核酸的鉴定与保存学习教案

1、会计学1核酸核酸(h sun)的鉴定与保存的鉴定与保存第一页，共153页。第五章第五章 核酸核酸(h sun)(h sun)的分离纯化的分离纯化第1页/共152页第二页，共153页。第五章第五章 核酸的分离核酸的分离(fnl)(fnl)纯化纯化第2页/共152页第三页，共153页。第五章第五章 核酸核酸(h sun)(h sun)的分离纯化的分离纯化第3页/共152页第四页，共153页。第4页/共152页第五页，共153页。第一节第一节 核酸分离纯化核酸分离纯化(chn hu)(chn hu)的设计及原则的设计及原则第二节第二节 基因组基因组DNADNA的分离的分离(fnl)(fnl)纯化纯化

2、第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取的提取(tq)(tq)与纯化与纯化第四节第四节 RNARNA的分离纯化的分离纯化第5页/共152页第六页，共153页。第6页/共152页第七页，共153页。一、材料一、材料(cilio)与方法的选择与方法的选择二、技术二、技术(jsh)路线的路线的设计设计三、核酸三、核酸(h sun)的鉴定与的鉴定与保存保存第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则第7页/共152页第八页，共153页。一、材料一、材料(cilio)与方法的选择与方法的选择（一） 材料与方法(fngf)的选择（二） 选择(xunz)原则 第8页/共152页第九页，共1

3、53页。一、材料一、材料(cilio)与方法的选择与方法的选择第9页/共152页第十页，共153页。 1 1、保持核酸碱基序列的完整性、保持核酸碱基序列的完整性 2 2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3 3、保持核酸的完整性、保持核酸的完整性 应尽量简化分离应尽量简化分离(fnl)(fnl)纯化步骤，缩短提取纯化步骤，缩短提取时间时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 （二） 选择(xunz)原则一、材料与方法一、材料与方法(fngf)的选择的选择第10页/共152页第十一页，共153页。二、技术路线二、技术路线(l

4、xin)的设的设计计（一）核酸(h sun)的释放（二）核酸的分离(fnl)与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤第11页/共152页第十二页，共153页。二、技术路线二、技术路线(lxin)的的设计设计第12页/共152页第十三页，共153页。细胞破碎方法 应用 机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母第13页/共152页第十四页，共153页。第14页/共152页第十五页，共153页。第15页/共152页第十六页，共153页

5、。第16页/共152页第十七页，共153页。（二）核酸(h sun)的分离与纯化二、技术二、技术(jsh)路线的设计路线的设计第17页/共152页第十八页，共153页。二、技术二、技术(jsh)路线的设计路线的设计第18页/共152页第十九页，共153页。三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与保存与保存（一）核酸(h sun)的鉴定（二）核酸(h sun)的保存第19页/共152页第二十页，共153页。（一）核酸（一）核酸(h sun)的的鉴定鉴定1、浓度(nngd)鉴定2、纯度(chnd)鉴定3、完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存第20页/共152页第二十一页，共15

6、3页。1、浓度(nngd)鉴定三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与与保存保存第21页/共152页第二十二页，共153页。 各种各种( zhn)( zhn)碱基的紫外吸收光谱碱基的紫外吸收光谱三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与保存与保存第22页/共152页第二十三页，共153页。三、核酸三、核酸(h sun)的鉴定与的鉴定与保存保存第23页/共152页第二十四页，共153页。EB与DNA的结合(jih)第24页/共152页第二十五页，共153页。2、纯度(chnd)鉴定三、核酸三、核酸(h sun)的鉴定与的鉴定与保存保存第25页/共152页第二十六页，共153页。1. D

7、NA1. DNA或或RNARNA的定量的定量OD260=1.0OD260=1.0相当于相当于50g/ml50g/ml双链双链DNADNA40g/ml40g/ml单链单链DNADNA（或（或RNARNA）20g/ml20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判断核酸样品判断核酸样品(yngpn)(yngpn)的纯度的纯度DNADNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8: OD260/OD280 = 1.8RNARNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0: OD260/OD280 = 2.0三、核酸三、核酸(h sun)的鉴定的鉴定与保存与保存第26页/共152页第二十七页，共153

8、页。(A值等于(dngy)1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA或RNA，20 g/ml单链寡核苷酸）第27页/共152页第二十八页，共153页。三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与保存与保存第28页/共152页第二十九页，共153页。第29页/共152页第三十页，共153页。3、完整性鉴定(jindng)三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与与保存保存第30页/共152页第三十一页，共153页。DNADNA片段片段(pin dun)(pin dun)的降解的降解三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与保存与保存第31页/共152页第三十二页，共1

9、53页。三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与与保存保存第32页/共152页第三十三页，共153页。三、核酸三、核酸(h sun)的鉴定的鉴定与保存与保存第33页/共152页第三十四页，共153页。 总总RNARNA电泳图谱电泳图谱三、核酸三、核酸(h sun)的鉴定与的鉴定与保存保存第34页/共152页第三十五页，共153页。 正常时，正常时，28S RNA的荧光强度的荧光强度约为约为18S RNA的的2倍，否则提示倍，否则提示(tsh)RNA的降的降解解第35页/共152页第三十六页，共153页。（二）核酸(h sun)的保存1、DNA的储存(chcn)2、RNA的储存(chcn)

10、三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存第36页/共152页第三十七页，共153页。三、核酸三、核酸(h sun)的鉴定与的鉴定与保存保存（二）核酸(h sun)的保存_DNA的储存第37页/共152页第三十八页，共153页。可延长。三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定(jindng)与与保存保存第38页/共152页第三十九页，共153页。第39页/共152页第四十页，共153页。生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组 DNA粗品PFGE分离特定的DNA片段AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离 粗分离前处理离子交换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法

11、 哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般(ybn)技术路线第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离的分离(fnl)(fnl)纯化纯化第40页/共152页第四十一页，共153页。第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离的分离(fnl)(fnl)纯化纯化一、酚抽提法(t f)二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕(chnro)法四、其它方法五、DNA片段的纯化六、DNA片段的回收第41页/共152页第四十二页，共153页。DNA酚抽提法(t f)示意图 一、酚抽提法(t f)第42页/共152页第四十三页，共153页。第43页/共152页第四十四页，共153页。第44页/共152页第四十

12、五页，共153页。第45页/共152页第四十六页，共153页。第46页/共152页第四十七页，共153页。第47页/共152页第四十八页，共153页。第48页/共152页第四十九页，共153页。第49页/共152页第五十页，共153页。第50页/共152页第五十一页，共153页。第51页/共152页第五十二页，共153页。第52页/共152页第五十三页，共153页。第53页/共152页第五十四页，共153页。第54页/共152页第五十五页，共153页。第55页/共152页第五十六页，共153页。第56页/共152页第五十七页，共153页。DNA玻棒缠绕(chnro)法示意图 三、玻棒缠绕(ch

13、nro)法第57页/共152页第五十八页，共153页。第58页/共152页第五十九页，共153页。第59页/共152页第六十页，共153页。DNA柱层析法柱层析法示意图示意图五、五、 DNA DNA片段片段(pin dun)(pin dun)的纯化的纯化第60页/共152页第六十一页，共153页。第61页/共152页第六十二页，共153页。（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收(hushu)DNA片段（一） 从琼脂糖凝胶中回收(hushu)DNA片段第62页/共152页第六十三页，共153页。六、六、 DNA DNA片段片段(pin (pin dun)dun)的回收的回收第63页/共152页第六十四页，

14、共153页。第64页/共152页第六十五页，共153页。第65页/共152页第六十六页，共153页。第66页/共152页第六十七页，共153页。第67页/共152页第六十八页，共153页。第68页/共152页第六十九页，共153页。六、六、 DNA DNA片段片段(pin dun)(pin dun)的回收的回收第69页/共152页第七十页，共153页。六、六、 DNA DNA片段片段(pin (pin dun)dun)的回收的回收第70页/共152页第七十一页，共153页。第71页/共152页第七十二页，共153页。第72页/共152页第七十三页，共153页。第73页/共152页第七十四页，共

15、153页。第74页/共152页第七十五页，共153页。第75页/共152页第七十六页，共153页。第76页/共152页第七十七页，共153页。第77页/共152页第七十八页，共153页。第78页/共152页第七十九页，共153页。第79页/共152页第八十页，共153页。第80页/共152页第八十一页，共153页。第81页/共152页第八十二页，共153页。第82页/共152页第八十三页，共153页。第83页/共152页第八十四页，共153页。第84页/共152页第八十五页，共153页。第85页/共152页第八十六页，共153页。第86页/共152页第八十七页，共153页。第87页/共152页

16、第八十八页，共153页。第88页/共152页第八十九页，共153页。二、煮沸裂解法三、SDS裂解(li ji)法四、其它(qt)方法一、 碱裂解法五、质粒DNA的纯化第89页/共152页第九十页，共153页。第90页/共152页第九十一页，共153页。第91页/共152页第九十二页，共153页。一、碱裂解法一、碱裂解法碱裂解法示意图第92页/共152页第九十三页，共153页。第93页/共152页第九十四页，共153页。第94页/共152页第九十五页，共153页。第95页/共152页第九十六页，共153页。第96页/共152页第九十七页，共153页。第97页/共152页第九十八页，共153页。第

17、98页/共152页第九十九页，共153页。（二）牙签少量(sholing)制备法(一) 小量一步(y b)提取法第99页/共152页第一百页，共153页。第100页/共152页第一百零一页，共153页。第101页/共152页第一百零二页，共153页。第102页/共152页第一百零三页，共153页。第103页/共152页第一百零四页，共153页。第104页/共152页第一百零五页，共153页。五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化(chn hu)(chn hu)第105页/共152页第一百零六页，共153页。第106页/共152页第一百零七页，共153页。第107页/共152页第一百零八页，共

18、153页。EBCsCl密度梯度离心法示意图五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化(chn hu)(chn hu)第108页/共152页第一百零九页，共153页。五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化(chn hu)(chn hu)第109页/共152页第一百一十页，共153页。第110页/共152页第一百一十一页，共153页。第111页/共152页第一百一十二页，共153页。第112页/共152页第一百一十三页，共153页。第113页/共152页第一百一十四页，共153页。内源性内源性RNA酶酶第114页/共152页第一百一十五页，共153页。第115页/共152页第一百一十六页，共153

19、页。第116页/共152页第一百一十七页，共153页。第117页/共152页第一百一十八页，共153页。第118页/共152页第一百一十九页，共153页。第119页/共152页第一百二十页，共153页。OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌(mi jn)15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化(chn hu)RNA的过程中不使用DEPC。第120页/共152页第一百二十一页，共153页。第121页/共

20、152页第一百二十二页，共153页。第122页/共152页第一百二十三页，共153页。二、酸性二、酸性(sun xn)(sun xn)异硫氰酸胍异硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一氯仿一步法步法三、商品化的单相裂解三、商品化的单相裂解(li ji)(li ji)试剂法分试剂法分RNARNA四、mRNA的分离纯化一、RNA制备的条件与环境第123页/共152页第一百二十四页，共153页。第124页/共152页第一百二十五页，共153页。第125页/共152页第一百二十六页，共153页。第126页/共152页第一百二十七页，共153页。第127页/共152页第一百二十八页，共153页。第128页/共1

21、52页第一百二十九页，共153页。第129页/共152页第一百三十页，共153页。第130页/共152页第一百三十一页，共153页。第131页/共152页第一百三十二页，共153页。第132页/共152页第一百三十三页，共153页。第133页/共152页第一百三十四页，共153页。第134页/共152页第一百三十五页，共153页。第135页/共152页第一百三十六页，共153页。第136页/共152页第一百三十七页，共153页。第137页/共152页第一百三十八页，共153页。5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+总RNA中的poly(A) +RNA分子退火形成杂交体 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5链亲和素标