亲和色谱应用于天然活性成分筛选的研究进展

1、亲和色谱应用于天然活性成分筛选的研究进展摘要亲和色谱法(affiNtychromatography)是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。利用化合物和固定相表面之间的莫种特异性亲和力，将目标化合物从大量无亲和活性的化合物中分离由来。该方法可同时进行色谱分离和活性筛选，作为一种高通量筛选方法广泛应用于各种活性药物的筛选。该文主要针对亲和色谱的发展历史、筛选技术类型及其在天然活性成分筛选中的应用进行了综述。并就其应用前景进行讨论，以期更好地发挥亲和色谱在药物筛选中的应用。关键词亲和色谱；筛选;天然药物；细胞膜色谱；脂筏色谱Progressesinscreeningactivecompou

2、ndsfromherbalmedicinebyaffinitychromatographyFENGYing-shu<sup>/1</sup>,TONGShan-shan<sup>/1</sup>,XUXi-ming<sup>/1</sup>,YUJiang-nan1,2*(1.DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing21000

3、9,China;2. CollegeofPharmacy,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)AbstractAffinitychromatographyisachromatographicmethodforseparatingmoleculesusingthebindingcharacteristicsofthestationaryphasewithpotentialdrugmolecules.Thismethodcanbeperformedasahighthroughputscreeningmethodandachromatographicsep

4、arationmethodtoscreenavarietyofactivedrugs.Thispapersummarizesthehistoryofaffinitychromatography,screeningtechnologyofaffinitychromatography,andapplicationofaffinitychromatographyinscreeningbio-activecompoundsinherbalmedicines，andthendiscussesitsapplicationprospectsinordertobroadenapplicationsofthea

5、ffinitychromatographyindrugscreening.Keywordsaffinitychromatography;screening;herbalmedicines;cellmembranechromatography;lipidraftstationaryphasechromatographydoi:10.4268/cjcmm20150609中药种类众多，配伍复杂，而有效成分是其发挥治疗作用的物质基础，从天然药物中寻找活性成分一直是中药研究的重要方向之一。然而，应用传统的天然药物分离提取方法，即先对其成分进行分离，再结合药理药效试验筛选其中特定的有效成分的方法筛选中药活

6、性成分，周期长，且命中率相对较低。将化合物分离鉴定手段与高通量药物筛选技术相结合，可以直接对天然药物的提取组分进行分离并在线活性检测，不仅可以节约成本，提高天然药物活性筛选速度，同时也在一定程度上阐述作用机制，以保证研究目标的准确性。亲和色谱法（affinitychromatography）是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法<sup>1</sup>。在亲和色谱中，将能与潜在药物（配体）特异结合的物质（配基）固定于色谱填料上，制备色谱柱，混合物经过色谱柱时，能与固定相产生特异结合的物质将在色谱柱上发生保留行为，从而实现混合物间以

7、亲和性为基础的分离。中药提取物可不经过分离步骤，直接在相应的亲和色谱上完成筛选工作。并且药物在亲和色谱模型上的的保留特性（保留时间或容量因子）与药物的活性显著相关。本文主要针对亲和色谱的发展历史、筛选技术类型及其在天然活性成分筛选中的应用进行了综述。1亲和色谱的发展历史亲和色谱的发展经历了上百年的历史<sup>2</sup>,现已成为一个较为成熟的技术，广泛应用于天然生物活性物质的分离和纯化，以及筛选和鉴定。早在1910年，德国药理学家Starkenstein将蔗糖酶抗体吸附在高岭土上，研究了抗体和抗原的相互作用，为亲和色谱的萌芽。192

8、4年，俄罗斯学者Engelhar出提由了“固定化配体原理”，作为分离生物活性物质的方法，为亲和色谱分离方法的根本。随后的60年间，人们相继使用亲和色谱技术，分离纯化淀粉酶、抗体等，在此期间，纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、苯乙烯树脂等基体材料以及各种配基的固定化方法的由现，亲和色谱技术飞速发展。1968年，美国药理学家Cuatrecases和Wilchek扩展了亲和配位体的范围，包括酶、抗原、抗体、激素、维生素、外源凝集素、糖蛋白、膜蛋白、病毒、细胞等，确立生物特效亲和色谱方法。1970年,Cuatrecases提由了“空间间隔臂”概念和方法，成功解决了配位体的立体可接受性问题。1972年，德国学

9、者Wulff提由分子印迹色谱方法，进一步扩展了亲和色谱的应用，使得亲和色谱开始用于药物筛选研究。随后的30年间，共价色谱方法，染料配位色谱方法，电荷转移色谱方法，定位金属例子亲和色谱方法、包合配合物色谱方法相继提由。1978年瑞典学者Ohlson提由以大孔微粒硅胶作为载体的高效液相亲和色谱方法，使得亲和色谱的发展跨入了一个新的时代。上述关于亲和色谱技术的发展虽然并非直接用于天然药物的筛选，但是其对现代药物筛选技术的建立、发展和应用奠定了十分重要的理论基础与技术支撑。经过几十年亲和色谱相关技术的发展，随着HPLC色谱柱制备技术以及各种在线联用技术的广泛应用，以及更多亲和配基的基础研究的深入，近十

10、多年来逐步衍生由了众多基于不同配基的亲和色谱技术，并在天然药物的筛选领域发挥了越来越重要的作用。根据配基的种类和筛选模型的不同，常用的亲和色谱筛选技术包括：以受体、酶、蛋白或DNA为配基的亲和色谱筛选技术、细胞膜色谱筛选技术、脂筏色谱筛选技术、分子印迹技术等。各种亲和色谱技术在药物筛选、模式建立、分离机制等方面的特色不尽相同，其在天然药物发现和鉴定等领域的应用不断拓展，为天然活性成分的发现与临床药物开发提供了极具优势的筛选技术平台。2亲和色谱法筛选技术亲和色谱法将能与潜在药物（配体）特异结合的物质（配基）固定于色谱填料上制备色谱柱，混合物根据色谱保留行为的不同而实现分离。同时，亲和色谱与紫外，

11、MS,NMR等多种检测器联用，实现在线筛选并鉴定中药活性成分。随着人们对亲和色谱认识的加深以及应用的推广，多种配基的亲和色谱以及不同类型的亲和色谱模型陆续被人们应用于中药活性成分的筛选。2.1 受体为亲和配基的色谱筛选近年来，随着药物作用靶点的逐步揭示，以受体为目标筛选中药中的活性成分为中药筛选的基本思路。王序等<sup>3</sup>在20世纪80年代，以11个受体为指标，筛选了150种常用中药的400余种提取物，得到了5000余种生物活性测定结果。为了解中医用药的机制提供了一些实验依据。然而，传统筛选方法仅根据混合物判断作用结果，无法

12、确定具体作用物质，且工作量巨大，耗费人力物力可观。将受体作为亲和色谱的固定相，建立亲和色谱筛选模型，天然药物提取物中能与受体发生特异结合的成分在色谱柱中发生保留，与无色谱保留行为的物质分离开来，从而实现活性筛选和色谱分离同时进行，快速、有效的发现天然药物中的活性物质。目前用于天然药物筛选的受体为配基的亲和色谱模型有肾上腺素受体亲和色谱模型，烟碱受体亲和色谱模型等。由于受体对配体选择性识别作用较强，以受体为配基的亲和色谱在天然药物活性成分筛选中具有较强的选择性且作用机制明确。Wang等<sup>4</sup>将猪重组B2-肾上腺素受体(B2

13、-AR)通过共价键固定在大孔硅胶表面，制成02-AR亲和色谱柱，使用亲和色谱方法与四极飞行时间质谱(Q-TOF-MS)联用，从中药制剂活血胶囊提取物中筛选由有效成分阿魏酸，羟基红花黄色素A(HSYA)和柚皮昔。提取物中具有舒血管作用的B2-AR拮抗剂能与固定相中上的B2-AR发生特异性结合而产生色谱保留，与Q-TOF-MS联用，实现活性化合物的在线分离和鉴定。然而，受体的制备及固定化工艺较为复杂，受体的蛋白质特性导致了亲和色谱使用寿命较短。在受体固定化过程中，受体蛋白覆盖不完全会导致配体与固定相上残留基团发生非特异性结合而导致其保留特性发生变化。郑晓晖等<sup>5

14、</sup>用甘氨酸乙酯对硅胶表面残留的未反应的咪嚏基进行封尾而消除非特异性吸附，并在流动相中加入Tris,EDTA和NaCl等试剂，用于消除配体与固定相上残留氨基和硅羟基之间的静电作用。这样不仅能最大程度地保持受体的活性和选择性，又减小了固定相表面非特异性功能团的影响。所制备的色谱柱可使用1周的时间。合适的固定化受体的发现决定着亲和色谱药物筛选模型的应用。ECalleri等<sup>6</sup>研究了固定化丫型过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR丫）的色谱特性。实验将PPARy以共价键固定在氨丙基二氧化硅粒

15、子表面，作为色谱固定相，同时，将PPAR丫结合在毛细管柱表面建立PPAR丫毛细管亲和色谱以研究不同固定化条件下的亲和色谱特性，以已知配体验证固定化后的PPARy亲和色谱的结合特性。结果表明，建立的2种亲和色谱模型均具有良好的配体保留活性。PPARy在脂肪细胞，肌肉，和巨噬细胞上起着重要的生物学作用，与2型糖尿病，血脂异常，动脉粥样硬化和心血管疾病有直接的关系，研究其固定化后的色谱保留特性，为其用于天然药物筛选奠定基础。止匕外，亲和色谱也可用于亲和配基的寻找。人参皂昔Rg1是传统中药人参的主要有效成分之一，药理活性广泛，具有广泛的益智、抗衰老、增强免疫、神经保护等药理活性，但作用机制尚未有效阐明

16、。刘倩等<sup>7</sup>通过将参皂昔Rg1与环氧活化琼脂糖凝胶6B(epoxyactivatedSe-pharoseTM6B,EAS6B)偶联，制备以人参皂昔Rg1为配基的亲和介质，筛选得到1个Rg1的结合蛋白，为制备类似结构的天然化合物的亲和色谱介质提供参考依据。也为其他各种类中药的筛选提供思路。2.2 酶为亲和配基的色谱筛选酶(enzyme)是生物体新陈代谢过程的催化剂，参与各项体内反应的发生。酶的催化效率极高，并具有高度的专一性。寻找靶向酶的抑制剂或激动剂成为药物筛选的一个新的方向。固定化酶技术的由现与发展解决了酶对环境敏感

17、，无法重复利用等问题，使酶用于筛选中药活性成分成为可能。固定化酶技术使酶通过吸附、共价键结合、交联、包埋等方法定位于载体的一定空间，既保持酶固有的催化活性，又可连续地重复使用。以固定化酶为技术基础的亲和色谱被广泛用于各种酶抑制剂的筛选，如：。-糖昔酶<sup>8-9</sup>、酪氨酸酶<sup>10</sup><sup>11</sup><sup>12</sup>&

18、lt;sup>13</sup>、胰蛋白酶、胆碱酯酶、血管紧张素转化酶等，为各种病理模型如糖尿病、黑斑病、肿瘤、高血压以及神经退行性疾病等提供治疗依据。随着酶与疾病关系的深入研究，以酶为配基的亲和色谱将在药物发现中起到更大的作用。将固定化酶技术与色谱技术以及MS联用，在筛选天然药物活性成分方面有着广泛的应用。黄燕等&比sup>13&比/sup>将ACE固定在壳聚糖微球载体上，制备ACE亲和色谱柱。结合高效液相快速筛选复杂体系中的ACE抑制剂。应用赖诺普利等5种已上市的ACEI对筛选模型进行验证，反映方法具有高度

19、选择性。将此模型应用于中药地龙及山楂筛选，得到5个具有抑制ACE酶活性的有效成分，且具有重现性。YunfangLi<sup>8</sup>等将a-淀粉酶包覆在磁性纳米粒子表面，作为色谱柱固定相，建立亲和色谱系统，与MS联用，从天然药物大叶藤黄中筛选a-淀粉酶抑制剂。筛选由的3种双黄酮类化合物，进一步结合UV,MS和NMR谱而确定了结构。将酶作为固定相，与色谱技术联用，在天然药物活性成分筛选方面具有相当大的优势。游离酶经固定化后保存时间大大增加，对酸、碱、热以及有机溶剂的耐受增加，为不同溶解性质以及提取方式的天然药物的筛选提供了可能，扩大了

20、筛选范围。以酶为配基的亲和色谱筛选系统具有灵敏，高效，特异性强，可重复利用等优点，逐渐成为天然药物高通量筛选不可或缺的重要工具。然而，以酶为亲和配基的色谱筛选系统存在一定的问题，酶的固定化过程不改变酶的一级结构，却可能改变酶的空间结构，而导致酶活性的部分丧失或改变，故筛选机理还有待深入研究。2.3 血浆蛋白为亲和配基的色谱筛选药物进入体内后,与血浆蛋白的结合是一个重要的过程，决定着药物在体内的活性和命运。血浆蛋白结合率(plasmaproteinbinding,PPB)连同溶解性，亲脂性，酸碱性等因素，影响着药物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)。只有游离药物可穿过细胞膜，在体内分布而引起药

21、物的反应。随着游离药物在体内的消除，蛋白结合药物释放由游离药物，作为药物储存器维持游离药物浓度，延长药物作用的持续时间。血浆蛋白结合增加了药代动力学半衰期，但它限制了药物的组织分布。因此，血浆蛋白结合的研究及其在亲和色谱中的应用对天然活性成分的筛选具有重要意义。基于血浆蛋白结合的亲和色谱技术在中药活性成分的研究中有较多的应用。王芳焕等<sup>14</sup>以大孔硅胶为基质，用琰基咪嚏法合成了人血清白蛋白(HSA)色谱填料，用于铁棒锤中活性成分的筛选。该实验选择pH为7.4的磷酸盐缓冲液为流动相，流速0.8mL?min-1,在铁棒锤中提

22、取的总生物碱HSA色谱图中由现2个明显保留，由于配体与蛋白的结合反应较快，而解离较慢，造成峰形拖尾。进一步以反相色谱分离，联用MS检测器，鉴定由了脱乙酰去氧乌头碱、苯甲酰脱氧乌头碱、乌头原碱、16-O-去甲基乌头次碱4种成分。HSA亲和色谱系统一般选用pH为7.4的磷酸盐缓冲液为流动相，加入少量乙睛可以提高流动相的洗脱能力。与药物结合的血浆蛋白主要为HAS,HSA作为固定相广泛应用于药物-蛋白研究中。而乜1-酸性糖蛋白（AGP）与药物的结合也不容忽视，特别是对于碱性药物，AGP为主要结合蛋白<sup>15</sup>。KarineVuig

23、nier等<sup>16</sup>使用HSA和AGP亲和色谱柱，与MS检测器联用，研究亲和色谱对药物蛋白结合能力。比较实验所得结果与文献报道使用平衡透析法等方法所得结果的相关性，结果表明，使用HSA柱得到的蛋白结合能力结果与文献的相关性较高，而AGP柱相关性较弱，而AGP柱的结果却是HSA的补充。KarineVuignier还建立了高通量的药物-蛋白结合筛选方法，每个样品筛选时间小于3min。使用一个流动相梯度适用于所有样品的分析，蛋白结合率相似的药物将在相同的时间段洗脱由来，以此将药物按照与蛋白结合程度的强、中、弱分类。2.4 以DN

24、A为亲和配基的色谱筛选遗传信息载体脱氧核糖核酸（DNA）控制着细胞的结构和功能，在生命过程中起着非常重要的作用。DNA是许多药物的主要作用靶点，小分子与DNA结合的方式主要包括：嵌插作用、沟槽结合、静电结合等非共价结合；共价结合；长距组装；剪切作用等<sup>17</sup>。其中，沟槽结合和嵌插作用不改变DNA的一级结构，且具有选择性，而成为人们关注的热点。近年来人们对药物活性小分子与DNA相互作用模式理解的加深，为以DNA为亲和配基筛选药物提供了可能。Su等<sup>18</sup&g

25、t;使用小牛胸腺DNA(ct-DNA),通过DNA分子一端的磷酸基团与氨丙基硅胶上的氨基形成磷氨键，合成了DNA亲和色谱柱固定相，以紫外检测器检测，用于分离黄连、黄柏和苦参中的活性成分。在流动相的选择上，由于Mg2+可以和DNA分子的磷酸基结合从而起到稳定DNA双链的作用，与活性药物竞争DNA上的亲和位点，故Mg2+的增加降低DNA亲和物质在色谱柱上的保留。乙睛用量的增加也能起到加快洗脱的作用。为了提高复杂样品在DNA柱上的分离效果，使用了逐渐增加Mg2+和乙睛浓度的流动相对黄连等提取物进行了梯度分离。然而，由于含盐流动相的限制，此模型难以和质谱联用，Su等建立亲和色谱/ODS柱二维色谱，且在

26、第一维富集除盐后进行后续分离，与质谱联用，实现了复杂体系样品的高效分离、筛选、活性成分鉴定一体化过程。2.5 细胞膜色谱筛选现代药理研究表明，药物吸收需经过细胞膜的扩散或转运，并与细胞膜上特异性受体或酶结合而发挥药效。因此，化合物的活性与细胞膜的通透性和药物与细胞膜的亲和性密切相关。贺浪冲教授于1996年提由了细胞膜色谱法(cellmembranechromatography,CMC)的概念，将生物活性的细胞膜固定在特定载体表面作为固定相，用液相色谱的方法研究药物与细胞膜及膜受体的相互作用，动态模拟药物在体内的作用过程。现代细胞生物学发现，细胞膜上存在多种受体，单个细胞的受体密度可达10&am

27、p;lt;sup>/1</sup>10<sup>/1</sup>数量级。不同种类以及人体不同部位的细胞膜上存在着不同的受体、离子通道、酶等效应靶点，使用不同部位的细胞膜用于不同药理活性的药物筛选，更贴近天然药物多成分，多靶点的作用概念。细胞膜色谱法作为一种新的药物筛选工具，被广泛用于天然药物的筛选及其与受体亲和力的研究。对于细胞膜色谱法对于中药活性成分的筛选，方艺霖等<sup>19</sup>在综述中总结了几种主要的细胞膜色谱模型：血管细胞膜

28、、心肌细胞膜、胰岛B细胞膜、红细胞膜，以筛选治疗心血管疾病、糖尿病等药物的活性成分。近年来，细胞膜固定相种类的增多使得细胞膜色谱的筛选有了更广泛的应用。如鼠腹腔巨噬细胞CMC模型<sup>20</sup>,人牙周膜细胞膜<sup>21</sup>,肿瘤细胞膜<sup>22</sup>等的由现，使得更多药理活性的药物得以筛选。CMC模型可不经提取分离步骤而直接实现在复杂的体系中筛选生活性成分，简单，快速，有效。药物作用靶点众多，C

29、MC模型最大限度地保持了细胞膜的完整性和膜受体的活性。实现以不同药理活性为指标，选择不同部位以及种类的细胞膜，用以多靶点筛选，提高筛选命中率。该方法具有命中率高、快速、经济、可反复利用等优点。然而，CMC模型仍存在一些问题需要解决。细胞膜为生物组织，相对于一般色谱，膜受体密度较小，柱效较低，载样量较小，且生物膜的特殊性质导致流动相为缓冲盐，与质谱系统不匹配而导致在线鉴定的困难。为解决此问题，王嗣岑等<sup>23</sup>结合柱切换技术，设计了二维液相色谱。以高表达EGFR细胞膜色谱柱为第一维，以反向色谱柱为第二维，与MS检测器联用，筛

30、选独活中的活性成分。在第一维的细胞膜色谱中，中药提取液中与细胞膜特异性结合的物质发生保留，并通过一根反相C18预柱进行富集，富集完成后，切换至第二维的反向色谱柱进行二维分离，并以MS检测器进行分析，直接获得活性成分的结构信息。一、二维色谱分别以水、甲醇-水为流动相，在保证胞膜色谱活性的同时兼顾了与MS检测器的匹配，实现高效分离、筛选、鉴定一体化。应用此二维色谱技术，亦有学者成功建立HepG2细胞膜、牙周韧带细胞膜、A431细胞膜色谱模型，从川柏、苦参、黄苓、红毛七、乌头等天然药物中分离由了抗肿瘤、骨再生活性的有效成分<sup>21-25</sup&am

31、p;gt;。将细胞膜色谱柱与反向柱结合，实现多种活性化合物的在线分离鉴定，为细胞膜色谱在天然药物活性成分筛选中的应用扩展了思路。细胞膜为生物活性成分，在使用过程中，细胞膜蛋白的丢失导致细胞膜色谱柱保留能力变差，重复性得不到保证，且使用寿命较低。为解决此问题，XuanDing等<sup>26</sup>考察细胞膜色谱柱的制备过程，优化了细胞数量，剪切时间，装载流速等参数，并加入4%PFA,使得细胞膜色谱柱的重现性和使用寿命大幅提高。2.6 脂筏色谱筛选脂筏(lipidraft)是细胞膜双层结构内含有特殊脂质和特殊蛋白质的微区域。脂筏和细胞的

32、许多功能，如信号转导、蛋白质和脂类的转运等都相关。研究表明，脂筏对影响肿瘤发生、发展、侵袭的信号转导通路以及凋亡信号通路等多种因素均具有调节作用，因而成为近年来肿瘤治疗研究中的新热点<sup>27</sup>。相比于细胞膜色谱，脂筏色谱增强了筛选的特异性，且使用寿命大大延长。童珊珊等<sup>28</sup>构建抗肿瘤药物的脂筏色谱在线筛选模型(lipidraftstationaryphasechromatography,LRC)。将从U251细胞中提取的脂筏固定于硅胶载体上，制备T

33、rkA(酪氨酸蛋白激酶受体)脂筏色谱柱，用于中药活性成分的筛选。富含TrkA的脂筏色谱柱具有显著的特异性：固定相能与以酪氨酸激酶受体为靶点的药物特异性结合产生保留。TrkA-脂筏色谱柱保存时间为1个月，使用寿命远远优于细胞膜色谱柱。TrkA-脂筏固定相色谱系统具备快速、有效、稳定、特异性强的特点，可用于筛选天然药物中以酪氨酸激酶受体为靶点的先导化合物。用已建立的TrkA-脂筏固定相色谱系统筛选中药五倍子中抗肿瘤活性成分，得到的具有抗肿瘤活性的部位显示由良好的抑制U251肿瘤细胞的毒性。除了参与肿瘤的发生，脂筏和多种疾病的产生密切相关。脂筏通过募集相关的蛋白和酶，致使AB的生成和清除失衡而导致阿

34、尔茨海默病（AD）的发生<sup>29</sup>脂筏参与介导核突触蛋白-a的异常积累，参与路易小体的形成过程，与帕金森病（PD）的发生密切相关<sup>30</sup>脂筏中的一些特定蛋白参与完成胰岛素分泌的转导信号，与糖尿病的发生有直接关系<sup>31</sup>脂筏中的小窝蛋白-3参与心肌发育和能量代谢，和心血管疾病的产生有关，小窝蛋白-1在血管内皮细胞中发挥促动脉粥样硬化作用。另外，脂筏与一些肺部疾病、肝脏疾病甚至眼部

35、疾病都有密切关系。现代药理学对于脂筏的不断研究，为构建其他特异性受体脂筏模型及筛选其他活性成分提供了基础。2.7 分子印迹技术分子印迹技术（molecularimprintingtechnology,MIT）是合成对模板分子具有特定识别能力的聚合物的新型仿生技术。以锁匙作用原理，以目标分子为模板，以共价法或非共价法制备具有高度亲和性的聚合物材料（MIP）,MIP存在于模板分子空间结构互补，官能团相互作用（氢键，离子或范德华力等）的聚合物孔穴，对模板分子具有较强的亲和性及识别能力。用于识别与模板分子构型相同或相似的物质。分子印迹技术通过选取特定的活性成分为模板，用于已知成分或其类似物的富集分离、

36、鉴定和筛选。天然药物成分复杂，活性物质含量很低，传统分离方法无法有效将其分离，造成筛选鉴定的困难。以活性成分类似物作为模板，制备MIP,与质谱联用，实现中药活性成分的快速富集分离和鉴定。谢建春等<sup>32</sup>以骆驼蓬种籽中抗肿瘤活性化合物哈尔明及哈马灵的结构类似物哈尔满作为模板，用非共价键法制备MIPo与大气压电离飞行时间质谱（ESI-TOF）联用，直接分离鉴定了中药骆驼蓬种籽甲醇粗提物中所含的哈尔明及哈马灵2种抗肿瘤活性成分。奥些化合物虽具良好的生物活性，却因为毒性较高或生物利用度低等因素而无法成药，或是因为价格昂贵而限制其

37、使用。分子印迹技术可以此类化合物为模板，从天然药物中筛选结构类似的替代药物，从而获得高效、低毒、高生物利用度的药物。Huang等<sup>33</sup>以没食子酸丙酯为模板，从中药丹参粗提物中筛选抗血小板凝聚活性物质原儿茶酸。袁小红等<sup>34</sup>制备柯里拉京分子印迹聚合物，从中药叶下珠中筛选柯里拉京及其结构类似物。肖淑娟等&比sup>35</sup>从花生壳中分离抗肿瘤活性成分木犀草素。相比于生物亲和色谱，MIP稳定性

38、大大提高，聚合物性质稳定，耐酸、碱，耐高温、高压等。MIP与高效液相具有更好的兼容性：流动相不用局限于生物相亲性的缓冲盐，与紫外、MS等检测器匹配程度增加，MIP耐压可以承受较高的流速，大大缩短了分离时间。然而，分子印迹技术还存在一些问题，MIP对于目标分子的识别主要基于化合物构型，结构特异性较高，在高效富集结构类似物的同时，与药理活性的相关性存在欠缺。目前可供使用的模板分子较少，远远不能满足中草药体系实际应用的需要。且水等极性溶剂对非共价键MIP产生干扰，常用筛选溶剂为甲醇-醋酸（9：1）,而传统天然药物以水提为主，如何能在水溶液中进行应用仍是个难题。2.8 其他亲和配基随着对于天然药物作用

39、原理及特点的深入研究，除了上述亲和色谱筛选模型，更多亲和色谱模型将被用于天然药物活性成分的筛选，如核酸适配体亲和色谱<sup>36</sup>、免疫亲和色谱<sup>37</sup>、金属离子亲和色谱等等。并且随着人们对天然药物认识的加深，天然药物不仅仅局限于植物等草药，而传统中药甲虫类药物，虫草，以及海洋药物也逐渐被研究者重视。由于此类药物含有丰富的蛋白、多糖类结构而使亲和色谱技术在此类药物活性成分筛选上体现由更大的优势。3结论亲和色谱法是一种高通量的药物活性分子筛选方法，其凭借快

40、速，稳定，准确，可靠等优点成为一种重要的药物筛选手段。亲和色谱和液质联用技术相结合，可以实现在线分离，筛选，鉴定一体化。亲和色谱筛选方法利用药物和作用靶点的亲和作用筛选活性分子，为天然药物活性筛选提供了新的途径。亲和色谱筛选技术的发展依赖于对药物作用靶点的基础研究，并为探求药物作用机理提供思路。随着疾病发病机理的深入研究，更多药物作用靶点被发现，同时，更多与天然药物发现有关的新型筛选模型不断由现，势必为亲和色谱技术在天然药物筛选中的应用提供更多策略与思路。参考文献1ClonisYD.Affinitychromatographymaturesasbioinformaticandcombinato

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48、nteractionwithDNAJ.JElectroanalChem,2010,642.18SuX丫，HuLH,KongL,etal.AffinitychromatographywithimmobilizedDNAstationarypHSAeforbiologicalfingerprintinganalysisoftraditionalChinesemedicinesJ.JChromatogrA,2007,1154:132.19方艺霖，张艺，肖小河，等.细胞膜色谱技术用于中药活性成分筛选的研究进展J.中草药，2008,39(7):3.20WangCH,HeLC,WangN,etal.Scr

49、eeninganti-inflammatorycomponentsfromChinesetraditionamedicinesusingaperitonealmacrophage/cellmembranechromatography-offline-GC/MSmethodJ.JChromatogrB,2009,877:3019.21LiuJ,WangSC,SunJY,etal.Screeningofosteoanagenesis-activecompoundsfromScutellariabaicalensisGeorgibyhPDLC/CMC-online-HPLC/MSJ.Fitotera

50、pia,2014,93:105.22ChenXFCaoYLvDYetal.Comprehensivetwo-dimensionalHepG2/cellmembranechromatography/monolithiccolumn/time-of-flightmassspectrometrysystemforscreeninganti-tumorcomponentsfromherbalmedicinesJ.JChromatogrA,2012,1242:67.23王嗣岑，孙萌，张彦民，等.用高表达EGFR细胞膜色谱-HPLC/MS联用快速筛选独活中抗EGFR活性成分J.中国科学，2010,40:75