蛋白质的分离、纯化ppt课件

1、第六章第六章 蛋白质的分别、纯化和表征蛋白质的分别、纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质中的功能团 末端NH2 末端COOH 侧链基团 所以，蛋白质的化学物理性质AA A蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用。B蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团。C结合蛋白质 辅基成分包含可解离蛋白质D末端-COOH, -NH2E蛋白质分子中可解离基团的pK和游离AA中相应基团的pK值完全不一样。在蛋白质分子中遭到临近电荷的影响F蛋白质可看作一个多价离子 蛋白质等电点-在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pH称为蛋白质等电点 等离子点-没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基

2、团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等离子点。特征常数。二蛋白质分子的大小与外形 利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 蛋白质在各种介质中PAGE电泳时，它的迁移率 这样呵斥两个后果：SDS为阴离子，多肽链覆盖上一样密度的负电荷超越蛋白质原有的电荷量，因此掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。因此，一切SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极挪动。 改动了蛋白质单体分子的构象。 SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,长轴长度那么随蛋白质的分子量而成正比例地变化。电泳迁移率与多肽链分子量的对

3、数有以下关系( (七七) ) 毛细管电泳测定蛋白质的分子质量毛细管电泳测定蛋白质的分子质量 毛细管电泳毛细管电泳CECE那么可以在很大那么可以在很大程度上抑制常规方法时间长、灵敏芽低程度上抑制常规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需求纳克量蛋白质，而且还可以子量仅需求纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机准确定量。用积分仪或电脑联机准确定量。 ( (八八) )质谱测定蛋白质分子量质谱测定蛋白质分子量 质谱测定蛋白质分子量是近年来开质谱测定蛋白质分子量是近年来开展的一项新技术，其分辨率和准确度都展的一项新技术，其分辨率和准确度都较前

4、几项技术高。尤其近几年开展起来较前几项技术高。尤其近几年开展起来的磁质谱可准确测定分子质量的磁质谱可准确测定分子质量2000Da2000Da以以下的多肽；而电喷雾质谱下的多肽；而电喷雾质谱ESIESI可以可以测测5 5万万DaDa的蛋白质，而且只需求皮摩尔的蛋白质，而且只需求皮摩尔pmolpmol量的蛋白质，准确度为量的蛋白质，准确度为0.01%0.01%。三蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀1蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是分散系统：分散相是蛋白质分子颗粒，分散介质是水。分散程度-胶体系统分散相质点-真溶液质点是分子，均相系统 分散程度-以分散相质点的直径来衡量 根据分散程度： 分散相质点在胶体系统中

5、坚持稳定需三个条件：a 分散相质点1-100nmb 分散相质点带有同种电荷，相互排斥不聚成颗粒而沉淀c 分散相的质点能与溶剂构成溶剂化层蛋白质： a. 胶体质点的范围 c 丁达尔效应d 布朗运动e 不能透过半透膜2蛋白质的沉淀 沉淀蛋白质的方法： 盐析法： 中性盐NH4SO4，NaSO4，Nacl等 蛋白质脱去水化层优点：不引起蛋白量变性 有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂甲醇，乙醇，丙酮脱去水化层以及降低介电常数而添加带电质点间的相互作用 条件：低温操作 缩短时间 重金属盐沉淀法当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)生成沉淀用途：抢救误服重金

6、属盐的病人生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂 当溶液pHpI 蛋白质带电，溶解度较大pHpI 1 不同蛋白质等电点不同 pI时溶解度最低将蛋白质彼此分开2蛋白质的盐溶和盐析 中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响低浓度时，中性盐可以添加蛋白质的溶解度 盐溶作用机理：蛋白质吸附盐类离子，带电表层使蛋白质分子被此排斥，蛋白质与水分子的作用加强，溶解度提高。同样浓度摩尔数/升的两价离子的中性外，如MgCl2 NH42SO4对蛋白质溶解度的影响效果，要比单价离子的中性盐如NaCl,NH4Cl大得多。 盐析当离子强度添加到足够高时，eg.饱和或半饱和程度，很多蛋白质从水溶液中沉

7、淀出来，这种景象叫盐析。原理大量中性盐的参与，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自在水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子外表的水化层。 盐析法分别、提纯常用方法。坚持蛋白质的天然构象。NH42SO43.有机溶剂分级法作用原理：.有机溶剂的参与改动了介质的介电常数，添加了两个相反电荷之间的吸引力，。蛋白质的外表可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。.有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的构成并沉淀。 聚乙二醇水溶性非离子聚合物可致使蛋白质沉淀。原理：脱去蛋白质的水化层；聚乙二醇与蛋白质亲水基团发生相互作用，并在空间上妨碍

8、蛋白质与水相接近。蛋白质在聚乙二醇中的溶解度与盐浓度，pH，及绝对溶解度无关。其溶解度依赖于聚乙二醇的分子量。4温度对蛋白质溶解度的影响。 0-40摄氏度 大部分球状蛋白质溶解度随温度升高而增大40-50摄氏度 大部分蛋白量变得不稳定,开场变性大多数蛋白质在低温下比较稳定,蛋白质的操作在0摄氏度或更低温度下进展. 糜蛋白酶糜蛋白酶, ,胰蛋白酶及其前体的制备胰蛋白酶及其前体的制备 (三)根据电荷不同的分别方法 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分别蛋根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分别蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。 1 1电泳电泳 在外

9、电场的作用下，带电颗粒，例如在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电形状的蛋白质分子，将向着与其电不处于等电形状的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极挪动，这种景象称电泳性相反的电极挪动，这种景象称电泳(elecctropHoresis)(elecctropHoresis)或离子泳或离子泳(ionpHoresis)(ionpHoresis)。 或从方法学的角度给电泳下定义，电泳是在外电场存在下，利用分子携带的净电荷不同分别分子混合物的一种实验技术。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋曰质、核苷酸和核酸等生物分子的分别分析和制备。 带电颗粒在电场中的泳动速度主要决议于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和外

10、形。颗粒在电场中发生泳动时，将遭到两种方向相反的力的作用：F(电场力)=qE(=qU/s)Ff(摩擦力)=fv这里，q颗粒所带的电量E电场强度或电势梯度U/qU两电极间的电势差(以伏特表示)S= 两电板之间间隔(以厘米表示)f摩擦系数(与颗粒的外形，大小和介质的粘度有关)v颗粒泳动速度(以厘米秒表示 当颗粒以恒稳速度挪动时，那么F-Ff=0，因此，qE=Fv，即，v/E=q/f 在一定的介质中对其一种蛋白质禾说，q/F是一个定值，因此v/E月也是定值，它被称为迁移率或泳动度：u=v/Eu值可以经过实验测得，蛋白质的u值为0.1*10-4 -1.0*10-4 厘米2伏特-1秒-1。蛋白质的泳动度

11、以及pH和离子强度对泳动度的影响都反映某一特定蛋白质的特性。因此电泳不仅是分别蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯厦的重要手段而且也是研讨蛋白质性质很有用的一种物理化学方法。电泳根底：自在电泳挪动界面电泳 a.先在u-形管内使蛋白质溶液和缓冲液之间构成明晰的界面b.加电场c.由于界面处存在浓度梯度，因此产生折射率梯度。利用光学系统可以察看到界面的挪动。每个挪动界面相当于一个特定蛋白质。 区带电泳 是由于在支持物上电泳时各组分因迁移数度不同分布成区带而得名。按支持物介质的物理性状：四类区带电泳：1.滤纸电泳.薄膜电泳(醋酸纤维薄膜电泳, 薄膜电泳)2.粉末电泳:淀粉.纤维层.硅胶粉3.细丝电泳:尼龙丝,人

12、造丝4.凝胶电泳:聚丙烯酰胺.琼脂糖凝胶盘状电泳 在区带电泳根底上开展起来的。支 持 物聚丙烯酰胺凝胶 三种物理效应：1。样品的浓缩效应2。凝胶对分子的挑选效应3。电泳分别的电荷效应 样品分别效果好、分辨率等。 等电聚焦电聚焦 蛋白质混合物的分别是在具有pH梯度的介质中进展的。用聚丙烯酰胺替代蔗糖溶液介质固体化、操作方便、分别快蛋白质聚焦在等于其等电点的pH点处，构成一个很窄的区带。 双向电泳-AA混合物一次电泳不能完全分开,将第一次电泳分开的斑点经过支持介质间的接触吸印转移到第二个支持介质上,旋转90进展第二次电泳,称双向电泳.优点:设备简单.操作方便,样品用量少 1975 1975年，年，

13、O OFarrell Farrell 首先运用双向电泳技术将大首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分别出肠杆菌总蛋白分别出11001100多个蛋白点。后来此技术不多个蛋白点。后来此技术不断用于原核生物和真核生物总蛋白的分别。目前，随断用于原核生物和真核生物总蛋白的分别。目前，随着蛋白组工程的开展，双向电泳技术越来越广泛的用着蛋白组工程的开展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。于发现未知蛋白。 双向电泳由第一向等电聚焦双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)(IEF)电泳和第二向电泳和第二向SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)组成，第一向

14、使组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分别，第二向使分子量不同的等电点不同的蛋白得到分别，第二向使分子量不同的蛋白得到分别，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。蛋白得到分别，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。2 离子交换层析原理：根据蛋白质等电点的差别将不同蛋白质分开。原理：根据蛋白质等电点的差别将不同蛋白质分开。离子交换介质：离子交换介质： (1)(1)离子交换树脂离子交换树脂 (2)(2)离子交换纤维素离子交换纤维素 (3)Sepharose Fast Flow:(3)Sepharose Fast Flow: (4)Sepharose High Performance (4)Sepharose

15、 High Performance：分辨率较：分辨率较F.F.F.F.高高 (5)Mono: HPLC(5)Mono: HPLCI I 分类：分类： 阴离子交换阴离子交换 强度强度 功能功能基团基团 + + DEAE DEAE 中等中等 OCH2CH2NH(CH2CH3)2OCH2CH2NH(CH2CH3)2 + + QAE QAE 强强 OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3 阳离子交换阳离子交换 强度强度 功能功能基团基团 CM CM 弱弱 OCH2COO-OCH2COO- SP SP 强强 CH2CH2CH2SO3-CH2CH2C

16、H2SO3-II II 选择：选择： i i 根据蛋白质的等电点选择介质根据蛋白质的等电点选择介质 ii ii 根据分别目的选择介质根据分别目的选择介质例如：例如： 离子交换纤维素离子交换纤维素纤维素为交换基纤维素为交换基质质原理：具有松散的亲水性网状构造，原理：具有松散的亲水性网状构造，吸较大的外表积，大分子可以自在吸较大的外表积，大分子可以自在经过经过优点：交换容量大优点：交换容量大洗脱条件温暖洗脱条件温暖回收率高回收率高种类多，选择范围广种类多，选择范围广 离子交换葡聚糖基质：交联葡聚糖优点：交换容量比离子交换纤维素大34倍。能根据净电荷分子大小分别 蛋白质混合物的分别由 溶液中的盐离子

17、强度pH 来完成结合力小蛋白质先由层析柱中洗脱出来洗脱时坚持洗脱剂成分不改动改动洗脱剂的盐浓度、PH值 腾跃式分段改动分段洗脱 渐进式延续改动梯度洗脱梯度洗脱优点：分别效果好分辨率高适宜：交换容量小，对盐敏感的离子交换剂 两种混合器: 简单型混合器 复合型混合器 留意的问题：留意的问题： (1) (1) 缓冲液的选择：缓冲液的选择： 阳离子：阳离子：TrisTris 阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐 (2) (2) 介质处置：介质处置： 阳离子：阳离子： Na+ Na+ 型型 阴离子：阴离子： Cl- Cl- 型型 (3) (3) 洗脱：洗脱：原理：原理：i i改动盐浓度改动盐

18、浓度 iiii改动改动pHpH值值方式：方式：i i分步洗脱分步洗脱 iiii梯度洗脱梯度洗脱 (4) (4) 介质再生介质再生四蛋白质的选择吸附分别 吸附层析-利用吸附力的强弱不同而到达分别的目的。吸附剂-结晶磷酸钙及羟基磷灰石蛋白质分子中带负电荷的基团，与羟基磷灰石的钙离子结合。用磷酸缓冲液羟基磷灰石-分别核酸：病毒。活性C 硅酸 AL2O3磷酸钙-吸附层析五根据对配基的生物学特异性的分别方法-亲和层析 根底： 基于蛋白质所具有的生物学特异性。它与另一种称配基的分子能特异而非共价的结合配基：能被生物大分子所识别并于之结合的原子，原子团，和分子：酶-底物;激素-受体；抗原：抗体。原理 先把待

19、提纯的某一蛋白质的特异配基，经过适当的化学反响共价的衔接到像琼脂糖凝胶一类的载体外表的功能基上，在配基与多糖基质间迁入一个衔接臂使配基于凝胶之间坚持足够的间隔，不改动载体外表的空间位阻妨碍等待分别的大分子与其配基的结合。 待提纯的蛋白质样品+多糖资料待提纯的蛋白质样品与配体结合，吸附，在琼质糖颗粒上结合在柱上的蛋白其它蛋白可以用自在配体的分子溶液脱下来1 原理：利用蛋白质特异性进展分别。2 介质预备： 载体选择：Sepharose 4BSepharose CL4B,Sepharose Fast Flow,Sepharose High Performance 空间臂：偶联小分子时需求空间臂，常为

20、双功能基团，如己二氨或氨基己酸。 3 3 配基选择：配基选择： 抗原抗原抗体，酶抗体，酶抑制剂，抑制剂，酶酶底物，激素底物，激素受体，金属结合蛋受体，金属结合蛋白白螯和剂，螯和剂， 含巯基蛋白含巯基蛋白HgHg或含或含巯基分子，凝集素巯基分子，凝集素糖蛋白糖蛋白4 4 偶联：偶联： I I 溴化氰法：与溴化氰法：与氨基或氨基或氨氨基偶联。基偶联。 效率高，反响时间短，条件温暖，适效率高，反响时间短，条件温暖，适于多种蛋白。于多种蛋白。 II II 环氧氯丙烷法：与环氧氯丙烷法：与NH2, OH, NH2, OH, SH SH 偶联偶联 偶联时需剧烈条件，如偶联时需剧烈条件，如pH11pH11，

21、40405050，适于特别稳定的蛋白，适于特别稳定的蛋白六蛋白质含量的测定与纯度的鉴定六蛋白质含量的测定与纯度的鉴定 分析任务： 一测定蛋白质的总量；二测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量；三鉴定最后制品的纯度。 四活性测定一浓度一浓度/ /含量测定含量测定 1 1 紫外法：蛋白质的芳香族氨基紫外法：蛋白质的芳香族氨基酸在酸在280nm 280nm 有吸收。有吸收。 2 Lowry2 Lowry法：蛋白质在碱性溶液中法：蛋白质在碱性溶液中与铜构成复合物，此复合物及芳香族与铜构成复合物，此复合物及芳香族氨基酸复原磷钼酸磷钨酸试剂产生氨基酸复原磷钼酸磷钨酸试剂产生蓝色。蓝色。 3 Bradfor

22、d3 Bradford法：蛋白质与考马斯法：蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量。亮蓝染料的结合量。 4 4 凯氏定氮法凯氏定氮法 5 5 双缩脲法双缩脲法二测定蛋白质混合物中某一特定二测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量蛋白质的含量-具有高度特异性的生物学方法酶活性激素活性抗原-抗体三蛋白质制品纯度的鉴定 1 1 电泳法：电泳法： SDSSDSPAGEPAGE， IEFIEF 2 2 化学法：化学法： N N端测定，端测定， C C端测定端测定 3 3 仪器法：仪器法： HPLCHPLC，质谱，氨基酸组成分析，质谱，氨基酸组成分析 4 4 物理方法：物理方法： 沉降分析沉降分析 分散分析分散分析 四活性测定四活性测定 1 激酶：标志ATP 2 磷酸化酶：定磷 3 利用靶酶活性 4 氧化复原酶 5 ELISA溶菌酶：溶菌酶： 分子量为分子量为14KD14KD， 等电点为等电点为1111，耐热，耐热，可以水解革兰氏阳性细菌的细胞壁，鸡可以水解革兰氏阳性细菌的细胞壁，鸡蛋清中含量丰富。蛋清中含量丰富。举例：从鸡蛋壳膜中制备溶菌酶举例：从鸡蛋壳膜中制备溶菌酶