11课件DNA重组技术的基本工具

1、DNA重组技术重组技术的基本工具的基本工具本节学习内容：本节学习内容：1.基因工程的概念基因工程的概念2.基因工程的工具基因工程的工具基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果繁殖方式：繁殖方式：原理：原理：无性繁殖无性繁殖基因重组基因重组打破物种之间的界限（生殖隔离），按打破物种之间的界限（生殖隔离），按人们意愿定向改造生物遗传性状人们意愿定向改造生物遗传性状思考：基因工程相对其他育种技术思考：基因工程相对其他育种技术来说的优点是什么？来说的优点是什么？来源来源种类种类作用作用作用结作用结果果主要主要从从原核生物原核生物中分离纯化而来

2、中分离纯化而来已经分离出大约已经分离出大约4000种种1、识别识别双链双链DNA分子的某种分子的某种特定特定核核苷酸序列苷酸序列2、切开切开使每一条链中特定部位的两使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键。7仔细观察各限制酶仔细观察各限制酶 识别的特定序列有识别的特定序列有何何 特点？特点？限制酶的识别序列限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是呈现碱基互补对称，无论是6个个碱基还是碱基还是4个碱基，都可以找到个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的一条中心轴线，中轴线两侧的双链双链DNA上的碱基是上的

3、碱基是反向对称反向对称重复排列的重复排列的 ，称为，称为回文序列回文序列 G1234512345 A磷酸二磷酸二酯键酯键3端5端3端5端磷酸二酯键磷酸二酯键中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRIEcoRI限制酶的作用限制酶的作用黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条两条单链的切口，带有几个单链的切口，带有几个伸出的伸出的核苷酸核苷酸，他们之间正好互补配他们之间正好互补配对，这样的切口叫对，这样的切口叫黏性末端黏性末端。SmaISmaI限制酶的切限

4、制酶的切割割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNADNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。你能推测限制酶存在于原核生物中的你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？作用是什么吗？限制酶限制酶就是细菌的一种就是细菌的一种防御性工具，切割外源防御性工具，切割外源DNA寻根问底寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身为什么限制酶不剪切细菌本身DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其的细胞，其DNADNA分子中分子中不具备这种限制酶不具备这种限

5、制酶的识别切割序列的识别切割序列。 作用：催化形成磷酸二酯键两两DNADNA片段要具有片段要具有互补互补的黏性末端的黏性末端才能拼起来才能拼起来DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来起来，注意：注意：1.1.DNADNA连接酶可连接双链连接酶可连接双链DNADNA中的中的DNADNA单链缺单链缺 口，但不能连接单链口，但不能连接单链DNADNA！2.2.两条链之间的氢键自己形成两条链之间的氢键自己形成DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来DNADNA连接酶的

6、缝合作用连接酶的缝合作用DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点是否需要是否需要模板模板作用对象作用对象 作用结果作用结果用途用途都能催化形成都能催化形成磷酸二酯键磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重组组DNA分子分子形成形成DNA的一条的一条链链基因工程基因工程DNA复制复制DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较只能将只能将单个核苷单个核苷酸酸连接到已有的连接到已有的DNADNA片段上，形片段上，形成磷酸二酯键成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键DNA聚合酶的作用聚合酶的作用类型

7、来源功能相同点差别EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)思考：能否将目的基因直接导入受思考：能否将目的基因直接导入受体细胞？体细胞？ 不能 如果将目的基因直接导入受体细胞，目的基因将不能稳定存在、不能复制和表达不能稳定存在、不能复制和表达载体的作用载体的作用载体的必载体的必要条件要条件载体的种类载体的种类细菌的质粒细菌的质粒病毒：病毒：、动植物病毒等。、动植物病毒等。 有标记基因的存有标记基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培养基鉴别素的培养基鉴别。有切割位点有切割位点能复制并带能复制并带着插入的目着插入的目的基因一起的基因一起复制复制质粒质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌染色裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核体（即拟核DNA）之外，并具有自我复制能力的）之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状很小的双链环状DNA分子。分子。最常用运载体最常用运载体质粒质粒 实际上在基因实际上在基因工程操作中，工程操作中，真正被用作载真正被用作载体的质粒，都体的质粒，都是在天然质粒是在天然质粒的基础上进行的基础上进行过人工改造的。过人工改造的。注意：1.运载体上不能有多个同种限制酶的切点 2.切点在运载体自身重要基因