a班课件实验gfp细胞转染

1、GFP转染哺乳动物细胞实验转染哺乳动物细胞实验 和细胞的传代培养实验和细胞的传代培养实验 实验课流程安排1.分组：A1A152.移液枪的介绍和熟悉: 三种规格的移液枪（P1000, P200, P20）； 刻度的调节；Tip头的使用。3. 实验内容简介4.实验原理和应用的介绍【转染（转染方式的介绍；脂质体转染的原理；脂质体的特点）；荧光蛋白、表达质粒及其应用】5. 转染的实验步骤6.实验的时间安排和注意事项（超净台操作）7.荧光显微镜的构造、使用及注意事项8.超净台内操作及注意事项9.细胞计数与传代GFP转染哺乳动物细胞实验 转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新

2、的遗传标志的过程 pEGFP-N1载体载体带有荧光蛋白的空质粒（看作携有外源基因的质粒） HeLa Cells人宫颈癌细胞系是一种人工培养，具有无限增殖能力的细胞， 1951年诞生至今已经整整60年了。在医学界，Hela细胞被广泛应用于肿瘤研究、生物实验或者细胞培养，已经成为医学研究中非常重要的工具。HilyMax 基因转染试剂 日本研发的一种新型阳离子脂质体 贴壁或悬浮细胞的瞬转及稳转 适用于含血清的培养基， 毒性低，效率高且稳定 适用于siRNAOpti-MEM Opti-MEM 无血清培养基是 EMEM 的改良型，其中使用了 HEPES 和碳酸氢钠进行缓冲，并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠

3、、L-谷氨酰胺、微量元素和生长因子。 在含血清培养基中生长的大多数细胞都能转移到 Opti-MEM 培养基中。 EMEM（Eagles minimum essential medium )最低必需培养液。DMEM是在其基础上增加了各成分的用量，又可分为高糖型（葡萄糖含量4500mg/l使用与生长较快，附着性差的肿瘤细胞）和低糖型（葡萄糖含量1000mg/l)。 操作步骤 1Hela细胞准备： 40%-90% 2形成DNA-HilyMax转染复合物 分别将冰浴中的3ul HilyMax（脂质体） , 5ul pEGFP-N1 （质粒载体）加入120ul opti-MEM（培养液）中 ，轻柔混匀，

4、在室温下静置15分钟 3 将DNA-HilyMax混合液全部加入Hela细胞培养皿中，轻缓混匀，做上标记 4培养：放置于37，5%CO2培养箱培养 5检测：转染后24至72小时观察 要求:两人一组，每小组不得超过5分钟(看好时间) 穿鞋套戴口罩入内；操作前手用75%酒精消毒。 操作在台内无菌进行关于转染（transfection）关于荧光蛋白关于脂质体转染法实验原理和应用的介绍实验原理和应用的介绍关于转染（关于转染（transfection）DNA小片段插入体细胞或细胞系的过程，指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程 Transfection is the process of

5、deliberately introducing nucleic acids into cells. The term is used notably for non-viral methods in eukaryotic cells. Genetic material (such as supercoiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected.Transfection of animal cells typically involves openi

6、ng transient pores or holes in the cell membrane, to allow the uptake of material. Chemical-based transfection：calcium phosphate ， liposomes Non chemical methods： Electroporation Particle-based methods：gene gun Viral methods：viral transduction Other (and hybrid) methods： nucleofection； heat shock. 转

7、染的方法转染的方法 转化(transformation) 指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程 转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程 转导( transduction )由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是细菌之间传递遗传物质的方式之一（其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中）。脂质体（liposome）是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。最初，人们只是运用脂质体膜拟生物膜，研究膜的构造及功能，而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质

8、进入细胞的载体。 阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂质体复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞。 其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达 。瞬转 若此DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达，称“瞬时转染(transient transfection) 外源DNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达。细胞可以快速表达，迅速合成小量蛋白，但通常只持续几天。 适用于验证质粒表达和监测转染步骤的

9、效率。可以用报告基因确定优化条件。稳转 若与宿主细胞DNA整合并随后者的复制而复制称稳定转染(stable transfection) 。 大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释，仅小部分整合到基因组上。如若建立稳定转染的细胞系形成需数周。需要用抗药性筛选靶细胞，并酶切测序鉴定。 根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。转染对细胞的要求：转染对细胞的要求：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。高的转染效率需要一定的

10、细胞密度，一般的转染试剂都会有专门的说明。转染对转染对DNA的要求：的要求： 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质、无RNA和其它化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。目前大多采用进口的提取纯化试剂盒。 报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因， 是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因. 把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产

11、物来标定目的基因的表达行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。调控。 常用的报告基因系统常用的报告基因系统: 半乳糖苷酶报告系统半乳糖苷酶报告系统 荧光素酶报告系统荧光素酶报告系统 荧光蛋白报告系统荧光蛋白报告系统(GFP)等等绿色萤光蛋白绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称，简称GFP，最早在一种学名最早在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因的水母中发现。其基因所产生的蛋白质是一个由所产生的蛋白质是一个由238个氨基酸残基组成的单链个氨基酸残基组成的单链 ，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。在蓝色波长范围的

12、光线激发下，会发出绿色荧光。GFP的化学性质相当稳定，其变性需要在的化学性质相当稳定，其变性需要在90，或，或pH12的条件下用的条件下用6mollL盐酸胍处理。盐酸胍处理。GFP的生色基团附着于的生色基团附着于-螺旋上，是蛋白质自身催化环化螺旋上，是蛋白质自身催化环化的结果，由于环化是一个有氧过程，的结果，由于环化是一个有氧过程， O2使使Tyr66脱氢氧化脱氢氧化形成生色团。因此在严格厌氧条件下形成生色团。因此在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光不能形成荧光 关于荧光蛋白关于荧光蛋白(reporter gene)利用利用DNA重组技术，将目的基因与重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因

13、，转染合适的基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于体观察。由于GFP相对较小，只有相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能后不影响自身的发光功能 。除用于特定蛋白的标记定位外，除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等胞骨架、质膜、细胞核等等 。GFP还常被用作荧光探针。利用信号转导中信号分子的迁移功能，将荧还常被用作荧光探针。利用信号转

14、导中信号分子的迁移功能，将荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。 例：在一例：在一96孔板中培养细胞，并以一编码孔板中培养细胞，并以一编码hGR GFP蛋白的质粒转染该蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段内被证实，根据荧光分布即可推断哪一种药的过程可实时或在某一时段内被证实，根据荧光分布即可推断哪一种药物

15、具有与物具有与hGR配体相类似的功能。配体相类似的功能。关于荧光蛋白关于荧光蛋白pEGFP-N1载体具有以下几方面特点：载体具有以下几方面特点： 该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一达的因素之一 含有高效的功能强大的启动子含有高效的功能强大的启动子SV40和和PCMV，可以使目的，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达基因在增殖的细胞中稳定表达 具有多克隆位点，便于目的基因的插入具有多克隆位点，便于目的基因的插入该载体具有

16、该载体具有neo基因，可以采用基因，可以采用G418来筛选已成功转染了来筛选已成功转染了该载体的靶细胞该载体的靶细胞 这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达 back载体名称：载体名称：pEYFP-C1载体类型：哺乳动物细胞表达载体载体类型：哺乳动物细胞表达载体载体大小：载体大小：4.7kb 载体宿主：大肠杆菌，哺乳动物细胞（载体宿主：大肠杆菌，哺乳动物细胞（E.coli, Mammalian cells）细菌抗性：卡纳（细菌抗性：卡纳（kan）真核筛选标记：新霉素（真核筛选标记：新霉素（Neomycin）5 测序引物：测序引物：E

17、GFP-N Sequencing Primer (#6479-1) 3 测序引物：测序引物：EGFP-C Sequencing Primer (#6478-1)载体描述：载体描述：encodes an enhanced yellow-green variant of the Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP). 该载体表达一个增强信号的黄色萤光蛋白，插入的外源基因位于黄色萤光该载体表达一个增强信号的黄色萤光蛋白，插入的外源基因位于黄色萤光蛋白基因的蛋白基因的3端，因此表达的蛋白为萤光蛋白在端，因此表达的蛋白为萤光蛋白在N端，外源基

18、因在端，外源基因在C端。该类端。该类载体可用于检测蛋白的定位，分析蛋白在细胞中的运输，以及不同蛋白的共载体可用于检测蛋白的定位，分析蛋白在细胞中的运输，以及不同蛋白的共定位等等定位等等 pEYFP-C1, PEGFP-N1 两个载体都是可以用来表达融合荧光蛋白的目两个载体都是可以用来表达融合荧光蛋白的目的蛋白载体，只是的蛋白载体，只是pEYFP-C1靶蛋白结合在靶蛋白结合在C端端,而而pEGFP-N1的靶蛋白结合在的靶蛋白结合在N端，端， 在用在用pEYFP-C1 构建荧光蛋白融合表达载体时，目构建荧光蛋白融合表达载体时，目的基因直接连在多克隆位点后，很方便，而在用的基因直接连在多克隆位点后，

19、很方便，而在用pEGFP-N1 构建荧光蛋白融合表达载体时构建荧光蛋白融合表达载体时,需要把目需要把目的基因后的终止密码子去掉的基因后的终止密码子去掉,并且读码框要和荧光并且读码框要和荧光蛋白的起始密码子相匹配蛋白的起始密码子相匹配。荧光蛋白显微观察荧光蛋白显微观察实验内容实验内容20X实验目的实验目的1、学习通过荧光显微镜观察细胞内的荧光蛋白学习通过荧光显微镜观察细胞内的荧光蛋白2、熟练掌握动物细胞的传代培养和细胞计数、熟练掌握动物细胞的传代培养和细胞计数3、学会相关实验结果的分析、学会相关实验结果的分析荧光蛋白显微观察和细胞的传代培养实验（二）荧光蛋白显微观察和细胞的传代培养实验（二） 荧

20、光蛋白显微观察和细胞的传代培养实验（二）荧光蛋白显微观察和细胞的传代培养实验（二） 传代培养的实验原理传代培养的实验原理传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作(本次实验因条件限制，只能在一个模拟的环境下进行实验) 贴壁细胞消化后的应用：贴壁细胞消化后的应用：除了继续传代培养外，贴壁细胞消化后还可有许多其他的应用。1、计数、计算细胞活力，了解细胞的生长状况。2、制备细胞悬液，以备后期的继续实验。（重新铺板，MTT实验；标记、流式分析、分选；爬片、免疫荧光；电转；提取和分离；洗涤、动物注射等）*一）细胞的传代和计数的实验步骤一）细胞的传代和计数的实验步骤实验内容实验内容1倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代。 2关闭超