转氨基作用 jxPPT精选文档

1、1实验：转氨基作用纸 层 析 法生化教研室2验证肝脏内存在具有转氨基作用的酶。验证肝脏内存在具有转氨基作用的酶。初步掌握纸层析的原理和方法初步掌握纸层析的原理和方法【实验目的实验目的】3. 茚三酮显色原理茚三酮显色原理1转氨基作用转氨基作用2层析原理层析原理【实验原理实验原理】4转氨基作用转氨基作用 在转氨酶的作用下，在转氨酶的作用下，-氨基酸的氨基酸的-NH2-NH2和和-酮酸的酮酸的-C=O-C=O相互转化，生成相应的相互转化，生成相应的-酮酸和酮酸和氨基酸的过程。氨基酸的过程。磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛【实验原理实验原理】5最常见转氨酶：转氨基作用转氨基作用GPT 谷丙转氨酶（glutamic

2、 pyruvic transaminase）GOT 谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminade） 所有转氨酶的辅酶都是维生素B6的磷酸酯- 磷酸吡哆醛。【实验原理实验原理】6 （谷丙转氨酶）（丙酮酸） （ 丙氨酸）丙氨酸）R1氨基酸 R2酮酸R1酮酸 R2氨基酸PLP（-酮戊二酸）酮戊二酸）（谷氨酸）（谷氨酸）【实验原理实验原理】7 层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一。它是利用层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一。它是利用混合物中各组分的混合物中各组分的理化性质理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和

3、力、性、分子亲和力、分配系数分配系数等）的差异，在两相运动中，不断地等）的差异，在两相运动中，不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，可将各组分间的微小差进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，可将各组分间的微小差异经过相同的重复过程而达到分离。异经过相同的重复过程而达到分离。 无论哪种层析均由无论哪种层析均由固定相固定相和和流动相流动相组成。组成。 8用水饱和的用水饱和的水水滤纸滤纸有机溶剂有机溶剂+结合水结合水= 样品在样品在固定相固定相中的浓度（中的浓度（C固固）样品在样品在流动相流动相中的浓度（中的浓度（C流流）分配系数分配系数K固定相固定相流动相流动相OH OH OH OH ：滤纸：

4、有机溶剂【实验原理实验原理】9 B O迁移率迁移率f A点样点到点样点到斑点中心斑点中心的距离（的距离（AB）点样点到点样点到溶剂前沿溶剂前沿的距离（的距离（AO）【实验原理实验原理】10迁移率迁移率RfRf与分配系数与分配系数K K的关系的关系【实验原理实验原理】11 COOHH C CH3 NH2 COOHH C CH2CH2COOH NH2【实验原理实验原理】谷氨酸谷氨酸 丙氨酸丙氨酸K KGlu Glu K KAlaAlaRfRfGlu Glu RfKRfKAlaAla12茚三酮茚三酮H2O茚三酮水合物茚三酮水合物茚三酮显色反应茚三酮显色反应蓝紫色化合物蓝紫色化合物【实验原理实验原理】

5、13 1、实验器材、实验器材 培养皿；滤纸；匀浆器；试管；试管架；恒温水培养皿；滤纸；匀浆器；试管；试管架；恒温水浴锅；毛细管；移液管；喷雾器；剪刀；铅笔；格浴锅；毛细管；移液管；喷雾器；剪刀；铅笔；格尺尺 2、实验试剂、实验试剂 （1）0.01M pH7.4磷酸缓冲液磷酸缓冲液 （2）0.1M丙氨酸溶液丙氨酸溶液 （3） 0.01M-酮戊二酸溶液酮戊二酸溶液 （4） 0.1M谷氨酸溶液谷氨酸溶液 （5） 0.5茚三酮溶液茚三酮溶液 （6）水饱和的苯酚水饱和的苯酚 【实验仪器和试剂实验仪器和试剂】141.1.肝匀浆制备：提供转氨酶肝匀浆制备：提供转氨酶3.3.纸层析纸层析4.4.茚三酮显色茚三

6、酮显色2.2.转氨基：丙氨酸转氨基：丙氨酸 谷氨酸谷氨酸【实验操作实验操作】151.肝匀浆制备：肝匀浆制备：提供转氨酶提供转氨酶新鲜肝脏新鲜肝脏0.5g4.5ml 0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液磷酸缓冲液充分匀浆至充分匀浆至粉红色溶液粉红色溶液充分匀浆充分匀浆食指抵住底部食指抵住底部匀匀浆浆中指、食指中指、食指夹住十字柄部夹住十字柄部16【实验操作实验操作】172. 转氨基：转氨基：丙氨酸丙氨酸 谷氨酸谷氨酸测定管测定管对照管对照管肝匀浆液肝匀浆液45水浴箱水浴箱5分钟分钟煮沸煮沸10分钟、冷却分钟、冷却0.5ml0.5ml丙氨酸丙氨酸0.5ml 0.5ml 酮戊二酸酮戊二酸0.5m

7、l 0.5ml PH7.4磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 0.5ml 0.5ml45 保温保温30分钟分钟45 保温保温30分钟分钟183.纸纸 层层 析析画线画线点样点样打孔打孔做灯芯做灯芯展层展层1.测定管测定管2.丙氨酸丙氨酸3.对照管对照管4.谷氨酸谷氨酸点样点直径点样点直径 0.5cm, 一般一般 点点3-5 滴滴,前一滴干后前一滴干后, 才可点第二滴才可点第二滴.19 2cm3cm灯芯制作灯芯制作 20打孔时打孔时,不要用油笔不要用油笔,孔不要太大孔不要太大.214.茚三酮显色茚三酮显色烘干烘干喷液喷液烘干烘干显色显色22 测量点样原点到各氨基酸测量点样原点到各氨基酸层析斑点中心的距离，

8、计算各层析斑点中心的距离，计算各氨基酸的氨基酸的f f值。值。【实验结果实验结果】23【实验结果实验结果】 用铅笔画出条带的边框，测出表格中的数值，计算用铅笔画出条带的边框，测出表格中的数值，计算R Rf f 值。值。测定参数测定参数测定样品测定样品谷氨酸谷氨酸丙氨酸丙氨酸对照对照点样点到斑纹中心点样点到斑纹中心距离距离 (cm)(cm)点样点到溶剂前沿点样点到溶剂前沿距离距离 (cm)(cm)R Rf f 值值 与已知的标准的氨基酸与已知的标准的氨基酸R Rf f进行对比，指出条带所对应的氨进行对比，指出条带所对应的氨基酸，并根据结果解释转氨作用。基酸，并根据结果解释转氨作用。241.1.匀

9、浆器的正确使用匀浆器的正确使用 . . 2.2.对照管的煮沸时间要充分对照管的煮沸时间要充分 . .3.3.手不要在滤纸上乱摸手不要在滤纸上乱摸 . . 4.4.点样量不可过多，点样过程中应注意不要造成滤点样量不可过多，点样过程中应注意不要造成滤纸污染（手和唾液都含有氨基酸）。纸污染（手和唾液都含有氨基酸）。点样点直径点样点直径 0.5cm, 0.5cm, 一般一般 点点3-5 3-5 滴滴, ,前一滴干后前一滴干后, , 才可点第二滴才可点第二滴. .5 5在滤纸上划线时只需用铅笔，不可用其它笔在滤纸上划线时只需用铅笔，不可用其它笔6 6烘烤时要注意明火。烘烤时要注意明火。7 7点样时毛细管不能交叉污染。点样时毛细管不能交叉污染。 8. 8. 茚三酮的喷量要适中茚三酮的喷量要适中 . .【注意事项注意事项】251 1如果对照管在沸水中煮的时间不够充分，如果对照管在沸水中煮的时间