植物原生质体培养与遗传操作

1、第十章植物原生质体培养与遗传操作第一节原生质体研究概况一、植物原生质体的概念原生质体 (protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。二、植物原生质体研究进展1880 年， Hanstein首次使用原生质体(protoplast)一词。1960 年， Cocking 首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。1971 年， Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培养再生植株。1985 年， Fujimura et al.世界第一例禾谷类作物水稻原生质体培养获得再生植株。1986 年， Spangenberg et al.通过甘蓝型油菜单个原生质体培养获得

2、再生植株。据统计，目前已有49 个科， 146 个属的 320 多种植物经原生质体培养获得再生植株（1993 ），其中主要以农作物和经济作物为主。第二节植物原生质体分离植物原生质体是去除细胞壁的细胞或是一个被质膜包被的“裸露细胞”（见图 7.1 ），分离具有活力的原生质体是培养成功的关键。早期（19 世纪末）植物原生质体用机械法进行分离，但易破碎，获得率低，程序繁琐，且应用材料有很大局限性，仅限于液泡化程度较高的细胞或长形细胞组织，如叶片、果实的表皮等。1960 年，英国植物生理学家Cocking首次用纤维素酶降解番茄幼苗根尖细胞得到原生质体，从而开创了用酶解法分离植物原生质体的新时期。目前用

3、酶解法可从许多植物的任何一部分组织获得具有活力的原生质体。图 7.1植物原生质体产量高、 质量好、 活性强、 能进行分裂并形成愈伤组织或胚状体是原生质体培养成功的基础。影响原生质体产量和质量的因素很多，主要是基因型、外植体、酶的种类与组合、酶液的渗透压、原生质膜的稳定剂、酶解时间与温度以及分离与纯化方法等。一、基因型与外植体的选择一般而言，植物的各个器官如根、茎、叶、果实、种子、子叶、下胚轴及愈伤组织和悬浮培养细胞都可以作为分离原生质体的起始材料。但若要通过原生质体培养进行植物品种改良，十分重要的是基因型的选择与确定，应从主栽品种和将要推广品系中选择合适的基因型。其次是起始材料的选择应着重于容

4、易获得、产量高、质量好并易分裂的原生质体。紫花苜蓿原生质体分离纯化研究表明，在同一种分离纯化方法下， 不同品种叶片原生质体的产量明显不同。Algonquin的原生质体产量明显高于品种N4，说明基因型是获取原生质体产量高低的关键因素（见图 7.2 ）。此外，外植体生理年龄对原生质体的产量也有很大影响。 紫花苜蓿品种 Oneida 的不同苗龄叶片，在同一浓度酶液处理下原生质体的产量表现不同， 3 周苗龄叶片原生质体的产量要比 4 周苗龄叶片高（见图 7.3 ）。14.83.62.40.04meth 3/enz A meth 2/enz Ameth 1/enz A纯化方法图 7.2不同纯化方法对紫花

5、苜蓿不同基因型N4 和Algonquin 原生质体产量的影响（引自 Lev ée， et al ，2003）3周4周苗龄图 7.3 紫花苜蓿品种 Oneida 不同苗龄叶片对原生质体产量的影响二、分离植物原生质体的酶构成植物细胞壁的三个主要成分是：纤维素，占细胞壁成分的25% 50%； 半纤维素，占细胞壁成分的53% 左右；果胶质，占细胞壁成分的5% 左右。因此，分离植物原生质体的酶有三种，即纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。一般认为原生质体的分离，纤维素酶和果胶酶是必要的。但对有些植物材料，还要加入半纤维素酶。酶液的浓度（见图7.3和图 7.4 ）和分离纯化方法（见图7.4 ）对原生质

6、体产量有明显影响。酶液浓度较高时，处理同一品种同一外植体获得原生质体的产量较高。图 7.4 酶液浓度对紫花苜蓿品种 N4 叶片原生质体产量的影响（引自 Lev ée， et al ，2003）3. 渗透压的稳定剂合适的渗透压是保证原生质体完整性的前提。细胞去壁后获得的原生质体只有质膜包被，所以，它的稳定性必须通过调节渗透压来维持，否则分离出的原生质体容易破碎或萎缩。常用的稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖等，浓度一般为0.4 0.6 mol/L ，加入酶液、洗液和培养基中。为提高原生质膜的稳定性，常加入CaCl2（ 50 100 mmol/L ）、KH2 PO4、 MES（

7、 2吗啡啉乙基磺酸） 、葡聚糖、硫酸钾，从而提高原生质体的产量和活力。4.原生质体的游离（ 1）材料的预处理暗处理、 预培养及低温处理可提高原生质体的分裂率。研究表明， 对于龙胆试管苗的叶片，只有用4 C低温处理后得到的原生质体才能分裂；甘蔗必须先在黑暗条件下培养12 h ，分离的原生质体才能分裂；莴苣只有在分离前于诱导愈伤组织的培养基上预培养2 周，分离的原生质体才能分裂。（ 2）材料的灭菌处理除试管苗、愈伤组织、培养细胞不用灭菌外，其他材料均需灭菌。如果以叶片和子叶为游离原生质体的起始材料， 则需去上表皮， 即叶片晾干后用解剖镊子撕去上表皮。应将去表皮的一面朝下放入酶液中，或用解剖刀切成小

8、细条加入酶液中。（ 3）酶解处理植物材料与酶液按一定的比例混合，一般每克材料加10 20 mL酶液。叶片需要酶液较少，而悬浮细胞需要酶液较多。加入酶液后，在25 C 条件下，静止于黑暗中酶解，并间隔轻摇。 如果起始材料为悬浮培养细胞或愈伤组织，则需在低速摇床上摇动酶解。酶解过程中应经常观察、检查，并及时调节渗透压，避免原生质体破裂或萎缩。5. 原生质体的收集和纯化原生质体纯化最常用的方法是过滤和离心相结合（见图7.5 ），分离纯化后获得原生质体。图 7.6 为紫花苜蓿叶片分离纯化的原生质体。原生质体混合液40100 m收集滤液500 r/min去上清过滤15 min500 r/min培养基50

9、0 r/min 洗液重悬原去上清重悬原生质体去上清生质体15 min15 min重复 3次重复 3次加培养基使原生质体密度为1×104 1×106 个/mL图 7.5原生质体收集纯化流程图图 7.6 紫花苜蓿叶片分离纯化的原生质体（引自 Levée， et al ， 2003）6. 原生质体活力鉴定一般采用FDA染色法（荧光素双醋酸酯）鉴定原生质体有无活力。取纯化后的植物原生质体悬浮液0.5 mL置于小试管中，加入含2 mg/L FDA的丙酮溶液，使最终浓度变为0.01%，混匀，放置5 分钟。用荧光显微镜观察（激发光滤光片QB-24、压制滤光片JB-8 ），有活力

10、原生质体发绿色荧光，不产生荧光为无活力。对于叶肉、子叶、下胚轴而言，由于叶绿素的关系， 原生质体发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。此外，还可用细胞壁染色法来鉴定活力（许智宏，卫志明，1997）。第三节植物原生质体培养一、原生质体培养基的选择原生质体培养基与细胞培养基相似，在细胞培养基上进行改良。禾谷类植物原生质体的培养基多以 MS、 N6 等为基本培养基；十字花科和豆科则多为 B5、 KM、 K8p、 KM8p；茄科的基本培养基为 MS、 NT、 K3（许智宏，卫志明， 1997）。2.渗透压稳定剂培养基中常加一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定性。常用的稳定剂为甘露醇、

11、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖。研究表明，葡萄糖是原生质体培养最理想的渗透压稳定剂和碳源，有利于原生质体的生长、细胞壁的再生、再生细胞的分裂和细胞团的增殖，并维持细胞的持续分裂直至形成细胞团，使用浓度为0.4 0.5 mol/L。但随着细胞壁的再生和细胞的持续分裂，渗透剂的浓度需不断降低才有利于培养物的生长。一般通过添加新鲜培养基的方法，每12 周使渗透剂的浓度降低0.05 0.1 mol/L。3.无机盐用于原生质体培养的培养基中，大量盐浓度应比细胞培养的培养基低。大量元素中钙离子和 NH 4 对原生质体培养影响最大，较高的钙离子可提高原生质体的稳定性。因此， 在很多植物培养中用 1/2 MS

12、培养基（钙离子保持MS 培养基中原有浓度） 。氮源是植物生长不可缺少的营养，但研究发现，高浓度的NH 4对原生质体生长发育不利。 Upadhya（ 1975）首先报道，NH 4 抑制马铃薯原生质体的生长。Von Arnold 和 Erikson（1977 ）证明，当 NH 4 的浓度高于2 000 mg/L 时，可使豌豆的原生质体致死；Oka 和 Ohyana（1985 ）在构树原生质体培养中发现，高浓度的NH 4 使原生质体坏死，只有把MS培养基中的 NH4和 NO3 浓度降到200 mg/L 时，原生质体才能正常发育。因此，很多原生质体培养中常采用有机氮氮源取代铵盐。但在小麦原生质体培养中

13、，起始培养基中的NH 4 较低，在添加新鲜培养基时适当增加NH 4 N，可促进细胞分裂和提高植板率。所以，培养基中氮源种类和浓度应依植物种类和材料经试验后确定。4.有机物在原生质体的培养基中添加一定量的ABA、多胺类、对甲氧基苯甲酸、小牛血清、活性炭、酵母提取物和椰乳等， 对促进细胞分裂和胚状体形成都有良好作用。培养基 pH值为 5.6 5.8 。5.激素植物激素是原生质体培养的重要因素。激素种类和浓度因培养物种而异。但总的而言，生长素和细胞分裂素是必需的，而且在不同生长发育阶段（起始阶段， 细胞团形成、愈伤组织形成以及器官发生、胚状体发生及发育成苗阶段），需不断适时调整激素的种类和浓度。培养

14、基中加2，4-D 可促进细胞启动分裂、持续分裂和愈伤组织形成，有时需将2，4-D与 NAA或 BA 或 ZT 配合使用，才有利于原生质体的发育（见图7.7 ）。随着培养进程，愈伤组织转入分化培养基时，应逐渐降低2， 4-D 或去除 2， 4-D，降低 NAA或用 IAA 取代，并适量增加 BA或 ZT 浓度以促进芽的分化。0.38M glucose+Kao0.45M glucose+HbMix+Hb0.38M glucose+Hb0.45M glucose+KaoMix+Kao0.38M glucose+Kao0.45M glucose+HbMix+Hb00.511.522.533.544.5

15、0.38M glucose+Hb周5 种不同碳源和2 种生长调节物质的MS基本培养基处理，碳源为葡萄糖（0.38 M ，0.4 M ， 0.45 M和 0.6 M ）或葡萄糖0.4M、蔗糖 0.09M 和甘露醇 0.1M 混合液。生长0.45M glucose+Kao调节物质为 Hb： 2 mg/L NAA， 0.5 mg/L 2， 4-D ，0.5 mg/L zeatin ；Kao： 1 mg/L NAA，0.2 mg/L 2，4-D，0.5 mg/L BA（ Kao，et al ，1975）。原生质体最佳发育的组合为Mix+Kao0.45Mglucose Hb 和 0.38M glucos

16、e Kao， 4 周后 20% 以上原生质体发育成细胞团。图 7.7 碳源和生长调节剂对紫花苜蓿原生质体发育的影响（引自 Levée， et al ， 2003）二、原生质体培养方法1. 固体培养法固体培养法是指纯化后悬浮在液体培养基中的原生质体悬液与热融并冷却至45 C的含琼脂糖的培养基等量混合，并迅速轻摇，混匀，冷却后原生质体被埋在固体培养基中。这种方法的优点是便于定位观察、追踪单个原生质体再生细胞的发育进程，避免细胞间有害代谢产物的影响。琼脂糖是一个良好的培养基凝胶剂，可促进原生质体再生细胞的分裂。2. 液体培养法常用液体浅层培养法和悬滴培养法。液体浅层培养法是将原生质体悬浮液

17、 2 3 mL于三角瓶或培养皿中培养， 初期每天轻轻摇动 2 3 次，以防止原生质体沉积皿底。 这种方法的优点是操作简便， 对原生质体伤害小；缺点是不易定位观察原生质体， 而且分布不均匀， 易造成局部原生质体密度过高或粘聚， 影响再生细胞的分裂和进一步生长发育。悬滴培养法指用刻度滴管取原生质体培养液以 50100 L 的小滴分开接种在无菌干燥的培养皿皿盖“反面”上，且以滴间不相碰为准，底皿加保湿液，将皿盖盖于底皿上，封口培养。这种方法的优点是材料少，生长快，不易污染，易加入培养基，有利于低密度培养；缺点与液体浅层培养法相同（许智宏，卫志明， 1997）。3. 固液结合培养法固液结合培养法即双层

18、培养法， 指在底皿先铺一层固体培养基， 其上进行原生质体的液体浅层培养。4. 念珠培养法念珠培养法是指将含有原生质体的琼脂糖培养基切成块，放在体积大的液体培养基中，并在旋转摇床上进行振荡的培养方法（Shillit， et al， 1983）。三、原生质体再生植株1.通过器官形成途径再生植株原生质体培养植株再生多数是通过器官形成途径再生植株。特别是在双子叶植物中，茄科、菊科和十字花科的大多数以及豆科的相当一部分种的原生质体培养，都通过器官形成途径再生植株。 由原生质体培养到器官分化直至形成完整植株，每一培养阶段所需培养基不同，一般需要三种培养基，即原生质体培养基、分化培养基和生根培养基，而且培养

19、基不同，激素成分和渗透压也随之改变。（ 1）原生质体培养基原生质体培养基用来促进原生质体再生细胞壁和单细胞分裂，形成细胞团或小愈伤组织。培养基内通常含有植物激素、糖类物质、 无机盐和维生素，还应含有维持原生质体稳定性的渗透压调节物质，如甘露醇、山梨醇或葡萄糖等。（ 2）分化培养基分化培养基主要用来诱导芽的形成， 不再含有渗透压调节物质， 而且应降低生长素浓度，同时加入较高浓度细胞分裂素。 如果原生质体开始阶段在液体或软琼脂或琼脂糖培养基中培养，则此时应转到用琼脂、琼脂糖或Gelrite固化的培养基上（许智宏，卫志明，1997）。（ 3）生根培养基生根培养基用以诱导再生苗生根，再生完整植株。对多数植物而言，培养基内生长素（ IAA 、NAA或 IBA）浓度通常较低，不含细胞分裂素。对某些植物而言，根的诱导无需添加任何植物激素。2. 通过胚胎发生途径再生植株植物原生质体培养通过胚胎发生途径再生植株的植物种类，主要集中在禾本科、伞形花科、芸香科、葫芦科和豆科中的一部分（尤其是豆科牧草，如紫花苜蓿，见图7.8 ）等。而茄科植物中绝大多数种原生质体培养通过器官途径再生植株，仅有少数种通过体细胞胚胎途径再生植株。植物由原生质体培养到诱导体细