42g 氯化钙。5G250缓冲液：250mg G250，125ml乙醇，250ml磷酸，加水至500ml。离子交换起始缓冲液：磷酸氢二钠

48、-磷酸二氢钠pH7.0的缓冲液。离子交换洗脱缓冲液：含0.1-1M NaCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠pH7.0的缓冲液。凝胶层析平衡洗脱缓冲液：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠pH7.0的缓冲液。SDS（10%W/V）：20g SDS 溶于dd H2O中，至终体积200ml，溶液应透明无色。室温下溶液数周之内稳定，但遇冷则产生沉淀。分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl, pH8.8）：54.45g Tris +7080mldd H2O溶解，用1N HCl调pH至8.8后，再加水定容至300ml，4贮存。浓缩胶缓冲液（0.5M Tris-HCl, pH6.8）：18g Tris +90mldd H2O

49、溶解，用1N HCl调pH至6.8后，再加水定容至300ml，4贮存。5SDS-PAGE上样缓冲液（0.1M Tris-HCl pH6.8，20%甘油，0.2%溴酚蓝，4%SDS，5% BME）过硫酸铵（10%W/V）：称取0.1g过硫酸铵于1.5ml的Eppendorf离心管中，充分溶解于1ml 灭菌dd H2O中，临用前配制。考马斯亮兰染液：配制 dd H2O：甲醇：冰乙酸=5：5：2 （V : V : V）溶液1200ml；水500ml+甲醇500ml+冰乙酸200ml混合均匀。称取考马斯亮兰R-250 1.2g溶于上述溶液中，配成0.1%浓度。使用前经滤纸除去不溶物质。脱色液：95%乙

50、醇500ml+冰乙酸160ml+水1340ml，混合均匀。5电泳缓冲液：Tris 30g，甘氨酸188g，10%SDS 100ml，加dd H2O定容至2 L ，4贮存。使用前如有沉淀发生，37加热溶解。2.1.3.3 培养液、培养基种子培养液：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g水1000mLpH7.0-7.2苎麻发酵培养基：原麻（2cm小段）5g硫酸铵0.5g磷酸氢二钾0.1g硫酸镁0.05g氯化钾0.05g硫酸亚铁0.001水100mLpH8214 菌种以实验室自行筛选的Bacillus subtilis A5作为产酶菌种。22 实验方法221生长曲线制作及发酵培养2211制备种子液用接种针

51、挑取少量在斜面上保藏的Bacillus subtilis A5菌落，在若干只装有5ml种子培养液的试管中接种。37，200rpm下培养24h。作为种子液备用。2212 接种及生长曲线制作将已活化的种子液接种于苎麻培养基中， 40，pH8，接种量5%，200rpm，培养，四小时取一次样，测定菌浓度、酶活。2213发酵培养根据生长曲线，选择合适条件发酵培养：将已活化的种子液接种至装有400ml苎麻培养基的三角烧瓶中，200rpm，40，pH8，摇床培养48小时。222酶活及蛋白浓度的测定2221碱性果胶酶的酶活测定参照文献44，选用不饱和半乳糖醛酸法测定酶活。1）果胶酶活定义：1个果胶酶活力单位定

52、义为：一定条件下，每分钟由聚半乳糖醛酸释放1mg的D-半乳糖醛酸所需酶量。(U/ml)即：式中：U酶活力单位（U/ml）；G酶解液中还原性醛基含量（mg）；N酶液稀释倍数；V加酶液量（ml）；t酶解时间（h）。2）标准曲线的制作标准D-半乳糖醛酸曲线：取100mg/ml标准D-半乳糖醛酸液各0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5ml补加水至2.0ml, 加0.03mol/L磷酸3ml，在波长为235nm下测定吸光度。,3次重复实验的均值用最小乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程。由光密度值引得D-半乳糖醛酸量，可以用来测定碱性果胶酶活性。3）

53、酶活测定碱性果胶酶酶活的测定：底物为聚半乳糖醛酸（PGA），酶液体积20l，PGA溶液（PGA溶于0.2mol/L pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，其中含有0.44mol/L的氯化钙）浓度为0.2%，用量为2ml，反应温度为45，时间为15min，0.03mol/L磷酸终止剂用量3ml，在波长为235nm下测定吸光度。2222蛋白浓度的测定1）蛋白浓度标准曲线制定BSA储液20g/l序号BSA质量 gBSA体积 l水的体积 l101.1438.9202.2437.8252.75437.25303.3436.7353.85436.15404.4435.6454.95435.05505.543

54、4.5556.05433.95取-各200l，加入4ml G250缓冲液，混匀，2min后，在波长为595nm下测定吸光度。2）蛋白浓度测定方法在小试管中加入4ml G250缓冲液，再加入200l样品，混匀，2min后，在595nm下测量吸光度。223分离纯化2231 盐析将发酵完毕的苎麻培养基发酵液均分至离心管中，配平，8000rpm离心5min，弃去沉淀，将上清液收集至大烧杯中，用0%，10%,20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%饱和度的硫酸铵逐级盐析发酵液，获得盐析曲线。选择最适盐析范围后大量盐析，获得大量目的蛋白。2232透析将盐析后的发酵液装入截留

55、分子量为25kD的透析袋中，在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，4，透析过夜。透析袋的前处理：. 把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段，注意带手套。 . 在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。. 用蒸馏水彻底清洗透析袋。 . 放在1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。 . 冷却后，存放于4摄氏度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时必须戴手套。 . 用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。2233离子交换层析1）剂型的选择：DEAE-52离子交换剂2）膨胀活化：DEAE-52的用量则根据柱

56、容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-52相当于6ml8ml 柱床体积。称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH 溶液中（1g DEAE-52干粉约需15 倍NaOH液），浸泡1h 左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将DEAE-52浸泡于0.5Mol/L HCl 中1h，同样抽滤液至近中性。再将DEAE-52浸于0.5Mol/L NaOH 液中，同样处理，洗至中性。3）上柱条件和洗脱条件的确定：1）上柱PH值的确立：在小离心管中用不同pH（7，7.5，8，8.5，9）的磷酸盐缓冲液洗涤胶体，加入适量透析后酶液，再加入相应缓冲液，每隔五分钟混匀，半小时后测定上清残余酶活。2）洗脱条件的确立用不同NaCl浓度的磷酸盐缓冲液洗脱已上柱的胶