2016分子肿瘤概论研究生学生ppt课件

1、同窗们好！同窗们好！ 分子肿瘤概论分子肿瘤概论 重庆医科大学病理教研室重庆医科大学病理教研室 王娅兰王娅兰 教授教授(博士生导师博士生导师) v 分子肿瘤概论分子肿瘤概论v一、有关肿瘤的根本概念复习一、有关肿瘤的根本概念复习v肿瘤肿瘤tumor, neoplasm)v 基因程度基因程度 v 调控失常调控失常 v 异常增生异常增生 v 新生物新生物v肿瘤生物学行为肿瘤生物学行为-浸润、转移才干浸润、转移才干v 浸润浸润 (invasion)：来源处迁移：来源处迁移v 侵入周围临近组织侵入周围临近组织转移(metastasis)：从原发部位血管、淋巴管、体腔它处继续生长与原发瘤同样类型肿瘤 转移瘤

2、或继发瘤 NoImage 转移的途径转移的途径2Hematogenenous metastasis 全身脏器3Transcoelomic metastasis 体腔内脏器-零落种植 医源性种植 浸润生长-恶性肿瘤生长的特点 肿瘤转移过程必经的第一步v肿瘤的组织构造肿瘤的组织构造 v本质本质 parenchyma)v间质间质 mesenchyma, stroma) v肿瘤间质的主要成分肿瘤间质的主要成分v1. 血管血管v 小血管小血管 毛细血管毛细血管 血窦样血窦样 血管球样血管球样 v v新的肿瘤血供方式新的肿瘤血供方式v-血管生成拟态血管生成拟态(vasculogenic mimicry，V

3、M)v1999年，美国学者年，美国学者Maniotis等等v一种完全不同于经典血管生成的微循环方式一种完全不同于经典血管生成的微循环方式v-小管状似血管小管状似血管v-管壁主要由基底膜管壁主要由基底膜(PAS阳性阳性)围成，外衬以肿瘤围成，外衬以肿瘤细胞细胞v-腔内有血浆和红细胞流动腔内有血浆和红细胞流动v-管道与内皮性血管相通管道与内皮性血管相通v多存在于高度恶性肿瘤多存在于高度恶性肿瘤v血管生成拟态血管生成拟态vasculogenic mimicryv 肿瘤细胞构成肿瘤细胞构成v 有基底膜有基底膜v 小管状似血管小管状似血管v 与血管交通与血管交通v2. 结缔组织间质结缔组织间质v 1纤维

4、和基质纤维和基质v 胶原纤维胶原纤维 v 常规常规 HE - 红红v 特殊化学染色特殊化学染色v VG 改良法改良法- 红红 v Masson- 兰色兰色v 构成成分构成成分 I II III型胶原原纤维型胶原原纤维v 又由相应原纤维分子构成又由相应原纤维分子构成v 免疫组化或分子生物学方法可区别免疫组化或分子生物学方法可区别v弹力纤维弹力纤维v 常规常规 HE- HE-淡红色淡红色v 特殊化学染色特殊化学染色v Weigert Weigert或或Verhceff-Verhceff-暗兰或黑色，弹力暗兰或黑色，弹力v 酶消化后阴性酶消化后阴性v v v网状纤维网状纤维v 银染银染-黑色，故也称

5、嗜银纤维。黑色，故也称嗜银纤维。v PAS -强阳性强阳性v v成分成分 胶原蛋白为主要成分胶原蛋白为主要成分 v 细胞间质网状纤维细胞间质网状纤维- 型胶原蛋白型胶原蛋白 v 基底膜网状纤维基底膜网状纤维- 型胶原蛋白和型胶原蛋白和v 层黏连蛋白层黏连蛋白lamininv纤维黏连蛋白纤维黏连蛋白 FibronectinFNv 作用作用v A. 衔接基质中各种成分衔接基质中各种成分v B. 介导细胞外基质成分与细胞外表衔接介导细胞外基质成分与细胞外表衔接v黏蛋白黏蛋白v 又称蛋白多糖又称蛋白多糖proteoglycanv 如透明质酸，硫酸肝素等如透明质酸，硫酸肝素等 v骨黏素骨黏素 osteo

6、nectin v2基底膜基底膜 (basement membrane , BM) v 多种成分多种成分 v 与疾病肿瘤浸润关系亲密与疾病肿瘤浸润关系亲密 v 型胶原型胶原 v -不构成纤维，与不构成纤维，与、 型胶原不同型胶原不同v 层黏连蛋白层黏连蛋白 laminin ,LMv -有与细胞膜有与细胞膜LM 受体相结合的位点受体相结合的位点v 3 3细胞成分细胞成分 v 固有的细胞成分固有的细胞成分v - -纤维母细胞和纤维细胞纤维母细胞和纤维细胞v-肌纤维母细胞肌纤维母细胞 v-间充质细胞间充质细胞 v-巨噬细胞巨噬细胞v-树突状细胞树突状细胞 v反响性细胞成分反响性细胞成分v 各种细胞浸润

7、各种细胞浸润 v - 淋巴细胞淋巴细胞 最常见最常见 v -浆细胞浆细胞v -巨噬细胞巨噬细胞 v 都属免疫活性细胞都属免疫活性细胞 v二、肿瘤浸润、转移的分子机制二、肿瘤浸润、转移的分子机制v一肿瘤细胞的浸润转移一肿瘤细胞的浸润转移 v 1.肿瘤细胞增殖和扩展肿瘤细胞增殖和扩展v 浸润转移的前提和根底浸润转移的前提和根底 v2.肿瘤血管生成肿瘤血管生成(tumor angiogenesis)v 肿瘤浸润转移的必要条件肿瘤浸润转移的必要条件v3.3.肿瘤细胞分别零落，与细胞外基质黏附肿瘤细胞分别零落，与细胞外基质黏附v 1 1瘤细胞外表负电荷添加瘤细胞外表负电荷添加 v 2 2瘤细胞黏附力的改

8、动瘤细胞黏附力的改动v 瘤细胞本身构造异常瘤细胞本身构造异常 v 瘤细胞同质黏附力下降瘤细胞同质黏附力下降 v 指同种瘤细胞之间的黏附力指同种瘤细胞之间的黏附力瘤细胞异质黏附力添加 指肿瘤细胞与其它不同细胞及间质的黏附力同质黏附力降低，有利于肿瘤细胞分别；异质黏附力的添加，有利于瘤细胞与基底膜、间质成分粘附并穿过这些组织均由黏附分子介导经过配-受体之间的识别和结合实现 v 3肿瘤黏附分子(adhesion molecules) v细胞外表构造v 钙黏蛋白(cadherin) v 又称为钙衔接素，钙黏素。 v 依赖细胞外钙 v 介导钙离子依赖性细胞与细胞同源细胞的黏附 v据分布不同 E-钙黏蛋白

9、v P-钙黏蛋白v N-钙黏蛋白 H-cad v 整合素整合素(integrin)(integrin)v-细胞外表糖蛋白细胞外表糖蛋白 ，约有，约有20 20 多个亚型多个亚型 v-各种肿瘤细胞外表整合素种类不同各种肿瘤细胞外表整合素种类不同v-肿瘤生长各个阶段表达程度也不同肿瘤生长各个阶段表达程度也不同 v作用作用 v a. a.介导细胞与细胞外基质的黏附介导细胞与细胞外基质的黏附 v b. b.参与不同细胞之间的黏附衔接参与不同细胞之间的黏附衔接 v C. C.扮演细胞信号传送的角色扮演细胞信号传送的角色v配体配体- -整合素整合素- -细胞骨架蛋白跨膜信息传细胞骨架蛋白跨膜信息传导系统导

10、系统v 免疫球蛋白超基因家族免疫球蛋白超基因家族(immunoglobulin (immunoglobulin superfamily)superfamily)v 主要参与细胞与细胞间的衔接主要参与细胞与细胞间的衔接v ICAM-1 ICAM-1 细胞间黏附分子细胞间黏附分子-1-1 v VCAM-1 VCAM-1 血管黏附因子血管黏附因子 v NCAM NCAM 神经细胞黏附因子神经细胞黏附因子v 其它其它 包括包括CEA CEA 、DCCDCCv选择素选择素(selectin) (selectin) v内源性植物凝血素凝集素内源性植物凝血素凝集素v 作用作用 介导内皮细胞、血小板与瘤细胞黏

11、附介导内皮细胞、血小板与瘤细胞黏附v 选择素家族包括：选择素家族包括：v P-selectin P-selectin v E-selectin E-selectin v L-selectin L-selectinv CD44 CD44 及其它及其它 v CD 44( CD 44(透明质酸受体透明质酸受体) )v - -介导细胞与细胞外基质粘附介导细胞与细胞外基质粘附 v 路易斯寡糖路易斯寡糖SLEXSLEX，,s-LewisX ,s-LewisX v - -血管内皮细胞血管内皮细胞E-E-选择素的配体选择素的配体v v 4.4.瘤细胞的迁移瘤细胞的迁移(migration)(migration

12、)及化学趋向性及化学趋向性 (1) (1)瘤细胞的运动瘤细胞的运动 黏附；肌动蛋白、微管、中间丝黏附；肌动蛋白、微管、中间丝 (2) (2)瘤细胞运动的调理瘤细胞运动的调理据其作用，大致可分为两大类：据其作用，大致可分为两大类：仅影响运动的因子仅影响运动的因子 迁移刺激因子迁移刺激因子MSFMSF既影响运动又影响生长的因子既影响运动又影响生长的因子 AMF ( AMF (自分泌运动因子自分泌运动因子) ) HGF/SF HGF/SF肝细胞生长因子肝细胞生长因子/ /分散因子分散因子) ) v(3)(3)瘤细胞的化学趋向性瘤细胞的化学趋向性v 21KD 21KD 的蛋白质的蛋白质 v 骨吸收因子

13、骨吸收因子 v5.细胞外基质的降解细胞外基质的降解v(1)肿瘤浸润细胞外基质的步骤肿瘤浸润细胞外基质的步骤v Liotta 1986年提出年提出 v 第一步第一步 黏附于基底膜或其他间质成分黏附于基底膜或其他间质成分 v 第二步第二步 分泌蛋白酶并激活分泌蛋白酶并激活, 降解瘤细胞降解瘤细胞v 临近的细胞外基质临近的细胞外基质v 第三步第三步 进入受蛋白酶降解的基质区域内进入受蛋白酶降解的基质区域内 v(2)肿瘤细胞产生的蛋白水解酶肿瘤细胞产生的蛋白水解酶v丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子v纤维蛋白溶解酶纤维蛋白溶解酶(纤溶酶纤溶酶) v 纤溶酶原纤溶酶原 v a. 降解基

14、质降解基质 如纤维蛋白，如纤维蛋白，FN, LM, 蛋白多糖蛋白多糖v b. 激活胶原酶激活胶原酶 胶原降解胶原降解v尿激酶型纤溶酶原激活剂尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator , u-PA系统系统 vAu-PA：v 介导细胞周围基质蛋白的降解介导细胞周围基质蛋白的降解vBu-PA 受体受体u-PAR及纤溶酶原受体及纤溶酶原受体v v 活化活化u-PA 原酶方式的原酶方式的u-PAv纤溶酶原纤溶酶原+纤溶酶原受体纤溶酶原受体 纤溶酶纤溶酶vCPAI PA 抑制剂抑制剂v PAI1 是是u-PA 的主要抑制剂的主要抑制剂 v PAI2

15、不同肿瘤表达意义不一不同肿瘤表达意义不一v PAI3 功能不清功能不清v基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶matrix metalloproteinases, matrix metalloproteinases, MMPMMP及其抑制因子及其抑制因子v 需钙、锌离子作辅助因子需钙、锌离子作辅助因子 v MMP MMP 分类分类v 胶原酶：如间质胶原酶胶原酶：如间质胶原酶 CollagenaseCollagenasev 明胶酶：如明胶酶明胶酶：如明胶酶A (gelatinase A) A (gelatinase A) v 间质溶素：如间质溶素间质溶素：如间质溶素1 1 、2 2v 膜型基质金属蛋白酶：

16、膜型基质金属蛋白酶：、型型 v可分别降解可分别降解ECM中各种不同成分中各种不同成分v ECM降解的主要蛋白水解酶类降解的主要蛋白水解酶类v金属蛋白酶抑制物金属蛋白酶抑制物 v TIMP-1 ，TIMP-2 v 浸润与否取决于浸润与否取决于MMP与与TIMP的对比的对比v MMPTIMP ECM降解才干成为能够降解才干成为能够v胱氨酸蛋白酶类胱氨酸蛋白酶类 v Cathepsin B v作用作用v 降解降解ECM中各种胶原、中各种胶原、LM、 FN、黏蛋白、黏蛋白v 激活间质胶原酶和激活间质胶原酶和IV型胶原酶型胶原酶v天门冬氨酸蛋白酶天门冬氨酸蛋白酶 vcathepsin D, Ev 在肿瘤

17、浸润转移中的作用在肿瘤浸润转移中的作用 v CD 表达的调理表达的调理v6.瘤细胞以自动方式入循环管道并构成栓子瘤细胞以自动方式入循环管道并构成栓子v 微小淋巴管、微小静脉壁微小淋巴管、微小静脉壁 缝隙缝隙v 血管血管 基底膜缺损基底膜缺损 v瘤细胞存在方式瘤细胞存在方式 v 单个单个v 成团成团 同类癌栓同类癌栓 v 异类癌栓异类癌栓v 黏附分子对其发扬调理作用黏附分子对其发扬调理作用v v7.在特定器官的毛细血管滞留并黏着，再次穿过血在特定器官的毛细血管滞留并黏着，再次穿过血管壁并定居、增殖管壁并定居、增殖v 器官特异性选择性机制器官特异性选择性机制v (1) 黏附分子的作用黏附分子的作用

18、v (2) 化学趋化因子归巢景象化学趋化因子归巢景象)v (3) 微环境不适宜微环境不适宜v (4) 与免疫形状有关与免疫形状有关v 二机体免疫形状与肿瘤浸润转移v 参与控制转移的免疫细胞主要有 v NK 细胞v 巨噬细胞v T 淋巴细胞v 三肿瘤浸润转移相关基因v 转移相关基因v指基因的表达和改动可以促进或导致肿瘤发生转移的基因 v v四肿瘤表观遗传改动与肿瘤浸润转移四肿瘤表观遗传改动与肿瘤浸润转移v表观遗传学表观遗传学(Epigenetics) v-与遗传学与遗传学(genetic)相对应的概念相对应的概念v-表型形状改动，基因型不改动表型形状改动，基因型不改动 v-没有没有DNA序列变化

19、的情况下，序列变化的情况下， 可遗传的基因可遗传的基因v表达改动，导致的基因产物的变化。表达改动，导致的基因产物的变化。v -1942年提出，上世纪年提出，上世纪80年代后期逐渐兴起的一年代后期逐渐兴起的一门新学科门新学科 DNADNA的的“后天性修饰后天性修饰 CpG CpG岛高甲基化岛高甲基化 癌细胞基因组低甲基化癌细胞基因组低甲基化组蛋白残基的各种修饰组蛋白残基的各种修饰 磷酸化磷酸化 乙酰化乙酰化 甲基化甲基化 泛素化等等泛素化等等 v五肿瘤干细胞五肿瘤干细胞(tumor stem cell, TSC)v 2001年由年由Reya等提出等提出v 2006年美国癌症研讨协会年美国癌症研讨

20、协会AACR定义定义v 存在于肿瘤组织中具有无限自我更新才干并能产存在于肿瘤组织中具有无限自我更新才干并能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞 v 特征特征 v (1) 无限增殖和多向分化无限增殖和多向分化 v (2)存在自我更新的信号传导途径存在自我更新的信号传导途径v (3)具不同表型，异质性，对放化疗具不同表型，异质性，对放化疗不敏感不敏感v (4)具有端粒酶活性具有端粒酶活性 v (5)能转移到各种不同的组织能转移到各种不同的组织 v六肿瘤微环境与肿瘤浸润转移六肿瘤微环境与肿瘤浸润转移 v肿瘤细胞肿瘤细胞v间质细胞间质细胞 v细胞外基质细胞外基质v间质细胞所分

21、泌的活性介质细胞因子间质细胞所分泌的活性介质细胞因子v 共同构成的部分内环境共同构成的部分内环境 v微环境改动微环境改动v肿瘤细胞肿瘤细胞v-自分泌和旁分泌自分泌和旁分泌 v全身和部分组织全身和部分组织v-代谢、分泌、免疫代谢、分泌、免疫v 结果：结果： 限制或促进肿瘤的发生和开展限制或促进肿瘤的发生和开展 v三三.肿瘤学研讨中常用的分子生物学根本技术及其运肿瘤学研讨中常用的分子生物学根本技术及其运用用v(一一)蛋白表达异常的检测蛋白表达异常的检测v-免疫组化荧光定位免疫组化荧光定位 v-ELISA和和Western blot 、流式细胞术定量、流式细胞术定量 抗体抗体标标志志抗原抗原标标志志

22、抗体抗体细细胞胞细细胞胞抗体抗体标标志志抗原抗原标标志志细细胞胞v二蛋白质相互作用的检测方法二蛋白质相互作用的检测方法v1.酵母双杂交法酵母双杂交法v 验证两个知蛋白的相互作用验证两个知蛋白的相互作用v 挑选与知蛋白作用的未知蛋白挑选与知蛋白作用的未知蛋白v酵母双杂交系统是分析蛋白酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效蛋白间相互作用的有效和快速的方法，和快速的方法，v酵母双杂交的原理是将酵母双杂交的原理是将2个目的蛋白分别与转录激活区个目的蛋白分别与转录激活区transcription activation domain，AD和和DNA 结合区结合区DNA-binding domain

23、，DBD交融产生新的交融蛋白，假设这交融产生新的交融蛋白，假设这2个目的蛋白可以相互作用，那个目的蛋白可以相互作用，那么该相互作用会促使么该相互作用会促使AD和和DBD 相互接近而产生有活性的转录因子，进相互接近而产生有活性的转录因子，进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。v真核转录因子真核转录因子DBD能把蛋白定位到基因组特定能把蛋白定位到基因组特定DNA序列上，序列上，AD可以可以使转录安装激活基因转录。当这两个区域单独存在时均没有转录激活功使转录安装激活基因转录。当这两个区域单独存在时均没有转录激活功能，但当它们在空间上彼此联络时，

24、那么可以激活基因转录。能，但当它们在空间上彼此联络时，那么可以激活基因转录。 v局限性局限性 v双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内内 v酵母双杂交系统的一个重要的问题是酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性假阳性 v2.免疫共沉淀免疫共沉淀Co-Immunoprecipitation，CO-IPv是以抗体和抗原之间的专注性作用为根底的用于研是以抗体和抗原之间的专注性作用为根底的用于研讨蛋白质相互作用的常用、经典方法。讨蛋白质相互作用的常用、经典方法。v其根本原理是其根本原理是:v细胞裂解液中参与抗体，与抗原构成特异免疫复合细胞裂解液中参与抗

25、体，与抗原构成特异免疫复合物，经过洗脱，搜集免疫复合物，然后进展物，经过洗脱，搜集免疫复合物，然后进展SDS-PAGE及及Western blotting分析。分析。 v缺陷缺陷v免疫沉淀蛋白有能够不是直接相互作用的蛋白，而免疫沉淀蛋白有能够不是直接相互作用的蛋白，而是经过第三者间接相互作用的蛋白是经过第三者间接相互作用的蛋白v灵敏度不及蛋白亲和色谱高灵敏度不及蛋白亲和色谱高v必需在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检必需在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，假设预测不正确，实验就得不到结果，测的抗体，假设预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性方法本身具有冒险性v假阳性

26、的概率比较高假阳性的概率比较高v设置的对照包括：设置的对照包括：v在对照组中运用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞在对照组中运用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。系作为阴性对照等等。 v3.GST沉淀实验沉淀实验GST-pull down实验实验v主要是用来证明细胞外蛋白质相互作用主要是用来证明细胞外蛋白质相互作用v利用利用GST (Glutathione-S-transferase， GST)和和谷胱甘肽亲和树脂之间的高亲和性谷胱甘肽亲和树脂之间的高亲和性v将将GST固化在树脂上固化在树脂上vGST和谷胱甘肽转移酶蛋白在细菌、动物细胞等体和谷胱甘肽转移酶蛋白在细菌、动物细胞等体系

27、中交融表达系中交融表达v固化的诱饵蛋白【即诱饵蛋白固化的诱饵蛋白【即诱饵蛋白(Bait protein)】可以】可以捕获细胞裂解物中的互作用靶蛋白捕获细胞裂解物中的互作用靶蛋白v洗脱结合物后经过洗脱结合物后经过western blot 检测诱饵蛋白和靶检测诱饵蛋白和靶蛋白蛋白,从而证明两种蛋白间的相互作用或挑选相应的从而证明两种蛋白间的相互作用或挑选相应的目的蛋白目的蛋白 v4.Far-Western blottingv在经典在经典Far-Western印迹中，运用经标志的印迹中，运用经标志的或可被抗体检测的或可被抗体检测的“诱饵蛋白检测转移膜上诱饵蛋白检测转移膜上的的“猎物靶蛋白。猎物靶蛋白

28、。v用用SDS-PAGE 或非变性或非变性PAGE分别含有未知分别含有未知靶蛋白的样品通常为细菌裂解液然后转靶蛋白的样品通常为细菌裂解液然后转膜。膜。v转膜后与知诱饵蛋白孵育，运用该诱饵蛋白转膜后与知诱饵蛋白孵育，运用该诱饵蛋白的特异性检测系统检测。出相应条带的特异性检测系统检测。出相应条带+v5.生物信息学生物信息学v三基因拷贝数、转录产物三基因拷贝数、转录产物mRNA异常异常v - 核酸分子生物学方法进展检测核酸分子生物学方法进展检测v核酸变性、复性根本性质核酸变性、复性根本性质v常用方法常用方法 1. 核酸分子杂交核酸分子杂交nucleic acid molecular hybridis

29、ation技术技术最常用的根本技术最常用的根本技术根本原理：根本原理： -标志的知碱基序列标志的知碱基序列DNA或或RNA单链片段单链片段探针探针probe 同位素同位素P32 I125 非同位素非同位素 生物素生物素 地高辛地高辛 荧光素荧光素 -检测靶核酸待测核酸中能否存在与之检测靶核酸待测核酸中能否存在与之 同源的序列同源的序列 v1原位杂交原位杂交 ISHv2荧光原位杂交荧光原位杂交 FISH，v3双色多色银染原位杂交双色多色银染原位杂交DSISHv4Southern blot (DNA 杂交杂交)v5Northern blot (RNA 杂交杂交)v2. 聚合酶链反响聚合酶链反响po

30、lymerase chain reaction , PCR技术技术 v又称体外基因扩增又称体外基因扩增v利用利用DNA变性和复性原理变性和复性原理v体外进展体外进展v特定的特定的DNA 片段高效扩增片段高效扩增 v获得或放大特异基因信号的重要手段获得或放大特异基因信号的重要手段v扩增产物的检测扩增产物的检测 凝胶电泳分析凝胶电泳分析 v琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 (最常用最常用)v 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳v 单一条带单一条带v Real-time PCR Real-time PCRv RT-PCR RT-PCRv3.3.基因芯片技术基因芯片技术v( (四四) )基因突变的检测方

31、法基因突变的检测方法v1.1.聚合酶链反响聚合酶链反响- -单链构象多态性分析单链构象多态性分析Single Single strand conformation polymorphism analysis strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , of polymerase chain reaction products , PCR-SSCPPCR-SSCPv长度一样，构象不同长度一样，构象不同v在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳v迁移率泳动率不同迁

32、移率泳动率不同v碱基序列不同的单链碱基序列不同的单链DNADNA构像改动构像改动v根本方法根本方法v 作作PCRPCRv 将产物变性而成为单链将产物变性而成为单链v 进展非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进展非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 v 显示结果显示结果v 可用同位素可用同位素/ /荧光素标志荧光素标志 v 非同位素标志非同位素标志 v2.PCR-限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性restrection fragment length polymorphisms , RFLP分析分析技术技术v根本原理根本原理 v-序列中一个碱基发生改动序列中一个碱基发生改动 v-使原来的内切酶位点消逝使原来的内切

33、酶位点消逝v或产生新的酶切位点或产生新的酶切位点v-用限制性内切酶消化用限制性内切酶消化PCRv扩增出来的扩增出来的DNA片段片段v -检测其酶切片段长度的差别检测其酶切片段长度的差别v3.变性梯度凝胶电泳法变性梯度凝胶电泳法denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)v根本原理根本原理v 电泳时，不同浓度凝胶温度不同电泳时，不同浓度凝胶温度不同v DNA链中有一个碱基改动链中有一个碱基改动v 在不同的温度发生解链在不同的温度发生解链v 电泳迁移率改动电泳迁移率改动v v 4. DNA 序列分析序列分析DNA sequencing v 5. 荧光

34、原位杂交荧光原位杂交 ( FISH) v 6 DNA 芯片技术芯片技术DNA chip v五肿瘤的微卫星不稳定性分析五肿瘤的微卫星不稳定性分析v微卫星不稳定性微卫星不稳定性microsatellite instability , MI, 是指简单反复序列的是指简单反复序列的添加或丧失添加或丧失 v PCR + DNA 序列凝胶电泳序列凝胶电泳v六肿瘤易感性检测六肿瘤易感性检测 v采用相应基因变异方法进展检测采用相应基因变异方法进展检测v七肿瘤相关病毒七肿瘤相关病毒v 核酸杂交技术与核酸杂交技术与PCR技术技术v (八八) 基因重组技术基因重组技术v 主要目的是获得某一基因或主要目的是获得某一基因或DNA片段片段的大的大v 量拷贝量拷贝v (九九) 基因转染基因转染gene transfection技技术术v十十RNA干涉干涉(RNA interference核酸杂交核酸杂交/PCR技术与蛋白表达【免疫组化技术与蛋白表达【免疫组化/荧光、流荧光、流式细胞术、式细胞术、WB方法结合、蛋白结合检测方法方法结合、蛋白结合检测方法 】-蛋白表达蛋白表达 在翻译程度上定位研讨基因表达在翻译程度上定位研讨基因表达 -核酸杂交核酸杂交/PCR技术技术 检测检测DNA/RNA， 在基因或转录在基因或转录程度研讨基因表达程度研讨基因表达 v十一十一DNA-蛋白质结合检测蛋白质结合检测v1.