仪器第二讲20110916教材

1、1生物大分子的仪器分离与分析生物大分子的仪器分离与分析 生物反应器工程国家重点实验室生物反应器工程国家重点实验室仪器分析平台仪器分析平台2开始上课，请同学们将手机开到静音、振开始上课，请同学们将手机开到静音、振动档，最好是关机！动档，最好是关机！3个人介绍个人介绍 姓名：邱勇隽姓名：邱勇隽Email：电话：电话：642539042001-2009年在凯赛生物研发中心工作年在凯赛生物研发中心工作9年年4基本概念基本概念 化学分析起源于化学分析起源于17世纪，是借助化学反应和化学计量学的关系来确定世纪，是借助化学反应和化学计量学的关系来确定被分析物质含量的一类分析方法，测定时需要使用化学试剂、天平

2、和被分析物质含量的一类分析方法，测定时需要使用化学试剂、天平和玻璃器皿等，主要用于物质的常量测定。玻璃器皿等，主要用于物质的常量测定。仪器分析起源于仪器分析起源于19世纪，是利用复杂的专有设备，通过测定物质某特世纪，是利用复杂的专有设备，通过测定物质某特定物理、化学和生物学性质的参数及其变化，并与标准物质对比，来定物理、化学和生物学性质的参数及其变化，并与标准物质对比，来分析样品的化学成分、某成分含量、化学结构、序列信息等。每种仪分析样品的化学成分、某成分含量、化学结构、序列信息等。每种仪器分析有其相对独立的理论基础和方法原理。器分析有其相对独立的理论基础和方法原理。分析化学被不严格的区分为化

3、学分析和仪器分析两大类。分析化学被不严格的区分为化学分析和仪器分析两大类。化学分析是仪器分析的基础：仪器分析样品的预处理方法，与化学分化学分析是仪器分析的基础：仪器分析样品的预处理方法，与化学分析的预处理分析方法析的预处理分析方法相似相似；仪器分析是；仪器分析是相对相对测量的方法，需要标准物测量的方法，需要标准物质对仪器进行校正，用标准样品与待测样品进行比较，从而获得测定质对仪器进行校正，用标准样品与待测样品进行比较，从而获得测定的结果，而标准物质的标定通常用化学分析的方法来标定的结果，而标准物质的标定通常用化学分析的方法来标定 5基本概念基本概念 仪器分析主要涉及结构分析、定性分析、序列分析

4、、定量分析和半定量分析。仪器分析主要涉及结构分析、定性分析、序列分析、定量分析和半定量分析。结构分析：利用各种仪器分析手段方法（包括元素分析、光谱分析、核结构分析：利用各种仪器分析手段方法（包括元素分析、光谱分析、核磁共振谱分析、质谱分析、旋光分析、磁共振谱分析、质谱分析、旋光分析、X射线衍射分析等）对未知物质射线衍射分析等）对未知物质的分子和晶体结构（包括分子的各个基团和所有原子）进行测定、拼接、的分子和晶体结构（包括分子的各个基团和所有原子）进行测定、拼接、分析和表征的整个过程。分析和表征的整个过程。序列分析：是指测定某类物质连接顺序的分析形式。序列分析：是指测定某类物质连接顺序的分析形式

5、。定性分析：是指分析确定样品中某物质是否存在的分析形式。定性分析：是指分析确定样品中某物质是否存在的分析形式。定量分析：是指测定样品中某物质含量多少的分析形式。定量分析：是指测定样品中某物质含量多少的分析形式。半定量分析：将一定范围内的定量分析分成若干等级并依次表明相对含半定量分析：将一定范围内的定量分析分成若干等级并依次表明相对含量的多寡，定量分析的粗化、定性分析的细化量的多寡，定量分析的粗化、定性分析的细化6基本概念基本概念 仪器分析的优点：仪器分析的优点： 自动化、智能化、准确度高、重复性好、分自动化、智能化、准确度高、重复性好、分析时间短、检测通量高、工作强度小析时间短、检测通量高、工

6、作强度小仪器分析的特点；仪器分析的特点； 困难性：知识面广；复杂性：种类繁多；重困难性：知识面广；复杂性：种类繁多；重要性：应用广泛、操作简便；神秘性：价格要性：应用广泛、操作简便；神秘性：价格昂贵、操作复杂昂贵、操作复杂7仪器分析的分类仪器分析的分类类型类型 原理原理 相关方法相关方法 光学分析光学分析 通过测定电磁辐射的某些基本性质（反射、折射、通过测定电磁辐射的某些基本性质（反射、折射、干涉、衍射、散射和偏振等）的变化来分析待测物干涉、衍射、散射和偏振等）的变化来分析待测物质质 折射法、干涉法、散射浊度法、旋光法、折射法、干涉法、散射浊度法、旋光法、X射线衍射法、射线衍射法、电子衍射法电

7、子衍射法 光谱分析光谱分析 以光的吸收、发射和拉曼散射等作用建立的分析方以光的吸收、发射和拉曼散射等作用建立的分析方法，通过检测光谱的波长和强度来进行分析法，通过检测光谱的波长和强度来进行分析 原子发射光谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、紫原子发射光谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、紫外外-可见光谱法、红外吸收光谱法、激光拉曼光谱法、核磁可见光谱法、红外吸收光谱法、激光拉曼光谱法、核磁共振波谱法、荧光光谱法、分子荧光光度法、分子磷光光共振波谱法、荧光光谱法、分子荧光光度法、分子磷光光度法、化学发光法度法、化学发光法 电化学分析电化学分析 通过物质在溶液中的电化学性质及其变化来进行分通过

8、物质在溶液中的电化学性质及其变化来进行分析的方法析的方法 电导分析法、电位分析法、电解分析法、库仑分析法、伏电导分析法、电位分析法、电解分析法、库仑分析法、伏安法、极谱分析法安法、极谱分析法 色谱分析色谱分析 利用待测物质的物理化学和生物学特性的不同在线利用待测物质的物理化学和生物学特性的不同在线分离待测的混合物，然后进行检测（在线）或衍生分离待测的混合物，然后进行检测（在线）或衍生后检测的仪器分析方法后检测的仪器分析方法 气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱、超高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱、超高效液相色谱、电动色谱电动色谱 电泳分析电泳分析 利用待测物质的电迁移特性的不同在线分

9、离待测的利用待测物质的电迁移特性的不同在线分离待测的混合物，然后进行在线检测混合物，然后进行在线检测 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、自由流电泳技术、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、自由流电泳技术、等电聚焦电泳、高效毛细管电泳、双向（等电聚焦电泳、高效毛细管电泳、双向（2D）凝胶电泳、）凝胶电泳、DNA序列分析仪、微流控芯片电泳序列分析仪、微流控芯片电泳 质谱分析质谱分析 依据待测物质的质量与电荷比的不同来进行分离和依据待测物质的质量与电荷比的不同来进行分离和分析的方法。用于定性、同位素分析、有机物的结分析的方法。用于定性、同位素分析、有机物的结构分析和蛋白质分析等构分析和蛋白质分析等

10、 单聚焦质谱、双聚焦质谱、飞行时间质谱、四极杆质谱单聚焦质谱、双聚焦质谱、飞行时间质谱、四极杆质谱 放射化学分析放射化学分析 利用核衰变过程中产生的放射性辐射来进行分析的利用核衰变过程中产生的放射性辐射来进行分析的方法方法 同位素示踪法、放射分析法同位素示踪法、放射分析法 热分析热分析 通过测定物质的某些性质如质量、体积、热导或反通过测定物质的某些性质如质量、体积、热导或反应热与温度之间的动态关系，可进行成分分析，但应热与温度之间的动态关系，可进行成分分析，但多用在热力学、动力学和化学反应机理等方面的研多用在热力学、动力学和化学反应机理等方面的研究究 差热分析、差示扫描量热法、热重量法、测温滴

11、定法差热分析、差示扫描量热法、热重量法、测温滴定法 8仪器分析的发展趋势仪器分析的发展趋势提高检测灵敏度提高检测灵敏度仪器分析智能化仪器分析智能化仪器分析仪器分析“现场化现场化”和和“小型化小型化” 仪器分析微型化仪器分析微型化仪器分析民用化仪器分析民用化9分析仪器的性能指标分析仪器的性能指标 精密度：分析数据的精密度指同一台分析仪器的同一方精密度：分析数据的精密度指同一台分析仪器的同一方法多次测定得到数据间的一致程度法多次测定得到数据间的一致程度灵敏度：指区别具有微小浓度差异分析能力的度量，取灵敏度：指区别具有微小浓度差异分析能力的度量，取决于校准曲线的斜率和仪器设备的重现性或精密度。决于校

12、准曲线的斜率和仪器设备的重现性或精密度。检出限：物质检出的最低浓度范围检出限：物质检出的最低浓度范围动态范围（线性范围）动态范围（线性范围）响应速度：指仪器对检测信号的反应速度，定义为仪器响应速度：指仪器对检测信号的反应速度，定义为仪器达到信号总变化量一定百分数所需的时间达到信号总变化量一定百分数所需的时间分辨率：指仪器鉴别由两组近组分产生信号的能力，不分辨率：指仪器鉴别由两组近组分产生信号的能力，不同类型仪器分辨率的指标不同同类型仪器分辨率的指标不同国内外对于各种分析仪器性能及指标尚无统一认识和标准，不同类型仪器、不同国内外对于各种分析仪器性能及指标尚无统一认识和标准，不同类型仪器、不同厂家

13、生产的同一类型仪器，甚至同一厂家生产的同一类型不同型号仪器常提供不厂家生产的同一类型仪器，甚至同一厂家生产的同一类型不同型号仪器常提供不同性能指标或参数。同性能指标或参数。 10分析仪器的性能指标分析仪器的性能指标 灵敏度：仪器的灵敏度用校准灵敏度表示，即灵敏度：仪器的灵敏度用校准灵敏度表示，即校准曲线的斜率，随所选用的校准物质不同，校准曲线的斜率，随所选用的校准物质不同，灵敏度的数据不同，仪器制造商提供的灵敏度灵敏度的数据不同，仪器制造商提供的灵敏度数据，一般应提供测试条件和校准物质。数据，一般应提供测试条件和校准物质。检出限：仪器的检出限需要指出所使用检出限：仪器的检出限需要指出所使用/针

14、对的针对的物质物质 11分析仪器的性能指标分析仪器的性能指标 Cm灵敏度，灵敏度，LOQ：定量检测最低浓度，一般定义为：定量检测最低浓度，一般定义为10倍空白重复测定标准倍空白重复测定标准差，这点相对标准差约差，这点相对标准差约30%，随着浓度增加而迅速降低，随着浓度增加而迅速降低，LOL：检测上限，：检测上限，标准曲线偏离线性响应的浓度范围，相对标准偏差是标准曲线偏离线性响应的浓度范围，相对标准偏差是100% CmLOQLOL线性范围线性范围12分析仪器的性能指标分析仪器的性能指标 仪器定量校准方法：内标法和外标法仪器定量校准方法：内标法和外标法内标法：标准物质和被测定物质不是同一物质内标法

15、：标准物质和被测定物质不是同一物质外标法：标准物质与被测定物质是同一物质外标法：标准物质与被测定物质是同一物质13分析方法的建立分析方法的建立 方法的可靠性方法的可靠性 通过实验数据的统计分析来实现的，主要论证的通过实验数据的统计分析来实现的，主要论证的参数有参数有专一性、灵敏度（检出限）、定量限、精专一性、灵敏度（检出限）、定量限、精密度或稳定性、准确度、耐用性、线性范围、标密度或稳定性、准确度、耐用性、线性范围、标准曲线、回归方程和回收率等准曲线、回归方程和回收率等 14分析方法的建立分析方法的建立明确目标明确目标收集信息收集信息选择方法选择方法预实验预实验实验实验撰写撰写SOP预实验方案

16、预实验方案专一性专一性灵敏度灵敏度定量限定量限线性范围线性范围操作通量操作通量实验方案实验方案精密度精密度准确度准确度耐用性耐用性条件实验条件实验15分析方法的建立分析方法的建立明确目标：明确目标：样品的来源：发酵液、成品、三废样品的来源：发酵液、成品、三废杂质（干扰物质）：结构类似物、降解产物杂质（干扰物质）：结构类似物、降解产物样品形式：固体、液体、气体、混合物样品形式：固体、液体、气体、混合物样品中待测物质的浓度：灵敏度、浓度变化范围样品中待测物质的浓度：灵敏度、浓度变化范围对分析结果的要求：稳定性、准确度、精确度等对分析结果的要求：稳定性、准确度、精确度等样品分析的通量要求：操作时间要

17、求样品分析的通量要求：操作时间要求成本要求成本要求16分析方法的建立：分析方法的建立：发酵液中葡萄糖含量的测定发酵液中葡萄糖含量的测定明确目标：明确目标：样品的来源：发酵液样品的来源：发酵液杂质（干扰物质）：菌体、其他有机物杂质（干扰物质）：菌体、其他有机物样品形式：液体或固（菌体）液混合物样品形式：液体或固（菌体）液混合物样品中待测物质的浓度：样品中待测物质的浓度：0.1-30g/L结果的要求：过程控制，相对量，误差可大结果的要求：过程控制，相对量，误差可大样品分析的通量要求：样品分析的通量要求：ASAP、同时测定、同时测定5个样个样成本要求成本要求17分析方法的建立分析方法的建立收集信息（

18、查阅文献）：收集信息（查阅文献）：待测物质的理化性质待测物质的理化性质可能存在杂质的理化性质可能存在杂质的理化性质待测物质的标准待测物质的标准/通用测定方法及其适用范围通用测定方法及其适用范围可选方法的理论基础可选方法的理论基础阅读仪器的使用说明书阅读仪器的使用说明书18文献检索要注意以下问题：文献检索要注意以下问题：在建立分析方法时要注重寻找经典的分析方法，要注重从书本上系在建立分析方法时要注重寻找经典的分析方法，要注重从书本上系统地收集相关理论知识而不是仅仅看统地收集相关理论知识而不是仅仅看PaperPaper在使用每台设备之前要仔细的阅读说明书在使用每台设备之前要仔细的阅读说明书/ /操

19、作手册，而不是简单操作手册，而不是简单的向师兄的向师兄/ /师姐学习师姐学习文献仅供参考，不能认为文献上的东西就一定是对的，很多的方法、文献仅供参考，不能认为文献上的东西就一定是对的，很多的方法、结果在未经过亲手验证之前，不能假设它就是对的结果在未经过亲手验证之前，不能假设它就是对的要确保检索数据的准确性：通过多个来源数据的一致性来保证数据要确保检索数据的准确性：通过多个来源数据的一致性来保证数据的准确性，开题报告所有引用的数据都必须标明出处；的准确性，开题报告所有引用的数据都必须标明出处；看文献要注重看他人的实验思路、实验方法和实验设计，以及结果看文献要注重看他人的实验思路、实验方法和实验设

20、计，以及结果的表示方法、对于结果的讨论分析，而不是仅仅关注他人的实验结的表示方法、对于结果的讨论分析，而不是仅仅关注他人的实验结果（水平）；果（水平）；对于需要参考的重要方法，要注意该方法的适用范围，要查到最原对于需要参考的重要方法，要注意该方法的适用范围，要查到最原始的文献。始的文献。分析方法的建立分析方法的建立19分析方法的建立：分析方法的建立：发酵液中葡萄糖含量的测定发酵液中葡萄糖含量的测定理化性质理化性质分析方法分析方法常用范围常用范围右旋糖右旋糖/旋光性旋光性旋光仪旋光仪纯品纯度测量纯品纯度测量单醛基单醛基/还原性还原性水杨酸比色法水杨酸比色法发酵过程检测发酵过程检测单醛基单醛基/还

21、原性还原性硫酸铜滴定法硫酸铜滴定法纯品纯度测量纯品纯度测量底物单一性底物单一性酶电极法酶电极法血糖测定血糖测定/发酵发酵底物单一性底物单一性酶反应比色法酶反应比色法血糖测定血糖测定/发酵发酵结构专一性结构专一性HPLC糖类混合区分糖类混合区分20分析方法的建立：分析方法的建立：发酵液中葡萄糖含量的测定发酵液中葡萄糖含量的测定选择方法选择方法 可以选择水杨酸法或者酶法，如果发酵过程只可以选择水杨酸法或者酶法，如果发酵过程只关注总糖，并且希望测试耗材费用较低，可以关注总糖，并且希望测试耗材费用较低，可以选择水杨酸法，如果发酵过程需要知道确切的选择水杨酸法，如果发酵过程需要知道确切的葡萄糖浓度，可以

22、选择酶法葡萄糖浓度，可以选择酶法21分析方法的建立：预实验分析方法的建立：预实验预实验方案预实验方案实验方案包括的内容实验方案包括的内容：目的和意义、实验原：目的和意义、实验原理、实验方案、所需资源、日程安排、实验理、实验方案、所需资源、日程安排、实验预期结果、参考文献预期结果、参考文献预实验方案考察的因子：专一性、灵敏度、预实验方案考察的因子：专一性、灵敏度、定量限、线性范围（初步）、操作通量定量限、线性范围（初步）、操作通量22分析方法的建立分析方法的建立 ：专一性：专一性专一性（专一性（Specificity）：又叫特异性，是指在其他成分（如背景物质、降解产物、）：又叫特异性，是指在其他

23、成分（如背景物质、降解产物、杂质等）存在的情况下，所采用的分析方法仍然能够准确测定某物质的特性，杂质等）存在的情况下，所采用的分析方法仍然能够准确测定某物质的特性，反映采用的分析方法用于复杂样品检测时互相干扰程度的量度。如果仪器分析反映采用的分析方法用于复杂样品检测时互相干扰程度的量度。如果仪器分析方法缺少专一性，则该方法很难准确检测某物质的含量，在分析方法建立过程方法缺少专一性，则该方法很难准确检测某物质的含量，在分析方法建立过程中，要首先确定其专一性。考察的手段主要有鉴定反应、杂质测定和含量测定中，要首先确定其专一性。考察的手段主要有鉴定反应、杂质测定和含量测定等方法。如方法的专一性较低，

24、应采用多种分析方法加以补充。等方法。如方法的专一性较低，应采用多种分析方法加以补充。鉴定反应：待测物质应能与可能存在的其他物质（杂质、降解产物等）相区分，鉴定反应：待测物质应能与可能存在的其他物质（杂质、降解产物等）相区分，在不含待测物质的条件下，样品分析呈阴性。在不含待测物质的条件下，样品分析呈阴性。含量测定：在杂质可获得的情况下，在样品中加入杂质，将测定结果与未加杂含量测定：在杂质可获得的情况下，在样品中加入杂质，将测定结果与未加杂质的样品相比较，考察测定结果是否受干扰。使用此方法应注意排除杂质加入质的样品相比较，考察测定结果是否受干扰。使用此方法应注意排除杂质加入过程对样品的干扰，如杂质

25、加入后样品体积、重量的变化从而导致待测物质在过程对样品的干扰，如杂质加入后样品体积、重量的变化从而导致待测物质在体系中的浓度发生改变。体系中的浓度发生改变。杂质测定：在知道样品杂质的情况下，往样品中加入一定量的杂质，考察杂质杂质测定：在知道样品杂质的情况下，往样品中加入一定量的杂质，考察杂质能否与待测物质分离。能否与待测物质分离。对比测定：将测定的结果与另一个验证了的方法进行结果比较，观察两种方法对比测定：将测定的结果与另一个验证了的方法进行结果比较，观察两种方法检测的结果是否一致。检测的结果是否一致。23分析方法的建立分析方法的建立 ：灵敏度：灵敏度 灵敏度又叫检出限或检测限，是指样品中被测

26、物质能够灵敏度又叫检出限或检测限，是指样品中被测物质能够被可靠检测出的最低值，为某种检测方法检测在所述条被可靠检测出的最低值，为某种检测方法检测在所述条件下对样品待测物质的最少物质或最低物质浓度的能力，件下对样品待测物质的最少物质或最低物质浓度的能力，为一种限度试验的参数。为一种限度试验的参数。 对不同的检测方法，灵敏度有不同的表示方式。在仪器对不同的检测方法，灵敏度有不同的表示方式。在仪器分析中，用于能够显示基线噪声的分析方法，即将已知分析中，用于能够显示基线噪声的分析方法，即将已知低浓度的样品测定出的信号值与空白样品测定出的信号低浓度的样品测定出的信号值与空白样品测定出的信号值进行比较，计

27、算出能够被可靠检出的待测物质的最低值进行比较，计算出能够被可靠检出的待测物质的最低浓度或量，一般习惯上将信噪比（浓度或量，一般习惯上将信噪比（S/N）为）为3:1或或2:1时对时对应的浓度或注入物质的量确定为灵敏度或检出限。应的浓度或注入物质的量确定为灵敏度或检出限。 在进行仪器分析的检出限测定时，应附测试的图谱，说在进行仪器分析的检出限测定时，应附测试的图谱，说明测试过程和检出限的结果。明测试过程和检出限的结果。24分析方法的建立：定量限分析方法的建立：定量限 定量限的确定方法：一般以信噪比（定量限的确定方法：一般以信噪比（S/N）等于）等于10：1时对时对应的物质浓度或注入仪器的量进行确定

28、应的物质浓度或注入仪器的量进行确定与检出限的区别：定量限规定的最低测得浓度应符合一定与检出限的区别：定量限规定的最低测得浓度应符合一定的精密度和准确度的要求。的精密度和准确度的要求。定量限是指样品中待测物质能够被定量测定的最低量或最低定量限是指样品中待测物质能够被定量测定的最低量或最低浓度，且其测定的结果还需对应一定的准确度和精密度，定浓度，且其测定的结果还需对应一定的准确度和精密度，定量限一般用于仪器分析，在进行杂质和降解产物测定方法研量限一般用于仪器分析，在进行杂质和降解产物测定方法研究时，应确定定量限。究时，应确定定量限。25分析方法的建立分析方法的建立 ：线性范围：线性范围线性范围线性

29、范围线性：是指在设计的检测范围内，仪器分析的结果与样品线性：是指在设计的检测范围内，仪器分析的结果与样品中的实际待测物质浓度呈直接正比例的关系的程度。也就中的实际待测物质浓度呈直接正比例的关系的程度。也就是待测物质的浓度或质量的变化与仪器测试结果（或仪器是待测物质的浓度或质量的变化与仪器测试结果（或仪器响应信号）呈线性的关系。响应信号）呈线性的关系。线性范围：是指在能够达到规定的精密度、准确度和线性线性范围：是指在能够达到规定的精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的最高到最低限待测物质浓度或的条件下，测试方法适用的最高到最低限待测物质浓度或量的区间。量的区间。应根据分析方法的具体应用和线

30、性、准确度、精密度的结应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度的结果和要求来确定线性范围。果和要求来确定线性范围。26分析方法的建立分析方法的建立 ：精密度：精密度重现性（重现性（Reproductivity）：是指在不同实验室，不同检测人员测定结果的精）：是指在不同实验室，不同检测人员测定结果的精密度。当分析方法被法定为标准采用时，应进行重现性实验。如建立药典的法密度。当分析方法被法定为标准采用时，应进行重现性实验。如建立药典的法定分析方法时，通过不同实验室之间的协同检测得出重现性的结果报告，在协定分析方法时，通过不同实验室之间的协同检测得出重现性的结果报告，在协同检验的过程中，重现性

31、结果要求记载在法定方法建立的起草说明中。同检验的过程中，重现性结果要求记载在法定方法建立的起草说明中。中间精密度：是指在同一实验室中，不同时间由不同检测人员在不同检测设备中间精密度：是指在同一实验室中，不同时间由不同检测人员在不同检测设备上测定结果的精密度。为考察随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行上测定结果的精密度。为考察随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度的测试，变动因素为日期、不同分析人员和不同设备。中间精密度的测试，变动因素为日期、不同分析人员和不同设备。重复性（重复性（Repeatability）：是指在相同条件下，由一个分析人员重复测定所得）：是指在相同条件下

32、，由一个分析人员重复测定所得结果计算出的精密度。考察重复性时，需要在给定的范围内至少用结果计算出的精密度。考察重复性时，需要在给定的范围内至少用9次测定结次测定结果进行评价，如制备果进行评价，如制备3个不同浓度的样品，每个样品测定个不同浓度的样品，每个样品测定3次；或将待测物质的次；或将待测物质的浓度当作浓度当作100%，用至少测定，用至少测定6次的结果进行评价。次的结果进行评价。精密度是指在规定的条件下同一样品平行分析结果相互之间的接近程度。精密度一精密度是指在规定的条件下同一样品平行分析结果相互之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准差和相对标准差（般用偏差、标准差和相对标准差（CV）表示。

33、平行的实验数据越靠近某一平均值，）表示。平行的实验数据越靠近某一平均值，实验方法的稳定性越高，数据的精密度越高；相反，数据的离散度也越大，数据的实验方法的稳定性越高，数据的精密度越高；相反，数据的离散度也越大，数据的精密度越低，方法的稳定性越差。对不同的检测条件，精密度有不同的表现方式，精密度越低，方法的稳定性越差。对不同的检测条件，精密度有不同的表现方式，即重现性、重复性、中间精密度。即重现性、重复性、中间精密度。27分析方法的建立分析方法的建立 ：准确度：准确度含量测定方法的准确度：某物质用已知纯度的对照平或样含量测定方法的准确度：某物质用已知纯度的对照平或样品进行测定，或用本法所得的结果

34、与建立了准确度的另一品进行测定，或用本法所得的结果与建立了准确度的另一方法测定的结果进行比较，利用这种对比的方法来推测分方法测定的结果进行比较，利用这种对比的方法来推测分析方法的准确度析方法的准确度制备制备3个不同浓度的样品，各个样品测定个不同浓度的样品，各个样品测定3次，对比次，对比要评估一种新方法准确度的高低，只能将其与一种经典可要评估一种新方法准确度的高低，只能将其与一种经典可靠的方法比较，这一经典的方法被认定能够测定样品的真靠的方法比较，这一经典的方法被认定能够测定样品的真值。值。准确度是指用该方法平行测定所得的均数与样品真实值或参考准确度是指用该方法平行测定所得的均数与样品真实值或参

35、考值的吻合程度，一般用百分回收率表示。根据考察对象的不同，值的吻合程度，一般用百分回收率表示。根据考察对象的不同，有不同的准确度，即含量测定方法的准确度和杂质定量测定的有不同的准确度，即含量测定方法的准确度和杂质定量测定的准确度。准确度。28分析方法的建立分析方法的建立A低精密度低精密度低准确度低准确度C高精密度高精密度低准确度低准确度D高精密度高精密度高准确度高准确度B低精密度低精密度高准确度高准确度29分析方法的建立分析方法的建立 ：耐用性：耐用性耐用性是指在检测条件稍有变化的情况下，待测物质的检耐用性是指在检测条件稍有变化的情况下，待测物质的检测结果不受影响的承受程度。耐用性高表明工作环

36、境的变测结果不受影响的承受程度。耐用性高表明工作环境的变化对分析方法没有明显的负面影响，同时表明实验室和操化对分析方法没有明显的负面影响，同时表明实验室和操作人员之间在常规条件下测试结果的稳定性好。作人员之间在常规条件下测试结果的稳定性好。开始建立新方法时，就应考虑新方法的耐用性的考察，如开始建立新方法时，就应考虑新方法的耐用性的考察，如检测条件要求严格，就应该在新方法开发中说明。典型的检测条件要求严格，就应该在新方法开发中说明。典型的变动因素包括被测定溶液的稳定性、样品提取次数和时间变动因素包括被测定溶液的稳定性、样品提取次数和时间等。如在液相色谱中，典型的条件变化因素是流动相的组等。如在液

37、相色谱中，典型的条件变化因素是流动相的组成和成和pH值、不同厂商或不同批号的色谱柱、柱温、进样值、不同厂商或不同批号的色谱柱、柱温、进样口和检测器的温度等。口和检测器的温度等。30分析方法的建立：实验操作分析方法的建立：实验操作实验操作的描述再怎么细致也不过分；实验操作的描述再怎么细致也不过分；实验操作过程前要注意操作条件的验证和确认；如：实验操作过程前要注意操作条件的验证和确认；如：摇床温度摇床温度30 实验操作要具有可重复性，不仅仅是自己可以在一实验操作要具有可重复性，不仅仅是自己可以在一定的误差范围内重复实验结果，同时其他人按照实定的误差范围内重复实验结果，同时其他人按照实验操作进行，可

38、以得到同样的实验结果；验操作进行，可以得到同样的实验结果；在实验操作上，细节决定成败！在实验操作上，细节决定成败！31分析方法的建立：数据记录分析方法的建立：数据记录规范规范实验记录实验记录 实验记录需要记录：实验记录需要记录：实验思路、实验方法、实验设计、实验实验思路、实验方法、实验设计、实验现象、原始数据、实验结果、结果讨论现象、原始数据、实验结果、结果讨论 实验记录就是一份完整的实验报告实验记录就是一份完整的实验报告32分析方法的建立分析方法的建立 ：撰写：撰写SOP 分析方法建立的完成，不是以可以测定某物质的浓度为分析方法建立的完成，不是以可以测定某物质的浓度为标准，而是以完成该分析方

39、法的标准，而是以完成该分析方法的SOP为标准为标准SOP中必备的要素：中必备的要素：分析方法建立的依据：国标、药典分析方法建立的依据：国标、药典分析方法所需使用的仪器、设备、器皿分析方法所需使用的仪器、设备、器皿样品的取样量设定（线性范围）样品的取样量设定（线性范围）详细的操作步骤（包括器皿的清洁方法）详细的操作步骤（包括器皿的清洁方法）每个操作参数都有宽容度每个操作参数都有宽容度每个工艺条件都有数据支持每个工艺条件都有数据支持1. 方法验证的原始数据方法验证的原始数据33分析方法的建立分析方法的建立 ：撰写：撰写SOP 验证验证SOP的好坏最简单的方法就是让其他人按照的好坏最简单的方法就是让

40、其他人按照SOP操作能否得到和撰写人一样的结果操作能否得到和撰写人一样的结果 在在SOP撰写的时候要注意细节的描写，避免阅读的人撰写的时候要注意细节的描写，避免阅读的人产生歧义产生歧义 如：水浴温度如：水浴温度30 34仪器分析的一般过程仪器分析的一般过程样品的采集样品的采集样品的预处理样品的预处理（待测物的衍生化）（待测物的衍生化）仪器的校正仪器的校正样品的测量与表征样品的测量与表征分析数据的处理与结果输出分析数据的处理与结果输出35仪器分析的一般过程：取样仪器分析的一般过程：取样样品的采集：样品必须具有代表性，并且不能被污染，样品的采集：样品必须具有代表性，并且不能被污染，也不应有组分的损

41、失；也不应有组分的损失；根据实验目的合理设计取样时间及取样量以及样品保藏根据实验目的合理设计取样时间及取样量以及样品保藏方式；方式；步步留样步步留样，样品完成分析后要保留一定时间，以便于出样品完成分析后要保留一定时间，以便于出现问题后可以追溯分析现问题后可以追溯分析标签清晰：标明物料名称（标签清晰：标明物料名称（What）、人（）、人（Who）、时）、时间（间（When）36仪器分析的一般过程：预处理仪器分析的一般过程：预处理样品的预处理：样品体系复杂，不利于进行物理学特性样品的预处理：样品体系复杂，不利于进行物理学特性的测定，必须进行预处理，以消除干扰、富集待测成分、的测定，必须进行预处理，

42、以消除干扰、富集待测成分、保护分析仪器；保护分析仪器；分离除杂有离线分离和在线分离，离线分离如离心去除分离除杂有离线分离和在线分离，离线分离如离心去除菌体、过滤除水等，在线分离如菌体、过滤除水等，在线分离如HPLC测定混合糖、测定混合糖、GC测定小分子有机物等；测定小分子有机物等；常见的预处理手段：稀释、过滤常见的预处理手段：稀释、过滤/离心、加热离心、加热/制冷、调制冷、调pH、遮蔽遮蔽衍生：某些待测物质没有很强的物理学特性，需要衍生；衍生：某些待测物质没有很强的物理学特性，需要衍生；或者通过衍生将待测物和杂质进行区分或者通过衍生将待测物和杂质进行区分37仪器分析的一般过程：仪器校正仪器分析

43、的一般过程：仪器校正仪器校正：分析仪器在使用前或使用时必须经过校正；仪器校正：分析仪器在使用前或使用时必须经过校正；校正的内容：零点校正、线性校正、满度校正等校正的内容：零点校正、线性校正、满度校正等校正需要使用标准物质校正需要使用标准物质 物质纯度的分类：试剂级（物质纯度的分类：试剂级（AR、BR、CP、GR）、工）、工业级业级注意某些设备在使用前需要预热注意某些设备在使用前需要预热仪器的校正需要仔细阅读相关说明书仪器的校正需要仔细阅读相关说明书/操作手册操作手册38仪器分析的一般过程：样品测量仪器分析的一般过程：样品测量仪器使用前仔细阅读说明书仪器使用前仔细阅读说明书/操作手册操作手册使用

44、过程中严格遵守使用过程中严格遵守SOP样品多的时候要注意编号，避免混淆结果样品多的时候要注意编号，避免混淆结果39仪器分析的一般过程：数据处理仪器分析的一般过程：数据处理要注重记录和保存原始数据，如要注重记录和保存原始数据，如HPLC、GC的图谱，而不仅仅是记录实验最终结果的图谱，而不仅仅是记录实验最终结果注重有效数字位数及其所表示的意义注重有效数字位数及其所表示的意义要注重数据处理过程中的误差传递要注重数据处理过程中的误差传递要以图、表等直观的形式表达数据，同类数要以图、表等直观的形式表达数据，同类数据超过三个，必须作图表示据超过三个，必须作图表示40 有效数字：实际能测到的数字，反映测量的

45、准有效数字：实际能测到的数字，反映测量的准确程度，有效数字保留的位数，应根据分析方确程度，有效数字保留的位数，应根据分析方法和仪器准确度来确定，应使数值中只有最后法和仪器准确度来确定，应使数值中只有最后一位是可疑的；一位是可疑的； 数字数字“0”0”作为普通数字使用，是有效数字，作作为普通数字使用，是有效数字，作为定位数字使用，不是有效数字；为定位数字使用，不是有效数字； pHpH的有效数字的有效数字 有效数字的运算：绝对误差最大者为标准有效数字的运算：绝对误差最大者为标准仪器分析的一般过程：有效数字仪器分析的一般过程：有效数字41 一个没有经过验证的分析方法，是无法确保结果一个没有经过验证的

46、分析方法，是无法确保结果的可信度的！的可信度的！ 知道如何建立一个适当的分析方法知道如何建立一个适当的分析方法 要准确的表述实验结果要准确的表述实验结果 要养成仔细阅读设备说明书要养成仔细阅读设备说明书/ /操作手册的习惯操作手册的习惯总结总结42紫外紫外- -可见吸收光谱分析法可见吸收光谱分析法 概概 述述 光吸收的基本定律光吸收的基本定律 紫外可见光分光光度计紫外可见光分光光度计 定性与定量分析定性与定量分析43定义定义 基于物质对光的选择性吸收而建立起来基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法，包括比色法、可的分析方法称为吸光光度法，包括比色法、可见分光光度法及紫外分光

47、光度法等。采用分光见分光光度法及紫外分光光度法等。采用分光光度计对物质吸光度进行测定，从而求出物质光度计对物质吸光度进行测定，从而求出物质含量的方法，称之为分光光度法。含量的方法，称之为分光光度法。44紫外吸收光谱：分子价电子（最外层电子）能级跃迁。紫外吸收光谱：分子价电子（最外层电子）能级跃迁。波长范围：波长范围：100-760 nm.(1) 远紫外光区远紫外光区: : 100-200nm (2) 近紫外光区近紫外光区: : 200-400nm(3)可见光区可见光区: :400-760nm 250 300 350 400nm1234e e 可用于结构鉴定和定量分析。可用于结构鉴定和定量分析。

48、4546 紫外紫外-可见吸收光谱分析法是利用物质的分子可见吸收光谱分析法是利用物质的分子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析的方法。行定性分析、定量分析及结构分析的方法。 按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法光度法(200-400nm)和可见分光光度法和可见分光光度法(400-760nm)，合称为紫外，合称为紫外可见分光光度法可见分光光度法(200-760nm)。 分光光度法是在比色法分光光度法是在比色法( colorimetry)的基础的基础上发展起来的。上发展起来的。 47分

49、光光度法分光光度法与与比色法区别比色法区别 比色法只限于在可见光区，分光光度法则可以比色法只限于在可见光区，分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。扩展到紫外光区和红外光区。 比色法用的单色光是来自滤光片，谱带宽度从比色法用的单色光是来自滤光片，谱带宽度从40120nm，精度不高，分光光度法则要求近，精度不高，分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过于真正单色光，其光谱带宽最大不超过35nm，在紫外区可到，在紫外区可到1nm以下，来自棱镜或光以下，来自棱镜或光栅，具有较高的精度。栅，具有较高的精度。 48紫外紫外可见分光光度法特可见分光光度法特点点仪器设备和操作都比较简单，费用少

50、，分析速度较快。仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度较快。灵敏度较高。灵敏度较高。有较好的选择性。通过适当地选择测量条件，一般可有较好的选择性。通过适当地选择测量条件，一般可在多种组分共存的体系中，对某一种物质进行测定。在多种组分共存的体系中，对某一种物质进行测定。精密度和准确度较高。在仪器设备和其他测量条件较精密度和准确度较高。在仪器设备和其他测量条件较好的情况下，其相对误差可减小到好的情况下，其相对误差可减小到1一一2。 用途广泛。医药、化工、冶金、环境保护、地质等诸用途广泛。医药、化工、冶金、环境保护、地质等诸多领域多领域-已成为必不可少的测试手段之一。已成为必不可少的测试手段之一

51、。无机和有机物质无机和有机物质-定性和定量测定定性和定量测定,结构分析结构分析。49 理论上将具有同一波长的光称为单色光理论上将具有同一波长的光称为单色光，由不由不同波长的光组成的光称为复合光。同波长的光组成的光称为复合光。 人眼能感觉到的光称为可见光人眼能感觉到的光称为可见光，它的波长范围它的波长范围约为约为400760nm。白光白光(日光、白炽灯光、日日光、白炽灯光、日光灯光等光灯光等)是由各种不同色光按一定强度比例是由各种不同色光按一定强度比例混合而成的。混合而成的。 一束白光通过三棱镜可分为红、橙、黄、绿、一束白光通过三棱镜可分为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等七种色光，这七种色光可以混合

52、青、蓝、紫等七种色光，这七种色光可以混合为白光。实验证明，如果把适当的两种色光按为白光。实验证明，如果把适当的两种色光按一定强度比例混合，也可以成为白光，这两种一定强度比例混合，也可以成为白光，这两种色光称为互补色光。色光称为互补色光。 日光等白光是一对对互补色光按适当的强度比日光等白光是一对对互补色光按适当的强度比例混合而成的。例混合而成的。50 物质的颜色和对光的选择性吸收物质的颜色和对光的选择性吸收 物质呈现的颜色与光有着密切的关系物质呈现的颜色与光有着密切的关系-与光的组与光的组成和物质本身的结构有关。成和物质本身的结构有关。 当光束照射到物质上时，物质对于不同波长的光当光束照射到物质

53、上时，物质对于不同波长的光的吸收、透射、反射、折射的程度不同，而使物的吸收、透射、反射、折射的程度不同，而使物质呈现不同的颜色。质呈现不同的颜色。 对固体物质来说，当白光照射到物质上时，如果对固体物质来说，当白光照射到物质上时，如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果完全反射，则呈现白色；如果对各种波长的光果完全反射，则呈现白色；如果对各种波长的光均匀吸收则呈现灰色；如果选择地吸收某些波均匀吸收则呈现灰色；如果选择地吸收某些波长的光，则呈现反射或透射光的颜色。长的光，则呈现反射或透射光的颜色。 51 对溶液来说，溶液呈现不同的颜色是由于溶液中的

54、对溶液来说，溶液呈现不同的颜色是由于溶液中的质点质点(离子或分子离子或分子)对不同波长的光具有选择性吸收而对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。引起的。 当白光通过某种溶液时，如果它选择性地吸收了白当白光通过某种溶液时，如果它选择性地吸收了白光中某种色光，则溶液呈现透射光的颜色，也就是光中某种色光，则溶液呈现透射光的颜色，也就是说，溶液呈现的是它吸收光的互补色光的颜色。物说，溶液呈现的是它吸收光的互补色光的颜色。物质呈现颜色与吸收光波长的关系见表质呈现颜色与吸收光波长的关系见表 互补色光图 紫青蓝青蓝黄橙红白光绿52物质的颜色与吸收光颜色和波长的关系物质的颜色与吸收光颜色和波长的关系物质的颜色

55、物质的颜色 吸收光吸收光颜色颜色波长（波长（nm）黄绿黄绿 紫紫400-450 黄黄蓝蓝450-480橙橙青蓝青蓝480-490红红青青490-500紫红紫红绿绿500-560紫紫黄绿黄绿560-580蓝蓝黄黄580-600青蓝青蓝橙橙600-650青青红红650-76053吸收光谱曲线吸收光谱曲线 如果将各种波长的单色光依次通过某一固定浓度的有如果将各种波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度(即吸光即吸光度度 A)，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一

56、条曲线，称为吸收光谱曲线一条曲线，称为吸收光谱曲线(简称吸收曲线简称吸收曲线)。从曲线可。从曲线可以清楚地看到该有色溶液对光的吸收情况。以清楚地看到该有色溶液对光的吸收情况。吸收光谱图示意吸收光谱图示意 KMnO4 溶液的光吸收曲线溶液的光吸收曲线 54 吸收峰（吸收峰（1）-最大吸收波长最大吸收波长( max)，谷（，谷（2）-最低吸收波长最低吸收波长( min)； 肩峰（肩峰（3） ； 末端吸收（末端吸收（4） 。 图图12是四个不同浓度是四个不同浓度 KMnO4溶液的光吸收曲线溶液的光吸收曲线。55从图上可以看到：从图上可以看到： KMnO4溶液对不同溶液对不同 波长的光吸收情况不同。波

57、长的光吸收情况不同。 对波长为对波长为525nm的绿色的绿色 光吸收最多，在吸收曲线上有一高峰，而对红色光和光吸收最多，在吸收曲线上有一高峰，而对红色光和紫色光吸收很少，几乎能完全透过，因此紫色光吸收很少，几乎能完全透过，因此KMnO4溶液溶液呈紫红色；呈紫红色； 不同浓度不同浓度KMnO4溶液的吸收曲线形状相似，最大吸收溶液的吸收曲线形状相似，最大吸收波长不变。可作为物质定性分析的依据；波长不变。可作为物质定性分析的依据； 同一物质不同浓度的溶液，在一定波长处吸光度随浓同一物质不同浓度的溶液，在一定波长处吸光度随浓度增加而增大。若在最大吸收波长处测定吸光度，灵度增加而增大。若在最大吸收波长处

58、测定吸光度，灵敏度最高。这个特性可作为物质定量分析的依据。敏度最高。这个特性可作为物质定量分析的依据。 56紫外、可见吸收光谱法研究的主要对象紫外、可见吸收光谱法研究的主要对象 几乎所有有机分子的紫外、可见吸收光谱都是几乎所有有机分子的紫外、可见吸收光谱都是由于由于n n 和共扼的和共扼的 跃迁产生。并随着跃迁产生。并随着共轭系统延长，其最大吸收波长向长波方向移动。共轭系统延长，其最大吸收波长向长波方向移动。因此因此紫外、可见吸收光谱法主要研究醛、酮、紫外、可见吸收光谱法主要研究醛、酮、 、 - -不饱和醛酮、芳香化合物、杂环化合物、共扼多不饱和醛酮、芳香化合物、杂环化合物、共扼多烯等化合物。

59、烯等化合物。57紫外光谱电子跃迁类型紫外光谱电子跃迁类型 ： n*跃迁跃迁 *跃迁跃迁 饱和化合物无紫外吸收饱和化合物无紫外吸收 电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系 根据分子结构根据分子结构推测可能产生的电子跃迁类型；推测可能产生的电子跃迁类型； 根据吸收谱带波长和电子跃迁类型根据吸收谱带波长和电子跃迁类型 推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）58朗伯朗伯比耳定律比耳定律 分光光度法的定量依据是朗伯分光光度法的定量依据是朗伯比耳定律比耳定律（Lambert-Beers Law ） Alg（I0/I）K

60、CL式中：式中：I0为入射光强度；为入射光强度； I为透射光强度；为透射光强度； A为吸光度；为吸光度； L为液层厚度为液层厚度(即光程长度即光程长度)； C为溶液浓度；为溶液浓度； K为吸光系数；为吸光系数； 上式是朗伯上式是朗伯比耳定律的数学表达式，其物理意义比耳定律的数学表达式，其物理意义为：为：当一束平行单色光通过均匀的有色溶液时，溶液当一束平行单色光通过均匀的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。 朗伯朗伯比耳定律不仅适用于有色溶液，也适用于其比耳定律不仅适用于有色溶液，也适用于其它它均匀、非散射的吸光物质均匀、非散射