流式细胞术及其应用

1、 第 一 部 分流式细胞术的一般介绍FACSCaliburBD LSRFACS Vantage DiVa BD Biosciences ：10,000cells/second or more FACSAriaFACSCalibur细胞结构细胞功能激光光源氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以633nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhoda

2、mine 6G水溶液的染料激光器,则可得到550650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。Longpass Shortpass Bandpass460 500 540460 500 540460 500 540光收集系统：滤光片 光收集系统：光电倍增管（光收集系统：光电倍增管（PMT）荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光一般由光电倍增管（PMT）检测。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。FACSCalibur 光路图液流系统：流动

3、室、液流驱动系统液流系统：流动室、液流驱动系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱为了保证液流是稳液，一般限制液流速度10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。细胞分选系统488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector细胞分选系统

4、不同分选系统信号检测u 液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射后,我们可以接收到两种光信号第一种 散射光 受到激光照射会向立体角为2的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关.u 第二种 荧光荧光染料在激光的激发下,发荧光可显示出研究对象的相关信息.荧光信号主要包括两部分：自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。小角散

5、射又称前向角散射光光它反应细胞的相对大小和截面积的大小,一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系 ；侧向角散射又称90度角散射光代表细胞的颗粒度和精细结构的变化.FSC荧光Laser自发荧光特异荧光特异荧光能量级激发激发态发射激光能量损失单参数直方图（Histogram）二维等高图和密度图Pseudo 3D Plot3D Plot Dot Plot便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式光谱交叉Emission wavelength (nm) 530 580 630

6、 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY54 colors - simultaneous collection两色以上荧光分析存在 光谱交叉荧光补偿荧光补偿方法方法所有补偿调为“0”调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿 样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞 悬液 标记荧光抗体检测表型测定细胞分选流式细胞术操作流程统计学 分析继续培养 细 胞 周 期 分 析上机去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用 圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡圈门去除粘连体，分析细胞周期细胞凋亡分析 H2O2诱导成神经瘤细胞的凋亡照片，蓝色为细胞核，

7、绿色是凋亡细胞。 A.K. Stout and J.T. Greenamyre, Emory University 细胞凋亡u首先出现的是染色质的浓缩, 导致致密的、分离的、边界清晰的半月形的染色质颗粒集中于核膜边缘;u随后染色质浓缩过程伴随有核膜及细胞膜的内陷, 接着核碎裂成分离的片段, 胞浆浓缩, 细胞支架断裂,这些片段被细胞膜包裹;u 跟着出现的是凋亡细胞断裂成若干个有完整包膜包裹的凋亡小体(apoptosis body) , 小体的大小及其内容差异甚大, 大部分含有若干核片段, 少数可能没有核片段。细胞核染色体局部凝聚细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻染色体局部凝聚引自 http:/ 缺乏IL3诱

8、导的细胞凋亡Michael G. Ormerod Journal of Immunological Methods 265 (2002) 73 80双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞检测淋巴细胞引起的细胞毒作用检测淋巴细胞引起的细胞毒作用细胞毒性淋巴细胞（包括细胞毒性T细胞CTL和自然杀伤细胞NKC）能释放包含穿孔素蛋白和颗粒酶的颗粒或通过Fas-Fas连接作用于靶细胞，引起靶细胞内Caspase酶激增，导致细胞死亡包括凋亡。具有重大研究和应用价值。通常测定淋巴细胞介导的细胞毒性作用，用同位素51Cr，操作复杂危险而且不利于单

9、细胞分析。流式细胞术测定细胞毒作用(FCC)，利用Caspase专一性荧光底物测定受害细胞的细胞毒作用强度。准确简便迅速。 The FCC assay provides rapid and sensitive detection of NK cell cytotoxicity. TFL2-labeled Jurkat cells were incubated with the NK cell line NK92 at an E/T ratio of 51 for the time indicated in the presence of the caspase 6 substrate. Sig

10、nificant cytotoxicity(50%) was detected as early as 20 min.From: Methods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed.Edited by: T. S. Hawley and R. G. Hawley . Humana Press Inc., Totowa, NJ The detection of NK92-mediated killing of breast carcinoma target cell lineMDA-MB-468 cells using b

11、oth flow cytometry (A,B) and confocal microscopy (C,D).Target cells were labeled with TFL2 and incubated without (A,C) or with (B,D) NK92cells for 2 h in the presence of caspase 6 substrate. Nonapoptotic target cells are red; apoptotic target cells have both red and green fluorescence signalsand the

12、refore appear yellow.u部分书籍及杂志部分书籍及杂志：uMethods in Molecular Bology : Flow Cytometry ProtocolsEdited by M J Jaroszeskl and R Heller 63 Humana Press Inc , Totowa, NJuMethods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed.Edited by: T. S. Hawley and R. G. Hawley . Humana Press Inc., Totowa, NJuC

13、ytometry International Society for Analytical Cytology u部分流式细胞术研究中心部分流式细胞术研究中心：uADARC core facilities Peter Lopez uARUP (Associated Regional and University Pathologists)Laboratories, Utah Carl Wittwer uBowling Green State University center for Algal Microscopy and Image Digitization uCenter for Platelet Function Studies Alan D.Michelson uCooper Hospital / UMC (New Jersey) Phil McCoy - Roy Overton uCornell University