中药制剂分析

1、幻灯片 1中药制剂分析第一章绪 论中药制剂分析是以中医药理论为指导，运用现代分析理论和方法研究中药制剂质量的一门应用学科。第一节概 述一、中药制剂分析的对象中药制剂分析的对象应该是制剂组方中起主要作用的有效成分、毒性成分、或影响疗效的化学成分，对其做出定性、定量等各方面的评价。幻灯片 2二、中药制剂分析的特点一）中药制剂分析的对象是复杂的混合物。1. 组成中成药的中药材具有复杂性。中药材的同名异物，同物异名现象普遍存在。有的中药更由于形态相似，容易误用。2. 中成药化学成分的多样性、复杂性。1 1 ）由多味中药组成的复方制剂，其化学成分极为复杂多样。2 ） 各种化学成分在中药中的含量相差悬殊。

2、3 ）中药制剂由多种单味药材组成，所含化学成分相互影响。3. 中成药的剂型繁多，所用之辅料多种多样，在测定前，样品必须经过预处理，以排除各种辅料的干扰，必要时还须进行辅料的检查和测定。4. 工艺各异，很多在单味中药鲜品中存在的化学成分，经过炮制或制备工艺中经加热处理后已不复存在，或在制备过程中因挥发、分解、成盐（ 沉淀 ） 反应等增加了中成药分析工程的困难。幻灯片 3二）首先进行组方分析，随方决定测定主药，选择合适的检测指标，是目前质量分析方法的特点之一。在进行质量分析时首先以中医理论和用药原则为指导，进行组方分析，按功能主治分出主、辅、从、次药味和药群，选择某合适的化学成分为指标来说明其与质

3、量的关系。幻灯片 4三、影响中药制剂质量的因素（ 一 ） 原料药材的品种、规格、产地、药用部位、采收季节、加工方法的影响（ 二 ） 炮制方法的影响（三）生产工艺的影响（ 四 ） 中药制剂的包装、贮藏、保管的影响幻灯片 5四、中药制剂质量控制的现状和发展趋势一）国外药物分析发展趋势基本的方法主要为：分离分析法、电化学法、光谱法和联用分析方法等。各种色谱及其联用技术已成为占主导地位的常规分析方法，如HPTLC、 HPLC、 GC、 HPCE、LC-MS联用等。体内药物分析研究，趋向于采用在线的联用微透析分析技术，如 on-line MD-CE、 on-lineMD- LC等。手性药物作为化学药物的

4、特殊群体，以HPLC和CE为主要拆分手段的手性药物分析方兴未艾，已成为全世界药物分析的研究热点。幻灯片 6二)国内中药制剂分析现状与发展趋势1 、国内中药制剂分析现状2 )光谱法的应用A 比色法如丹参素/丹参注射液，阿魏酸/当归浸膏- 定量B 紫外 - 可见分光光度法单波长法如蒽醌 / 何首乌，香豆素/ 祖师栗膏- 定量 ；双波长法靛蓝、靛玉红/喉痛消炎丸- 定量 ；三波长法小檗碱 / 三黄片 - 定量 ；一阶导数光谱法 二阶导数光谱法 三阶导数光谱法绿原酸 / 感冒咳嗽冲剂，麻黄碱/ 哮喘丸 - 定量胆酸 / 清宫冲剂，血竭/ 七厘散 - 定量；幻灯片 7C荧光法丹参素 / 丹参注射液氢溴酸

5、东莨菪碱/ 中麻 2 号注射液- 定量。等D 红外分光光度法- 体、 - 体 / 山道年；番木鳖碱、马钱子碱/ 马钱子E质谱法F核磁共振光谱法3 )色谱法的应用A纸色谱法已较少应用；B 薄层色谱法应用广泛；C 棒状薄层色谱法小檗碱 / 复方黄柏制剂、人参皂甙/ 人参、胆酸和去氧胆酸/熊胆 - 定量；D 气相色谱法挥发性成分定量冰片 / 复方丹参片/ 牛黄解毒丸/ 冠心苏合丸等；厚朴酚、和厚朴酚/ 藿香正气水，麻黄碱/ 葛根汤；幻灯片 8E高效液相色谱法应用广泛，以反相 HPLE主；黄连素/半夏泻心汤，红景天黄/红景天口服液，甘草酸/千金升白冲剂等。4 )电化学分析法的应用A库仑法B电位法药物电

6、极测定法和电位溶出分析法5 )其他A原子吸收光谱法和冷原子技术B原子发射光谱C X 射线分析法目前，中药体系存在的突出问题具体表现在：(1) 定量分析指标与其主要药效作用间缺乏相关性；(2) 与化学药物相比，中药是一个由多成分、多因素构成的复杂体系，目前还没有建立起一套有效的中药复杂体系定量分析标准。幻灯片 92 。国内中药制剂分析发展趋势(1) 中药有效成分的筛选与确定；应用仿生学、基因组学等学科的理论和进展，发现新 的药物靶标，从分子、基因、受体、组织和整体水平系统准确地确定中药复杂体系中的药效物质；（2） 中药有效成分的提取与分析；中药化学成分非常复杂，而且有效成分也具有相对性。为了高效

7、率地提取中药有效成分，应用各种现代提取技术，如 SFE SWE UAE等，可用于 中药复杂体系中有效成分的提取，利用准确的仪器分析方法和计算机技术，通过因子分析方法对中药复杂体系进行定性定量评价；（3） 中药药效物质与中医药理论相关性研究；利用现代分析方法研究中药复杂体系中药效物质与中医药理论的定量关系，并结合现代医学理论，阐明其作用机制，在此基础上对中药及其复方进行全面质量控制。幻灯片 10第二节 中药制剂分析工作的基本程序中药制剂分析程序一般可分取样、测试样品溶液的制备和测定（包括定性鉴别、杂质检查、含量测定）等。一、 取样1 供试品要具有代表性：原则是均匀、合理。2 严格按照规定的取样方

8、法进行取样：一般应从每个包装的四角和中央五处取样，深度可达1/32/3 处。取得的样品装入清洁、干燥、具磨口塞的容器或密封的塑料袋中，并注明品名、批号、数量、取样日期及取样人。3 抽取供试品的数量：各类中药制剂取样大致是至少够3次检验的用量。贵重药品可酌情取样。粉状制剂（散剂、颗粒剂）一般取样100g,可从包装的上、中、下三层及周围间隔相等部位取样若干，将所得样品混匀，按四分法从中取出所需供试量。幻灯片 11液体制剂（口服液、药酒、糖浆、酊剂等）一般取样 200ml。同时须注意均匀取样。固体中成药（丸剂、片剂）成品取样一般为100g,压片后取样200片。丸剂一般取10 丸。胶囊剂称取不少于20

9、 个胶囊，倾出其中的药料，称定空胶囊的重量，由总重中减去，即为胶囊内药料的重量。依标示量及供试量称取部分药料供分析。一般取样量为100g。注射液的取样，灌注、熔封，灭菌前后应经过两次分析。灌封前将注射液混合均匀，如 液体取样原则取样，再按标示量及供试量分别取部分进行检验；经灭菌后的注射液须按原来的方法进行分析检验。已封好的安瓿，取样量一般为200 支。其它剂型的中成药，可根据具体情况随意抽取一定数量，作为随机抽样。供试样品检验完毕，应保留一半数量作为留样观察。幻灯片 12二、测试样品溶液的制备中药制剂测试样品溶液的制备一般分为提取、分离、净化等过程。1 . 中药制剂样品的提取冷浸法，61020

10、 倍药重溶剂，称重，浸泡122448 小时，称重, ，等分取样或取总样测定。适宜遇热不稳定的有效成分；连续回流法，样品置索氏提取器中，利用溶剂反复提取，提取效率高，溶剂少，遇热不稳定的有效成分不宜用此法；超声波提取法，样品置容器中，溶剂提取，效率高，一般样品30min 内即可完成。幻灯片 132 中药制剂样品的预处理液 - 液萃取法:溶剂直接萃取、离子对萃取，操作繁，易乳化。沉淀法：采用某些试剂沉淀杂质或沉淀待测成分。蒸馏法：利用待测成分或其分解产物具有挥发性的特点，采用蒸馏法、收集馏液进行含量测定，必须明确测定成分的结构才可用此法。色谱法（液- 固萃取法），常用净化剂有三氧化二铝、氧化镁、硅

11、胶、活性炭、大孔树脂、离子交换树脂、硅藻土、键合相硅胶C18、C8等。其中离子交换树脂、硅藻土、键合相硅胶C18、 C8 等目前有较多商品预处理柱，使用方便，操作简单，净化效率高。幻灯片 14三、定性鉴别、检查和含量测定1 定性鉴别1 ）性状鉴别系指中成药的形状、颜色、气味等，凡药典收载品，在药典中均有规定，可按要求进行检查。2 ）显微鉴别因为含有中药原粉的中成药均保留中药材的显微特征。可以通过这些特征，对中成药进行定性鉴别。3 ）理化鉴别药典中常用的方法有：荧光法、显色法、沉淀法、微量升华法；纸色谱法、薄层色谱、液相色谱、气相色谱等。中药定性鉴别应选择其中主药（君药）、辅药（臣药）作为主要对

12、象，其次应鉴别毒剧药及贵重药材。幻灯片 152 检查按我国药典要求，中药制剂需要检查的项目大致可分为三类：1 ）污染型中成药一般杂质检查项目有：异物、灰分、酸不溶性灰分、重金属、砷盐等；卫生学检查：微生物细菌检查；以及有的产品要求农药残留量的检测。2 ）特殊杂质型原料药材掺假、有毒成分的限量检查。3 ）剂型的要求检查类型（制剂通则要求检查项目）中成药一般质量要求的检查有：挥发油测定、水分测定（固体制剂）、乙醇含量测定、总固体、相对密度、pH 值（酊剂、药酒）、装量差异（片重差异）、崩解度（片剂、胶囊剂）、熔点测定、旋光度测定等。幻灯片 163 含量测定中成药含量测定所采用的方法除经典的重量法、

13、容量法 （ 包括中和法、容量沉淀法、络合滴定法、氧化还原法及非水溶液滴定法等） 外， 还可采用电位法、库伦滴定法、比色法、可见 - 紫外分光光度法、红外分光光度法、液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、双波长薄层扫描法等。1 ）对有效成分明确的中药制剂要进行有效成分的含量测定。2 ）大致明确有效成分，要求测定这些成分的总量。3 ）对有效成分已知但无理想的测定方法的中药制剂，可通过测定其中某些化学成分的含量间接控制有效成分的含量。4 ） 对有效成分不明确的中药制剂可采用以下方法：选择可能的有效成分或主要成分（指示性成分）进行含量测定；测定药物的总固体量；选择在原料加工炮制时或制备、

14、贮存过程中易损失、破坏的成分进行含量或限量测定。5 ）中药制剂中含有剧毒性成分则要测定其含量。6 ）贵重药材在制剂中投料量应加以测定。幻灯片 17第二章中药制剂定量分析方法第一节可见 - 紫外光谱法一、单一物质的定量定量依据是Beer-Lambert定律，A=lC。测定单一物质时，先测定物质的吸收光谱，然后选择最大吸收峰的波长max进行定量分析。一个物质若有几个吸收峰时，可选择吸收峰较高，在此吸收峰处吸光度随波长变化较小，并且其它物质无吸收的波长作为定量条件。一般不选择光谱最左边的末端吸收峰作定量测定的波长。常用定量方法：1. 对照法C样=C标A样/A标；C标A样/ （A标C样）=样品% C样

15、和C标分别为 样品浓度和标准品浓度，C样为样品标示浓度。2. 标准曲线法：从标准品吸光度-浓度曲线求得样品浓度。幻灯片 18二、混合物的含量测定1） 混合物中有a， b 两种组分，若两者的最大吸收峰不重合，且在 a 的1max处，b无吸收；在b的2max处，a无吸收。可分别在 1max、2max处用单一物质的定量方法 从混合物中测定a、b 的浓度。2） 混合物中有a， b 两种组分，吸收光谱部分重叠，在a 的 1 处， b 无吸收；在b的2处，a有吸收。先在2处测定总吸收 Aa+b,再在1处测定Aa1;先从Aa1直接求出a 的浓度，根据 a的浓度求出Aa2。再从Aa+b减去Aa2后求得Ab2,

16、就可求得b的浓度。幻灯片 19（三）双波长测定法中药制剂分析中常用的方法为等吸收波长法和系数率法。1 等吸收波长法2 ）基本原理根据左图选出两个波长1 与 2，其选择原则是干扰组分a 在 1 与 2 处吸收度相等，即Aa1= Aa2等吸收波长法原理示意图- （ Aa1 + Ab1 ）=Ab2 - Ab1 =幻灯片 20。而待测组分b 在 1 与 2 处的差吸收度A应比较大，再在1与2处测混合组分溶液的差吸度A。设 1 为参比波长，2 为测量波长，则A=Aa+b2 - Aa+b1b2 - b1 ) CbL（ Aa2 + Ab2 ）3 ）应用举例喉痛消炎丸中靛蓝、靛玉红的测定i）选择等吸收波长：用

17、 28g/ml的靛蓝及靛玉红的氯仿溶液在分光光度计上扫描，并用同法扫描出空白样品溶液的吸收曲线。从左图可知靛蓝在 540nmi处有合适的等吸收波长；靛玉红却是在514. 2nm和566nm处有等吸收波长，而空白样品液在上述波长处的吸收曲线几乎成一条直线、不干扰测图 2-1-3 靛蓝、靛玉红的吸收曲线1 1) 靛蓝 (2) 靛玉红 (3) 无青黛样品定，选取靛蓝的测定波长s1=566 nm、参比波长R1= nm。可选靛玉红白测定波长s2=540nms参比波长 R2=。幻灯片 21ii)标准曲线：精密吸取靛蓝对照品溶液、；靛玉红对照品溶液、，分别放入10ml 量瓶中，用氯仿稀释至刻度，分别在上述等

18、吸收波长处测其差吸收度：A1=A566nm -；A2=A540nm -；然后用A对C作标准曲线；并求出其一元回归方程：A1 = C1 (ri =A2 = C2 +(r2=iii)含量测定：精称喉痛消炎丸细粉约于索氏提取器中，用氯仿提取至无蓝色，用氯仿定容于50ml 量瓶中，再精密吸取5ml 置 10ml 量瓶中，加氯仿至刻度即为样品溶液。将样品溶液在si与R1,处测出A样1值，用以上A1式求出靛蓝的浓度及样品中靛蓝的含量。同样，在s2与R2处测出A样2,用以上A2式求出靛玉红的浓度及样品中靛玉红的含量。2 联立方程法A a+b1=Aa 1+Ab 1=a 1 CaL+ b 1 CbLA a+b2

19、=Aa 2+Ab 2=a 2 CaL+ b 2 CbL幻灯片 22(四)三波长测定法此法要求在任一吸收曲线上，能找出满足下述条件的三个波长：即在干扰组分的吸收曲线上，与三个波长相应的点，能在一条直线上。1 基本原理左图中 1 、 2、 3 为在任一吸收曲线上，任意选择的三个波长。Ai、A2、A3为在三个波长处分别测出的吸收度。根据相似三角形的等比性质，可推导出下式，A A= A2 -( m A1+nA3) / ( m + n )=2- ( mi + n3) / ( m + n) CL三波长分光光度法的原理说明A A与待测组分浓度 C成正比。幻灯片 232 应用举例二陈丸中陈皮甙的测定i )总干

20、扰组分的制备及其吸收光谱i)除去陈皮黄后，陈皮其他组分提取液的制备：用溶剂(含%氢氧化钠的 75%乙醇液)提取陈皮粉，提取液经薄层分离，刮取除陈皮甙以外的所有斑点洗脱，得除陈皮甙以外陈皮其他组分提取液(I) 。ii)二陈丸空白粉提取液的制备：按处方比例配制除陈皮以外的二陈丸空白粉，用上述溶剂提取，得二陈丸空白粉提取液（n）。将（I）、（n）按处方比例混合，得二陈丸总干扰成分液（出）。分光光度计分别测定陈皮黄对照品和（出）的吸收光谱。见左图。其他成分对陈皮黄的测定有干扰，用6批不同来源的原料按上法制备（出），并测其吸收光谱，结果谱形相似。可采用三波长法消除干扰。幻灯片 242 ）选择三个测定波长

21、作图法粗选，再计算精选在 （出）的A=0处，即为精选的三个波长：入 1 =,入2=,入3=。3 ）标准曲线配制不同浓度的陈皮甙对照品溶液，在选出的三个波长处，分别测定吸收度，并算出A A值，XA值与浓度C进行直线回归，回归方程为：A A = （r =4 ）样品测定精密称取二陈丸细粉约，加上述溶剂浸泡提取15 小时，过滤，取续滤液，用溶剂稀释至，在选出的三波长处，分别测定吸收度，计算其AA值，再按回归方程算出陈皮甙含量。本法平均回收率：，RSD：。幻灯片 25（五）差示光谱法1 基本原理差示光谱法的关键有二，其一，提供一个近似理想的参比溶液。其二，使待测组分发生特征光谱变化，而赋形剂或其他共有组

22、分却不引起光谱变化，因而可消除它们的干扰。设 Ax、 Ay 分别代表两种不同介质中待测组分在测定波长处的吸收度，Az 代表背景和干扰组分的吸收度，其不受测定介质改变的影响。根据吸收度加和性原理，则A A=A样-A 参=（Ax +Az）-（Ay + Az）= Ax - Ay=（ e x - y）CL差示光谱中的振幅，即最大吸收与最小吸收之差值，也可进行定量测定，这可提高本法的专属性。幻灯片 262 应用举例差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红素的含量1 ）测定原理胆红素具有高度共轲体系结构，在波长453nm处为最大吸收，在可见光照射下胆红素易氧化成蓝色产物，在453nm处吸收度显着降低。2 ）选用

23、日光下照射 30分钟或在红外灯下照射 4小时测A A值。3 ）精密称取胆红素 2mg于50ml棕色量瓶中，加入适量冷（10 以下） 的酸性氯仿（150ml 氯仿中含浓盐酸） ，于冰水浴中超声振荡 20 分钟，稀释至刻度，制成储备液。准确吸取0， 4、 0 8、 1 ， 2、 、储备液于 10ml 量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，测其光照前后在453nm处的吸收度。回归方程胆红素在酸性氯仿溶液中的吸收光谱为a A= + （r=。a 光照前b 光照后除光照反应外，其余操作均需避光。幻灯片 274 ）分别制得六应丸、六神丸、牛黄消炎丸的空白样品对照液，在453nm处测得各自光照前后的A值，计算A A实验

24、表明三种成药A A值为零或几乎为零。说明其他干扰组分在 以上光照条件下不干扰胆红素的测定。5 )精密称取六应丸、六神丸各60mg,牛黄消炎丸120mg置10ml带塞的试管中，准确加入冷酸性氯仿10ml,冰水浴中振荡20分钟，过滤，弃去初滤液，测续滤液光照前后的A值，算出A A值。由回归方程算得样品的含量。本法加样回收率：六应丸为,RSD%;六神丸为%, RSD啜；牛黄消炎丸为,RSD=%。幻灯片 28(六)导数光谱法1导数光谱及其特征通常的吸收光谱，其吸收度是波长的函数A=C E=C(入)。对波长求导，将其微分系数(dnA/d入n入)对波长扫描可得导数光 谱图。特征：(1) 导数光谱的阶数愈高

25、，峰形愈尖锐且数量亦增多。(2) 在零阶光谱的极大处，其相应的奇阶光谱通过零点。在零阶光谱的两拐点处，奇阶导数光谱为极大或极小。(3) 偶阶导数光谱的形状与零阶光谱类似，零阶光谱的峰值对应于偶阶导数光谱的极值， 零阶光谱的拐点在偶阶导数光谱中通过零点。(4) 导数光谱谱带的极值数等于导数阶数加1 。高斯曲线及其一至四阶导数曲线幻灯片 29 导数分光光度的优点：a.能检出两个或两个以上的重叠吸收带；b 能分辨在强吸收曲线“肩部”的弱吸收带；c 能精密确定单一吸收峰位置；d 能消除基线(背景)的影响；e 能进行定量测定。2 基本原理 吸收光谱服从 Beer定律： A = - C- L 根据导数光谱

26、的定义，对上式求导，则：dA/d 入=(d e /d 入) CL; d2A/d 入 2= (d2 e /d 入 2) CL;dnA/d 入 n= (dn e /d 入 n) CL;式中L为定值，给定物质在特定波长处的d /d入、d2 /d入2dn e /d入n也是定值，因此，dA/d 入C, d2A/d 入 2CdnA/d 入 nQ幻灯片 30常用的定量参数的选择方法有：1 ) 峰 -谷 法测 量 相 邻 峰 、 谷 之 间 的 距 离 。左图中的h1 h2(振幅，用D表示)。2 ）基线法取相邻二同向峰（ 正或倒） 的公切线为基线，以中间的反向峰峰尖至基线 的距离为测量值。左图中p1。3 ）峰

27、- 零法测量峰值到零线间的垂直距离，左图中p2。4 ）面积法根据一阶或二阶导数光谱面导数光谱的测量积， 进行定量测定。3 共存组分干扰吸收的消除1 ）一阶导数光谱法消除线性干扰吸收A= CL + a 入 + bdA/d 入=（de/ d 入）CL + a说明线性干扰在一阶导数光谱中对定量参数D（振幅）没有影响，D只与待测组分浓度成正比。D=（ dA/d 入）峰-（dA/d 入）谷=（d / d 入）峰-（d / d 入）谷CL幻灯片 312 ）高阶导数光谱法消除非线性干扰吸收及用于重叠峰的分离，定量若干扰组分吸收对波长呈非线性，为一近似的二次吸收曲线，则总吸收度为A= CL + e 入 2 +

28、 f 入 + g 对其求一阶、二阶导数得：dA/d入= （de / d 入）CL +e 入 + fd2A/d 入 2= （d2 e / d 入 2） CL +e4. 导数光谱法中的主要参数1） 微分阶数（n） n 的选择主要由干扰组分吸收曲线的形状而定。n 越大，分辨力愈强，但信噪比将降低。2）波长间隔（A入）A入愈大，测量灵敏度增大，但分辨率降低，通常A入选12nm为好。3）中间波长（入m）通常需选两个入m,即入ml、入m2。其选择原则：待测组分的导数 曲线在入ml、入m2处的形状易辨认，较特征；而干扰组分在此处的导数值相等或相近。幻灯片 325. 应用举例1） 肺露中丹皮酚含量的测定（i

29、）干扰丹皮酚测定情况的考察：按处方配比，分别取药材，加水适量，蒸馏提制成22 味药材的模拟液，以水为空白，分别绘制紫外吸收光谱图。从图中看出，牡丹皮蒸提液紫外吸收很强，枇杷叶和芦根蒸提液紫外吸收较弱，干扰丹皮酚的测定，实验表明：丹皮酚在碱性溶液中的吸收光谱发生红移，A入=35 2nmo1.牡丹皮2 .枇杷叶3 ,芦根幻灯片 33（ii）选择测定波长精取丹皮酚对照液 2ml,枇杷叶和芦根蒸提液各 10ml,分别于25ml 量瓶中，加L 氢氧化钠溶液至刻度，混匀。以L 氢氧化钠溶液为空白，绘制吸收光谱(零阶)和一阶导数光谱，如下图。按中间波长选择原则，选为中间波长，则测定波长为328nm和332n

30、m, 368nm和372ns蒸提液在L 氢氧化钠溶液中的光谱图1 肺露 2 丹皮酚3 枇杷叶4 芦根13芦根幻灯片 34( iii)标准曲线精密量取丹皮酚对照液ml)、25ml 量瓶中，加L 氢氧化钠溶液至刻度，混匀，以330 和 370nm一阶导数光谱图丹皮酚2 枇杷叶L 氢氧化钠溶液为空白，在测定波长处测吸收度，计算一系列AA值。A A =(A328 - A332) - (A368 - A372)标准曲线的回归方程为：A A = +(r =)(iv)样品测定取同一批号或不同批号样品，分别精密量取10ml于25ml量瓶中，加 L 氢氧化钠溶液至刻度，混匀，以L 氢氧化钠溶液为空白，在测定波长

31、处测其吸收度，算出A A,根据标准曲线的回归方程，计算样品中丹皮酚含量。本法平均回收率，RSD=%。幻灯片 352 )清宫冲剂中胆酸的二阶导数光谱测定法(i )干扰情况的考察胆酸对照液与样品的二阶导数光谱显示，在397nm, 386nm波长处有相应的吸收峰和吸收谷。阴性样品二阶导数光谱呈近乎平直线条，见下左图。猪去氧胆酸的二阶导数光谱将360420nm区间的吸收消除为二次无关吸收，不干扰样品中胆酸的含量测定如下中图。下右图表明，胆酸二阶导数光谱，其峰- 谷振幅值D 与浓度具有良好的线性关系，因此，可用397nm, 386nm两波长的振幅D为定量参数，用峰-谷法进行测定。样品，胆酸对照品溶胆酸、

32、猪去氧胆酸二对照品溶液液二阶导数光谱阶导数光谱二阶导数光谱A.样品B.胆酸对照品 C.阴性样品1 .胆酸2 .猪去氧胆酸幻灯片 36(ii)测定条件零阶光谱扫描波长：190550nm；二阶导数光谱扫描波长，360420nm； A 入=5nm(iii)标准曲线精密称定胆酸对照品约 30mg置100ml量瓶中，加入 60%醋酸稀释至刻度，分别精密吸取、于15ml具塞刻度试管中，加60%醋酸至，加入稀硫酸14.0ml, 摇匀，70水浴中放置20 分钟，取出静置20 分钟后，用60 醋酸加上述稀硫酸作空白，测二阶导数光谱。中间波长397nm, 386nm,测出各峰-谷振幅值D,得回归方程：D= - (

33、r=1 . 000)(iv)样品测定精密称取约样品粉末加 50ml氯仿回流提取4小时，常压回收氯仿至干，用 60醋酸溶解，定容于10ml 量瓶中，精密吸取样品液于15ml 具塞刻度试管中，按标准曲线项下操作，测峰-谷振幅值D,按回归方程计算样品中胆酸含量。本法平均回收率：%,RSD=%。幻灯片 37第二节薄层色谱法薄层色谱法(TLC) 是一种微量的分离分析技术，具有设备简单，检出灵敏，测定快速，应用广泛等特点。薄层色谱定量的方法可分为二类，一类是薄层洗脱定量法，将被测化合物从薄层上洗脱下来，萃取后，再选择适当方法进行测定。另一类是在展开后的薄层上直接进行测定。一、薄层洗脱定量1 点样在薄层板的

34、起始线上，将定量的样品液点成一条状，点样时应避免任何损失。在板的两边，点上对照品作为定位剂，如图A,然后，在选好的溶剂中层开，斑点要集中，不应有拖尾现象。2 定位对本身有颜色的化合物可直接定位，对有荧光的化合物可在紫外光下观察定位，对多数无色化合物不可在薄层上直接喷显色剂定位，此时，应将待测组分的薄层部分用玻璃板悬空盖住后再喷，这样可利用两边的对照点显色定位。幻灯片 383捕集、洗脱和测定定位后，应捕集洗脱，若为软板，可将待测组分的带状区域用捕集器收集，如图(B)。若为硬板，可直接用捕集器收集，也可用刀片将样品区带的吸附剂定量地刮下，再用合适溶剂洗脱后，进行定量测定，如图(C)。幻灯片 39洗

35、脱溶剂，一般应选极性较大，对待测化合物溶解度亦较大的溶剂，如乙醚、氯仿、丙酮、乙醇、甲醇等，在单一溶剂洗脱效果欠佳时，可采用混合溶剂。洗脱方法可采用渗滤法、多次浸出法、加热温浸法、索氏回流提取法等。对不易洗脱的化合物，也可不经洗脱，在吸附剂中加入适当的显色剂，使其定量反应，然后离心或过滤后再进行测定。幻灯片 40二、薄层上直接定量薄层上直接定量的方法有目测法、测面积法、仪器测量法。，目前，用薄层扫描仪扫描测定斑点中化合物含量的方法已成为薄层定量的主要方法，此法也可用于纸色谱、电泳凝胶及其他介质的色谱。( 一 ) 测定原理与方法1 吸收测定法(l)Kubelka-Munk原理及方程：当强度为I0

36、的单色光照射到厚度为X的薄层后,其情况如下图所示。I0为入射光强度i (x)为x处的透射光强。j (x)为x处的反射光强。X为固定相厚度。幻灯片 41Kubelka-Munk 指出，当强度为I0的单色光照射到厚度为X的薄层后，光的反射和透射符合下述微分方程：-di/dX = -(S + K)i + Sjdj/dX = -(S + K)j + SiS :单位厚度薄层固定相的散射系数；K为薄层色谱斑点或单位厚度薄层固定相的 吸收系数；X为由载板表面算起的薄层厚度。i 与 j 的一般解为：i = Asinh(bSx) + Bcosh(bSx)j = (aA - bB)sinh(bSx) + (aB

37、- bA)cosh(bSx)A , B常数，a= (S+内 /S, b= (a2 - 1 ) 1/2 , Sinh= (ex - e-x ) /2 ；Cos= ( ex + e-x ) /2 ， A/B=a/b 。为讨论方便，一般计算边界的i 和 j ，即薄层下表面的透射光和上表面的反射光。X=0 时， j= 0 ， i =I0TX=X 时， i =I0 ， j=I0R则 T =b/asinh （ bSX） + bcosh （ bSX） R = sinh（ bSX） /asinh （ bSX） + bcosh （ bSX） SX称作散射参数，它与薄层厚度、散射系数有关。Merck硅胶板的SX=

38、3青岛硅胶板SX= 3,日本和光硅胶F板SX=7）幻灯片 42SX 数值大小直接影响薄层色谱斑点的吸光度- 浓度曲线偏离Beer 定律的程度。薄层色谱斑点中物质的含量包含于a 及 b 两个参数中，已知 a= （S+K）/S, b= （a2 - 1 ）1/2 ,乘以 X,则a=（ SX+KX） /SXb= KX（ 2SX+KX） 1/2/SXKX 为吸收参数，相当于薄层色谱单位面积中物质的含量（g/cm2 ） ，即KX=C。幻灯片 43薄层色谱斑点的吸光度：理想的空白薄层板的K=0,但一般K0o为消除影响，通常以空白板为基准，测定相对透光率及相对反射率来计算薄层色谱斑点的吸光度。透射法 A= -

39、lg （ T/T0） 反射法 A= -lg （ R/R0）-lgT/T0或-lgR/R0为仪器检测部分所获得的信号，它们和KX间的关系曲线相当于一般分光光度法中的A-C 曲线，在溶液中，A-C 曲线为一直线，而在薄层上，-lgT/T0 或-lgR/R0和浓度间不呈线性关系，比较下图可以看出弯曲度随SX增加而增加。不同SX时，吸光度与 KX间关系曲线a 透 射 法 测 定 -lgT/T0 与 KX 间 关 系b .反射法测定-lgR/R0与KX间关系幻灯片 44目前对 Kubelka-Munk 曲线处理采用两类方法：曲线校直法和计算机回归法。岛津CS系列采用前者，CAMAGZ器采用后者。1校正前的标准曲线2 校正后的标准曲线曲线校直法是一种简便的薄层色谱扫描定量校准方法，但比较粗糙，且有时难于知道薄层板的SX的准确值。幻灯片 452 荧光测定法荧光测定法的定量依据为：F= （）I0abCF为荧光强度；。为荧光效率；I0为入射光强度；a为吸收系数；b为薄层厚度；c 为样品浓度。F 与 C 成正比，二者之间存在线性关系。荧光测定法与吸收测定法不同，其测量值与斑点形状无关。本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的化合物均可用本法测量。荧光测定法选择性高，因激发光与荧光波长均能加以选择，可避免一些其他组分的干扰，其