《免疫分析法》ppt课件

1、第三章第三章 免疫分析法免疫分析法一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反响三、抗体与免疫反响四、免疫分析方法及运用四、免疫分析方法及运用五、免疫分散法五、免疫分散法主要内容主要内容一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反响三、抗体与免疫反响四、免疫分析方法及运用四、免疫分析方法及运用五、免疫分散法五、免疫分散法主要内容主要内容 什么叫免疫分析？什么叫免疫分析？基于抗原和抗体的特异性反响进展检测的一种技术基于抗原和抗体的特异性反响进展检测的一种技术手段。抗原抗体反响是指抗原与相应的抗体之间发手段。抗原抗体反响是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反响。它既可以发生在体内，也可

2、生的特异性结合反响。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。高选择性和低检出限。以发生在体外。高选择性和低检出限。在体内发生的抗原抗体反响为体液免疫应对的效应在体内发生的抗原抗体反响为体液免疫应对的效应作用。体外的抗原抗体结合反响主要用于抗原或抗作用。体外的抗原抗体结合反响主要用于抗原或抗体的检测，用于免疫学诊断。体的检测，用于免疫学诊断。一、概述一、概述(1) 在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，度和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；以便

3、了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；(2) 在药物的临床检测中，对治疗指数小、超越平安剂在药物的临床检测中，对治疗指数小、超越平安剂量易发生严重不良反响或最正确治疗浓度和毒性反响浓量易发生严重不良反响或最正确治疗浓度和毒性反响浓度有交叉的药物血液浓度进展监测；度有交叉的药物血液浓度进展监测；(3) 在药物消费中，从发酵液或细胞培育液中快速测定在药物消费中，从发酵液或细胞培育液中快速测定有效组分的含量，以实现对消费过程的在线监测；有效组分的含量，以实现对消费过程的在线监测；(4) 对药品中能否存在特定的微量有害杂质进展评价。对药品中能否存在特定的微量有害杂质进展评价。在药物分析中，免疫分

4、析法的在药物分析中，免疫分析法的运用主要集中在以下几方面：运用主要集中在以下几方面：免疫分析：免疫分析： 利用抗原与抗体的特异性结协作用，利用抗原与抗体的特异性结协作用，来选择性识别和测定，可以作为抗体或来选择性识别和测定，可以作为抗体或抗原的待测物抗原的待测物. .免疫分析方法免疫分析方法非标志免疫分析抗原抗体结合理化性质发生变化非标志免疫分析抗原抗体结合理化性质发生变化标志免疫分析标志免疫分析标志物标志物有无有无非放射免疫分析非放射免疫分析放射免疫分析放射污染放射免疫分析放射污染酶联免疫分析酶联免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析电化学免疫分析电化学免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析免疫

5、分析免疫分析免疫分析检测的开展免疫分析检测的开展放射免疫检测兴起于放射免疫检测兴起于2020世纪世纪7070年代年代) )酶联免疫检测兴起于酶联免疫检测兴起于2020世纪世纪8080年代，年代，各临床机构普遍运用；各临床机构普遍运用；以化学发光为代表的光生物学标志及免以化学发光为代表的光生物学标志及免疫检测技术疫检测技术2020世纪世纪9090年代开场推行运年代开场推行运用，产品步入生长期三个阶段。用，产品步入生长期三个阶段。 特点特点可逆性可逆性比例性比例性反响阶段性反响阶段性特异性特异性免疫分析法的特点免疫分析法的特点特异性特异性特异性：抗原与抗体结合反响的专注性特异性：抗原与抗体结合反响

6、的专注性分子根底分子根底: :抗原表位与抗体分子高变区之间抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性空间构型的互补性可逆性可逆性可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗体均能坚持原有的构造和活性。体均能坚持原有的构造和活性。影响要素：影响要素： 抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合越结实，越不易解离越结实，越不易解离 环境要素对复合物的影响环境要素对复合物的影响pHpH、离子强度、离子强度 比例性和比例性和反响

7、阶段性反响阶段性比例性：抗原与抗体发生可见反响需遵照一定的比例性：抗原与抗体发生可见反响需遵照一定的量比关系量比关系前带前带(prezone)：抗体过量：抗体过量后带后带(postzone)：抗原过量：抗原过量等价带等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例适宜：抗原抗体比例适宜 一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反响三、抗体与免疫反响四、免疫分析方法及运用四、免疫分析方法及运用五、免疫分散法五、免疫分散法主要内容主要内容抗原抗原antigen,Ag)：是一类能刺激机体免疫系统发：是一类能刺激机体免疫系统发生免疫应对，并能与相应免疫应对产物抗体和致生免疫应对，并能与相

8、应免疫应对产物抗体和致敏淋巴细胞敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合的物质在体内外发生特异性结合的物质抗原的两种特性：免疫原性和抗原特异性抗原的两种特性：免疫原性和抗原特异性免疫原性免疫原性immunogenicity)，能刺激机体发生免疫，能刺激机体发生免疫应对，产生抗体和致敏淋巴细胞的才干。应对，产生抗体和致敏淋巴细胞的才干。抗原特异性能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异抗原特异性能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的才干。性结合的才干。 凡具有免疫原性和抗原性的物质称为完全抗原凡具有免疫原性和抗原性的物质称为完全抗原 只需抗原特异性而不具有免疫原性的物质称为半抗只需抗原特异性而不具有免疫

9、原性的物质称为半抗原原 半抗原半抗原+蛋白质蛋白质完全抗原完全抗原 赋予半抗原以免疫原性的蛋白质称为载体。赋予半抗原以免疫原性的蛋白质称为载体。 定义定义1.抗原的免疫原性抗原的免疫原性抗原物质必需具备的条件： 一、异物性 二、一定的理化性状 三、完好性 四、宿主的遗传性一、异物性一、异物性 异物是指化学构造与宿主的本身成分相异或机体的免疫细胞从未与它接触过的物质。异物性的物质包括以下几类： 1、异种物质 如：马血清蛋白、各种微生物及其代谢产物对人体而言都是异种物质，具有强的免疫原性。 2、同种异体物质 如：ABO血型抗原、人类主要组织相容性抗原。 3、本身抗原物质 如：本身组织成分构造改动、

10、隐蔽性本身成分暴露构本钱身抗原。二、一定的理化性状二、一定的理化性状大分子胶体物质 凡具有免疫原性的物质，分子量都较大，普通在10kDa以上,在一定范围内,分子量越大免疫原性越强。一定的化学组成和构造 从化学组成来看，凡含有芳香族氨基酸尤其是酪氨酸的蛋白质，其免疫原性较强。从构造来看，构造越复杂其免疫原性越强。分子构象与易接近性 分子构象是指抗原分子中一些特殊化学基团的三维构造，它决议抗原分子能否能与淋巴细胞外表的抗原受体相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化学基团与淋巴细胞外表相应的抗原受体相互接触的难易程度。三、完好性三、完好性 具有一定理化性状的物质须经非消化道途径进入机体包括注射、吸入

11、、混入伤口等，并接触淋巴细胞，才干成为良好抗原。假设是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破坏了其构造，就丧失了免疫原性。自然界中天然的抗原物质有：蛋白质、多糖、核蛋白 四、宿主遗传性四、宿主遗传性2.抗原特异性抗原特异性 抗原决议簇基 载体决议簇和半抗原决议簇 共同抗原和交叉反响一、抗原决议簇一、抗原决议簇1、概念 抗原决议簇antigenic determinant, AD)是指抗原中决议抗原特异性的特殊化学基团，又称为表位epitope)。表位的性质、数目和空间构象决议着抗原的特异性。抗原经过AD与相应淋巴细胞外表的抗原受体结合，激活淋巴细胞，引起免疫应对。2、种类和数量 一个抗原分子可以

12、有一种或多种不同的AD ，一种AD决议着一种特异性，多种AD决议着多种特异性3、部位 位于抗原外表的AD能直接被相应淋巴细胞所识别，称功能性决议簇，存在抗原分子内部的AD无激发免疫应对的功能，称隐蔽决议簇。只需经理化要素处置后，使之暴露能够成为新的功能决议簇。4、大小 抗原决议簇的大小与相应抗体的抗原结合部位相当。一个蛋白质抗原决议簇含5-7个氨基酸残基一个多糖抗原决议簇含5-7个单糖一个核酸半抗原决议簇含6-8个核苷酸5、抗原结合价antigenic valence)是指能和抗体分子结合的抗原决议簇的总数。半抗原为一价天然抗原的分子构造复杂，分子外表有多个决议簇为多价 构象决议簇：序列上不相

13、连而依赖于蛋白构象决议簇：序列上不相连而依赖于蛋白质或多糖的空间构象构成的决议簇，多暴质或多糖的空间构象构成的决议簇，多暴露于分子外表。露于分子外表。顺序决议簇：一段相连的氨基酸序列所形顺序决议簇：一段相连的氨基酸序列所形成的决议簇，多位于抗原分子内部。成的决议簇，多位于抗原分子内部。功能性功能性AD：分子外表，易被识别。：分子外表，易被识别。隐蔽性隐蔽性AD：分子内部。：分子内部。B细胞决议簇：分子外表。细胞决议簇：分子外表。T细胞决议簇：分子内部。细胞决议簇：分子内部。二、二、AD的分类的分类三、共同抗原和交叉反响三、共同抗原和交叉反响 两种来源不同的抗原，除各有其主要的特异性抗原决议簇外

14、，相互之间也存在部分一样的抗原决议簇，这种共有的抗原决议簇称为共同抗原。 亲缘关系很近的生物之间存在的共同抗原称为类属抗原。 无种属关系的生物之间存在的共同抗原称为异嗜性抗原。 一种共同抗原刺激机体产生的抗体，可与其他含有共同抗原的物质发生结合反响，称为交叉反响。2.2 药物分子的抗原性药物分子的抗原性 1、药物分子的免疫原性、药物分子的免疫原性 大多数的药物分子通常都是半抗原；大多数的药物分子通常都是半抗原； 一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物大部分属于完全抗原。物大部分属于完全抗原。 2、药物分子的抗原特异性、药物分子的抗原特异性 药物分子和蛋白质载

15、体结合后，抗原特异药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性能够会发生改动。性能够会发生改动。 3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清，通常会与蛋白质载体合成人工抗原进展实验。 常用载体：牛血洁白蛋白BSA、卵洁白蛋白OA、破伤风类毒素TT、钥孔蛋白KLH等。1半抗原和载体结合的化学反响半抗原和载体结合的化学反响 多肽类激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基构成肽键多肽类激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基构成肽键；与蛋白质或多肽的游离氨基缩合构成肽键；与蛋白质或多肽的游离氨基缩合构成肽键 甾体：甾体激素的羟基和酮基不能直接和载体蛋白构甾体：甾体激素的羟基和酮基不能直接和载体蛋白构成有效的共价键，需求制备甾

16、体的衍生物，经过含游成有效的共价键，需求制备甾体的衍生物，经过含游离羧基的甾体衍生物与载体蛋白相连离羧基的甾体衍生物与载体蛋白相连 抗生素：抗生素：-内酰胺环在偏碱性条件下可以与蛋白质的内酰胺环在偏碱性条件下可以与蛋白质的自在氨基以酰胺键的方式共价结合；氨基糖苷类抗生自在氨基以酰胺键的方式共价结合；氨基糖苷类抗生素用碳化二亚胺为衔接剂实现药物和载体蛋白的衔接素用碳化二亚胺为衔接剂实现药物和载体蛋白的衔接在选择结合半抗原的化学反响时，应思索不同的衔接方式能够对抗体的专注性产生不同的影响。半抗原没有可以结合的官能团时需求合成适当的衍生物。为得到特定抗原决议簇相对单纯的合成抗原，需求根据半抗原的化学

17、特性及衔接产物的化学特性选择衔接的半抗原。2半抗原和载体的选择原那么半抗原和载体的选择原那么p半抗原选择原那么：半抗原选择原那么：p最好含有芳香构造；最好含有芳香构造；p应思索抗原抗体反响的微环境；应思索抗原抗体反响的微环境；p合理利用分子类似物之间的交叉反响。合理利用分子类似物之间的交叉反响。p载体选择原那么：载体选择原那么：p应思索载体对检测系统的影响：选择的载应思索载体对检测系统的影响：选择的载体应和检测体系不发生交叉反响；用于包体应和检测体系不发生交叉反响；用于包被合成抗原的载体和用于免疫动物产生抗被合成抗原的载体和用于免疫动物产生抗体的合成抗原的载体蛋白不同。体的合成抗原的载体蛋白不

18、同。p免疫过程中思索载体效应的影响：抗体的免疫过程中思索载体效应的影响：抗体的特异性依赖于半抗原分子构造中的免疫决特异性依赖于半抗原分子构造中的免疫决议区，但整个载体蛋白大分子对于抗体反议区，但整个载体蛋白大分子对于抗体反响的性质和量也有影响；应运用一样载体响的性质和量也有影响；应运用一样载体的合成抗原制备半抗原抗体。的合成抗原制备半抗原抗体。3合成抗原的测定p定性测定方法：定性测定方法：p 光谱分析：半抗原和载体蛋白的结合导光谱分析：半抗原和载体蛋白的结合导致蛋白构象的改动，改动程度和半抗原的致蛋白构象的改动，改动程度和半抗原的结合量有关，半抗原结合量越大，构象改结合量有关，半抗原结合量越大

19、，构象改动程度越大。动程度越大。p 热力学分析：半抗原和载体蛋白结合后热力学分析：半抗原和载体蛋白结合后热力学特征会有变化，差别可经过差示扫热力学特征会有变化，差别可经过差示扫描量热法描量热法DCS等方法测定。等方法测定。p定量测定方法定量测定方法p 相对含量测定法：经过相对含量测定法：经过ELISA法比较半抗法比较半抗原与载体蛋白的相对结合量。原与载体蛋白的相对结合量。p绝对含量测定法：半抗原具有与载体蛋白绝对含量测定法：半抗原具有与载体蛋白完全不同的广谱吸收特征，且半抗原在此完全不同的广谱吸收特征，且半抗原在此特定波长下具有较强的吸收；或能利用特特定波长下具有较强的吸收；或能利用特定的化学

20、反响定量测定半抗原的量，且不定的化学反响定量测定半抗原的量，且不与载体蛋青丝生反响。与载体蛋青丝生反响。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反响三、抗体与免疫反响四、免疫分析方法及运用四、免疫分析方法及运用五、免疫分散法五、免疫分散法主要内容主要内容免疫分析实践上是一种特殊的试剂分析，特点是抗体/抗原成为分析试剂。 1、抗体的构造与功能抗体泛指机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白，通常由两条一样的重链和两条一样的轻链组成常用的是IgG分子，其在血清免疫球蛋白中的含量约70%1. 抗体抗体antibody, Ab功能性概念功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗是

21、由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、抗体主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。 2. 免疫球蛋白免疫球蛋白immunoglobulin, Ig构造性概念构造性概念 具有抗体活性或化学构造与抗体分子类似的具有抗体活性或化学构造与抗体分子类似的球蛋白。一切抗体都是免疫球蛋白，但是并非一球蛋白。一切抗体都是免疫球蛋白，但是并非一切免疫球蛋白都是抗体。切免疫球蛋白都是抗体。免疫球蛋白的根本构造 IgG分

22、子根本构造是由四个肽链组成的，二条较小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链是由二硫键衔接构成，分为氨基端N端，羧基端C端。 一、多克隆抗体一、多克隆抗体polyclonal antibodypolyclonal antibody 1. 1. 定义：抗原分子通常具有多个抗原决议簇，定义：抗原分子通常具有多个抗原决议簇，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B B细胞发生免疫应对，因此可产生多种针对不同细胞发生免疫应对，因此可产生多种针对不同抗原决议簇的抗体。这些由不同抗原决议簇的抗体。这些由不同B B细胞克隆产细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体生的抗体称为多克隆

23、抗体polycolonal polycolonal antibody, PcAbantibody, PcAb。 2. 2. 实践意义实践意义 1 1预防、治疗感染性疾病特异性差，可预防、治疗感染性疾病特异性差，可发生超发生超 敏反响敏反响 2 2临床诊断临床诊断二、单克隆抗体二、单克隆抗体monoclonal antibody, McAbmonoclonal antibody, McAb 1. 1. 定义：由单一克隆定义：由单一克隆B B细胞杂交瘤产生的、只识别细胞杂交瘤产生的、只识别 抗原分子某一特定抗原决议簇的、具有高度特异性抗原分子某一特定抗原决议簇的、具有高度特异性的的 抗体。每种单克

24、隆抗体其类、亚类、型及亲和力完抗体。每种单克隆抗体其类、亚类、型及亲和力完全全 一样，具有高度均一性。一样，具有高度均一性。 2. 2. 特点特点 具有高度均一性。具有高度均一性。 3. 3. 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞无限增殖；无限增殖； 免疫免疫B B细胞细胞合成、分泌特异性抗体。合成、分泌特异性抗体。 4. 4. 杂交瘤技术杂交瘤技术 HAT HAT培育基：次黄嘌培育基：次黄嘌(H)(H)、氨基蝶呤、氨基蝶呤(A)(A)和胸腺和胸腺 嘧啶核苷嘧啶核苷(T)(T)。三、基因工程抗体三、基因工程抗体 基因工程抗体是经过基因工程抗体是经过PCRPCR技术获得抗体基因或技术获得抗

25、体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛运用于疾病的临床诊断、统所产生的抗体，被广泛运用于疾病的临床诊断、预防和治疗及根底实际研讨等领域。预防和治疗及根底实际研讨等领域。 人人- -鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体chimeric antibodychimeric antibody； 人改型抗体人改型抗体reshaped humanized reshaped humanized antibodyantibody； 小分子抗体；小分子抗体； 双特异性抗体双特异性抗体bispecific antibodybispecific ant

26、ibody等。等。、 IgM IgG IgA IgD IgE 2抗体作为分析试剂的评价抗体作为分析试剂的评价 抗体的特异性是无与伦比的，不需或只需抗体的特异性是无与伦比的，不需或只需求简单的预处置。有较高的稳定性。求简单的预处置。有较高的稳定性。 这两点奠定了分析免疫高度灵敏和高度专这两点奠定了分析免疫高度灵敏和高度专注的根底。注的根底。 此外，抗体还有一个独特的性质：每个抗此外，抗体还有一个独特的性质：每个抗体分子有两个抗原的结合点，即多价性。体分子有两个抗原的结合点，即多价性。然而抗体缺乏高灵敏试剂应具备的分析信然而抗体缺乏高灵敏试剂应具备的分析信号反差。号反差。 3、抗体的制备、抗体的制

27、备 1常规抗血清多克隆抗体：指人工被动免疫后制成的多克隆抗体，是免疫分析中的重要工具。 免疫原的制备、动物免疫、放血、抗血清分别及抗血清的分析鉴定。免疫原的制备免疫原的制备 免疫原由质量好的抗原与佐剂制成。通常有免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。 水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度的免疫原。 弗氏佐剂是由一定量的羊毛脂和石蜡油，以及一定浓度的分支杆菌混合而成，经研磨到达油包水的程度。 不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。动物免疫动物免疫 通常的免疫动物为家兔和羊。 免疫的部位多采用脚掌、腹股沟淋巴结、大腿肌肉、皮下多点、静脉。 免疫抗原量通常为110mg或50100mg。试血及效价测定试

28、血及效价测定 家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量0.5ml。 不同稀释度的抗血清和1%的血细胞悬液按1:1混合，37保温2h后观测血细胞的凝聚情况，即可测得免疫血清的效价。2单克隆抗体 单克隆抗体是建立在经细胞交融而获得的单克隆抗体是建立在经细胞交融而获得的杂交瘤细胞根底上的。所获得的抗体具有杂交瘤细胞根底上的。所获得的抗体具有均一的特异性。均一的特异性。 高度均质性的特异性抗体，由一个识别单高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的一抗原表位的B B细胞克隆所分泌。普通来细胞克隆所分泌。普通来自杂交瘤细胞自杂交瘤细胞 细胞培育法细胞培育法 & & 接种动物体内消费法

29、接种动物体内消费法2、抗体的纯化 利用化学方法提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白。 利用免疫吸附剂和亲和色谱得到免疫学上专注性的抗体。沉淀分别 经过改动溶液的条件或添加某种物质，降低溶液中某一成分的溶解度，使其从溶液中沉淀析出，与其它成分分别的技术。 是纯化生物大分子物质常用的经典方法 包括盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法和非离子聚合物沉淀法等。一盐析法 在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过程称为“盐析。 优点：本钱低，不需求昂贵的设备；操作简便，平安；对许多生物活性物质具有稳定作用；对pH、温度要求不严厉。 缺陷：分别效果有限盐析的根本原理盐析的根本原理 蛋白质在水

30、溶液中的溶解度是由蛋白质亲水基团、与水构成水化膜的程度、以及所带有电荷的情况决议的。 当中性盐参与蛋白质溶液中，盐离子对水分子的亲和力大于蛋白质，于是减弱甚至消除蛋白质分子周围的水化膜。同时，盐离子所带的电荷中和部分蛋白质分子外表电荷，更加导致其溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。盐类和浓度的选择盐类和浓度的选择p常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等p硫酸铵最为常用，其优点是：溶解度大；温度系数小；密度小，有利于析出蛋白的离心分别；蛋白沉淀物在2 mol/L3 mol/L硫酸铵溶液中稳定，低温下可保管一年；价廉易得；分别效果比其它盐好。p但硫酸铵缓冲才干比较弱，p

31、H难控制；铵离子干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进展盐析。p高浓度盐析法是粗纯样品的常用方法。脱盐脱盐 蛋白质用盐析沉淀分别后，需求将蛋白蛋白质用盐析沉淀分别后，需求将蛋白质中的盐除去，常用的方法有：质中的盐除去，常用的方法有：透析法透析法超滤法超滤法葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G50G50层析法。层析法。二有机溶剂沉淀法p利用待分别物质与杂质在有机溶剂中的溶解度不同，经过添加一定量的某种有机溶剂，使某一溶质沉淀析出，从而与其它成分分别的方法。 p有机溶剂破坏溶质分子周围的水化层；有机溶剂降低溶液的介电常数，使蛋白质的溶解度降低。p优点：优点：p分辨率比盐析法高，即一种溶质发生沉淀的有分辨率比

32、盐析法高，即一种溶质发生沉淀的有机溶剂浓度范围比较窄；机溶剂浓度范围比较窄；p溶剂容易除去，并可以回收；溶剂容易除去，并可以回收；p沉淀无需脱盐，易于离心或过滤分别。沉淀无需脱盐，易于离心或过滤分别。p缺陷：缺陷：p有机溶剂可使某些生物大分子变性失活，操作有机溶剂可使某些生物大分子变性失活，操作常需在低温下进展；常需在低温下进展；p有机溶剂具有一定毒性。有机溶剂具有一定毒性。有机溶剂的选择p选择有机溶剂的原那么：选择有机溶剂的原那么：p有机溶剂的水溶性好；有机溶剂的水溶性好；p沉淀效率高；沉淀效率高；p毒性小，防止损害任务人员的安康和污毒性小，防止损害任务人员的安康和污染环境；染环境；p不与溶

33、质分子发生化学反响，价钱廉价不与溶质分子发生化学反响，价钱廉价。p运用较多的是乙醇、丙酮、甲醇等。运用较多的是乙醇、丙酮、甲醇等。p残留的有机溶剂去除的方法：残留的有机溶剂去除的方法：p 自然蒸发或负压蒸发，可在室温自然蒸发或负压蒸发，可在室温进展；进展；p 凝胶过滤除去。凝胶过滤除去。三离子交换层析法 离 子 交 换 层 系 离 子 交 换 层 系 i o n e x c h a n g e i o n e x c h a n g e chromatographychromatography， IEC IEC是利用离子交换剂上可交换离子是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时

34、结合力的差别，而进展分与组分中的离子发生可逆交换时结合力的差别，而进展分别的一种技术。广泛运用于很多生命物质的分析、制备和别的一种技术。广泛运用于很多生命物质的分析、制备和纯化等。纯化等。优点：优点： 重现性好，简单易行；重现性好，简单易行； 分辨力强，回收率高；分辨力强，回收率高； 具有多孔性，外表积大、交换容量大；具有多孔性，外表积大、交换容量大； 具有亲水性，对大分子的吸附不结实，层析条件具有亲水性，对大分子的吸附不结实，层析条件温暖，不致引起物量变性或失活。温暖，不致引起物量变性或失活。离子交换法的固定相是离子离子交换法的固定相是离子交换剂；交换剂；假设担体带有正电荷，可吸假设担体带有

35、正电荷，可吸附着负电荷分子，那么为阴附着负电荷分子，那么为阴离子交换法；不带净电荷的离子交换法；不带净电荷的分子，以及阳离子那么直接分子，以及阳离子那么直接流出，不会被吸附上去。流出，不会被吸附上去。这些被固相单体所吸附的离这些被固相单体所吸附的离子，统称为子，统称为 counter ion counter ion，由于其电荷与担体上的电荷由于其电荷与担体上的电荷相反相反 (counter (counter 是是 相反相反 的意思的意思) )离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，根离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不

36、同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。它可分据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。根本原理根本原理阳离子交换反响：阳离子交换反响：R-A- H+ + Y+ R-A- X+ + R-A- H+ + Y+ R-A- X+ + H+ H+ 阴离子交换反响：阴离子交换反响：R-B+ OH- + X- R-B+ X- + R-B+ OH- + X- R-B+ X- + OH- OH- R R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，代表离子交换剂的高分子聚合物基质，A- A- 和和B+B+分别

37、代表阳离子交换剂和阴离子交换剂分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，H+ H+ 和和OH-OH-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，的平衡离子，Y+ Y+ 和和X-X-分别代表溶液中的离子基团。分别代表溶液中的离子基团。p 两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pHpH条件下呈现的条件下呈现的离子形状。离子形状。p 大多数蛋白在生理大多数蛋白在

38、生理pHpHpH6pH68 8下带负电荷，需用阴离子交下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的换柱纯化，极端的pHpH下蛋白会变性失活，应尽量防止。下蛋白会变性失活，应尽量防止。 p p 洗脱可采用改动溶液的洗脱可采用改动溶液的pHpH或离子强度，也可同时改动或离子强度，也可同时改动pHpH与离与离子强度的方法。改动子强度的方法。改动pHpH能够对蛋白的稳定性有较大的影响，能够对蛋白的稳定性有较大的影响，普通采用改动离子强度的梯度洗脱。普通采用改动离子强度的梯度洗脱。p 用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平

39、稳地上升，当离子强度可以中和蛋白柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度可以中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。 在阴离子交换柱上血浆蛋白组分的分段洗脱在阴离子交换柱上血浆蛋白组分的分段洗脱NaCl(mol/L)NaCl(mol/L)0.01mol/L PB0.01mol/L PB的的pHpH洗脱的蛋白质洗脱的蛋白质0.0250.0258.08.0IgGIgG0.0300.0307.07.0IgGIgG0.0350.0357.07.0IgGIgG、转铁蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、纤维蛋白原0.0400.0407.07.0转铁蛋白、纤维蛋白原转铁蛋白、纤维

40、蛋白原0.0450.0457.07.022蛋白、白蛋白蛋白、白蛋白0.0500.0507.07.0IgAIgA、22蛋白、白蛋白蛋白、白蛋白0.0600.0606.56.5IgAIgA、白蛋白、白蛋白0.0700.0706.56.5白蛋白白蛋白0.0800.0806.56.522蛋白、蛋白、-脂蛋白、白蛋白脂蛋白、白蛋白0.0900.0906.56.522蛋白、珠蛋白、白蛋白蛋白、珠蛋白、白蛋白0.100.106.56.522蛋白、蛋白、-脂蛋白、珠蛋白、白蛋白脂蛋白、珠蛋白、白蛋白0.150.156.56.5IgMIgM、-脂蛋白、脂蛋白、球蛋白球蛋白0.200.206.56.5铜蓝蛋白、铜

41、蓝蛋白、蛋白蛋白三、技术要点三、技术要点一离子交换剂的选择和处置一离子交换剂的选择和处置两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定们的理化性质和在特定pH条件下呈现的离子形状。条件下呈现的离子形状。大多数蛋白在生理大多数蛋白在生理pHpH68下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量防止。下蛋白会变性失活，应尽量防止。处置的目的：使交换剂充分溶胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷处置的目的：使交换剂充分溶

42、胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷基团充分暴显露来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需求的反离子。基团充分暴显露来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需求的反离子。 二装柱和加样二装柱和加样选择平衡缓冲液的离子强度和选择平衡缓冲液的离子强度和pH时，首先要保证待分别物质的稳定；其次是使时，首先要保证待分别物质的稳定；其次是使离子交换剂与待分别物质有适当的结合，而不与样品中杂质结合，以到达分离子交换剂与待分别物质有适当的结合，而不与样品中杂质结合，以到达分别的目的。别的目的。溶液的离子强度常用不影响蛋白质吸附到交换剂上的最高离子强度液，常用的离溶液的离子强度常用不影响蛋白质吸附到交换剂上

43、的最高离子强度液，常用的离子强度为子强度为20 mmol/L 50 mmol/L NaCl。三洗脱和搜集三洗脱和搜集洗脱可采用改动溶液的洗脱可采用改动溶液的pH或离子强度，也可同时改动或离子强度，也可同时改动pH与离子强度的方法。改与离子强度的方法。改动动pH能够对蛋白的稳定性有较大的影响，普通采用改动离子强度的梯度洗脱能够对蛋白的稳定性有较大的影响，普通采用改动离子强度的梯度洗脱。用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度可以中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱浓度平稳

44、地上升，当离子强度可以中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。下来。四离子交换剂的再生与保管四离子交换剂的再生与保管使其带上所需的平衡离子。使其带上所需的平衡离子。 四亲和层析法 亲和层析是利用某些生物分子之间专注可逆结亲和层析是利用某些生物分子之间专注可逆结合特性的一种高度专注的吸附层析类型。合特性的一种高度专注的吸附层析类型。 配体是发生亲和反响的功能部位，也是载体和配体是发生亲和反响的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。被亲和分子之间的桥梁。 配体本身必需有两个基团：配体本身必需有两个基团： 一个能与载体共价结合，衔接后的配体对互一个能与载体共价结合，衔接后的配体对互补分子的亲和

45、力不会改动补分子的亲和力不会改动 一个能与被亲和分子结合。一个能与被亲和分子结合。亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要的分子亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要的分子 (B) (B) 杂夹在一堆蛋白质当中杂夹在一堆蛋白质当中，鱼饵是与，鱼饵是与 B B 具有专注性的分子具有专注性的分子 (A, (A, 上图上图 1) 1)；A A 与与 B B 的专注性很高，只的专注性很高，只会在样本中与会在样本中与 B B 结合，而排除其它杂质结合，而排除其它杂质 ( (上图上图 2) 2)；假设把结合在吸着剂上；假设把结合在吸着剂上的的 B B 溶离下来，就可以得到均质的溶离下来，就可以得到均质的 B (

46、 B (上图上图 3) 3)。 亲和层析中部分蛋白配体亲和层析中部分蛋白配体配基配基纯化的物质纯化的物质蛋白蛋白A/A/蛋白蛋白B B各种免疫球蛋白各种免疫球蛋白单克隆抗体单克隆抗体各种抗原、蛋白各种抗原、蛋白A A抗原抗原特异性单克隆抗体、特异性多克隆抗体特异性单克隆抗体、特异性多克隆抗体核苷酸核苷酸核苷酸结合蛋白、核苷酸酶核苷酸结合蛋白、核苷酸酶血凝素血凝素糖蛋白糖蛋白蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶蛋白酶脂肪酸脂肪酸脂肪酸结合蛋白、清蛋白脂肪酸结合蛋白、清蛋白糖糖血凝素、糖苷甘酶血凝素、糖苷甘酶生物素生物素亲和素、生物素结合蛋白亲和素、生物素结合蛋白肝素肝素凝血因子、酯酶、凝血因子、酯酶、

47、DNADNA聚合酶、衔接组织蛋白聚合酶、衔接组织蛋白酶酶钙调蛋白钙调蛋白钙调蛋白结合酶钙调蛋白结合酶TriazineTriazine染料染料脱氢酶、激酶、多聚酶、干扰素、限止酶等脱氢酶、激酶、多聚酶、干扰素、限止酶等3、特异性抗体的挑选与效价测定、特异性抗体的挑选与效价测定 抗体的效价又称滴度，指某一物质与一定容量抗体的效价又称滴度，指某一物质与一定容量的另一物质产生反响所需求的量。的另一物质产生反响所需求的量。 免疫分析中，免疫血清中抗体的效价指将血清免疫分析中，免疫血清中抗体的效价指将血清稀释，测定与一定的抗原能发生反响的最大稀稀释，测定与一定的抗原能发生反响的最大稀释度，此最大稀释度即为

48、血清的效价。释度，此最大稀释度即为血清的效价。 常用的效价测定方法有免疫分散法、间接血凝常用的效价测定方法有免疫分散法、间接血凝法和法和ELISAELISA法等。法等。 特异性抗体的挑选，制备出含不同的抗原决议特异性抗体的挑选，制备出含不同的抗原决议簇的特异性抗原，然后根据抗体和这些抗原相簇的特异性抗原，然后根据抗体和这些抗原相互作用的强弱进展分析。互作用的强弱进展分析。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反响三、抗体与免疫反响四、免疫分析方法及运用四、免疫分析方法及运用主要内容主要内容四、免疫分析方法及其运用四、免疫分析方法及其运用 放射免疫分析法放射免疫分析法RIA 荧光免疫分析

49、法荧光免疫分析法FIA 克隆酶给予体免疫分析法克隆酶给予体免疫分析法CEDIA 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法ELISA核医学核医学 治疗：肿瘤、甲亢等治疗：肿瘤、甲亢等 诊断诊断 体内体内PETPET、SPECTSPECT、 放射放射免疫成像等免疫成像等 体外体外放射免疫分析放射免疫分析RIARIA标志免疫分析技术标志免疫分析技术 用标志示踪技术察看抗原抗体一级反响的分析用标志示踪技术察看抗原抗体一级反响的分析方法方法, ,是体外放射分析技术中建立最早、运用是体外放射分析技术中建立最早、运用最广的一类竞争性体外放射分析技术最广的一类竞争性体外放射分析技术. . 特点：敏感性高，反响时间

50、短，可用仪器检测特点：敏感性高，反响时间短，可用仪器检测结果结果 三大标志免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫三大标志免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫、酶免疫、酶免疫 检测方法检测方法 检测范围检测范围 生化、常规免疫生化、常规免疫 mgg mgg10-3 10-6 g10-3 10-6 g 荧光免疫、酶免疫荧光免疫、酶免疫 gng gng10-6 10-9 g10-6 10-9 g 放射免疫、发光免疫放射免疫、发光免疫 ngpg ngpg10-9 10-9 10-12 g10-12 g PCR PCR pgfgpgfg10-12 10-15 g10-12 10-15 g一、放射免疫分析技术一、放

51、射免疫分析技术Radioimmunoassay，RIA 女科学家女科学家 R.Yalow美美,19211950末末 发明胰岛素，发明胰岛素，1977年获诺贝尔医学奖年获诺贝尔医学奖 1. 根本原理根本原理 1竞争结合分析：竞争结合分析：Ag + Ab AgAb *Ag + Ab *AgAb 2IRMA免疫放射分析：免疫放射分析： 2. 常用标志核素：常用标志核素： 1125I： 射线，半衰期射线，半衰期 60 天天 23H： 射线，半衰期射线，半衰期 12.3 年年 3. 丈量仪器丈量仪器 1 计数仪计数仪 2 液闪仪液闪仪根本原理AbAb限量，限量，AgAg* *定量定量, ,AgAg* *

52、和和AgAg的量大于的量大于AbAb结合位点，二者结合位点，二者经过竞争方式与经过竞争方式与AbAb结合；随着结合；随着AgAg添加，添加，AgAg* *与与AbAb结合构成结合构成AgAg* *AbAb复合物的放复合物的放射量降低射量降低, ,二者变二者变化化成函数关系。成函数关系。 详细步骤详细步骤 抗原抗体反响结合的和游离的放射性物质的分别放射性活度的测定柱色谱法柱色谱法吸附法吸附法沉淀法沉淀法抗抗体发抗抗体发微孔滤膜法微孔滤膜法固相法固相法求出结合率，绘制规范曲线剂量反响曲线求出结合率，绘制规范曲线剂量反响曲线以未结合的以未结合的AgAg* *为为F F，AgAg* *AbAb复合物复

53、合物为为B B，那么，那么B/FB/F或或B/(BB/(BF)F)与与AgAg的的量变存在着函数量变存在着函数关系剂量反响关系剂量反响曲线曲线 注：注：T即是即是B与与F的总和的总和根本原理根本原理 它采用抗原与抗体的特异反响将待测物它采用抗原与抗体的特异反响将待测物与酶衔接，然后经过酶与底物产生颜色反响，与酶衔接，然后经过酶与底物产生颜色反响，用于定量测定。用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂： 固相的抗原或抗体免疫吸附剂固相的抗原或抗体免疫吸附剂 酶标志的抗原或抗体标志物酶标

54、志的抗原或抗体标志物 酶作用的底物显色剂酶作用的底物显色剂二、酶联免疫吸附分析法二、酶联免疫吸附分析法ELISA 丈量时，抗原抗体先结合在固相载体上，但仍保管其免疫活丈量时，抗原抗体先结合在固相载体上，但仍保管其免疫活性，然后加一种抗体抗原与酶结合成的偶联物标志物，此偶性，然后加一种抗体抗原与酶结合成的偶联物标志物，此偶联物仍保管其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原联物仍保管其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原抗体反响结合后，抗体反响结合后，再加上酶的相再加上酶的相应底物，即起应底物，即起催化水解或氧催化水解或氧化复原反响而化复原反响而呈颜色。呈颜色。ELISA原理原理

55、酶及其底物酶及其底物 酶结合物过碘酸盐氧化法、戊二醛交联法是酶与抗体酶结合物过碘酸盐氧化法、戊二醛交联法是酶与抗体或抗原在交联剂作用下结合的产物。是或抗原在交联剂作用下结合的产物。是ELISA成败的关键试剂，成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反响，还具有酶促反响，显示它不仅具有抗体抗原特异的免疫反响，还具有酶促反响，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同，将得到不同的颜色反响。的颜色反响。ELISA原理原理酶酶 底底 物物显色反显色反响响 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯

56、胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-2,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+ +重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405

57、405420 420 -半乳糖苷半乳糖苷酶酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420 420 ELISA的种类和变化的种类和变化 一双抗体夹心法一双抗体夹心法二间接法二间接法三竞争法三竞争法 四双位点一步法四双位点一步法五捕获法测五捕获法测IgMIgM抗体抗体六运用亲和素和生物素的六运用亲和素和生物素的ELISA ELISA 一双抗体夹心法一双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标

58、定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体衔接构成固相抗体载体衔接构成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 参与封锁蛋白溶液以封锁载体参与封锁蛋白溶液以封锁载体外表残留的蛋白结合位点外表残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封锁蛋白洗涤并除去未结合的封锁蛋白加受检标本抗原构成加受检标本抗原构成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标志抗体酶标志抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进展加底物进展酶催化反响酶催化反响 根据颜

59、色反响的根据颜色反响的程度进展该抗原程度进展该抗原的定性或定量测定的定性或定量测定 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标志的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。二间接法二间接法包被固相载体包被固相载体: : 用知抗原包被用知抗原包被固相载体固相载体 加待检标本加待检标本: : 使相应抗体与固相抗原结合使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体加酶标抗抗体: :与固相载体上抗原抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体未结合的酶标抗抗体 加底物加底物显色显色 根据颜色反响的程度进展根据颜色

60、反响的程度进展该抗原的定性或定量测定该抗原的定性或定量测定ELISAELISA法间接法测定抗体法间接法测定抗体1.1.原理原理三竞争法三竞争法 对看管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物对看管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度那么随待测抗原和酶标抗原与固相抗体显色深；测定管的显色程度那么随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，参与底物固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，参与底物后显色反响较弱。