生化大实验--AKP(碱磷酶)的表达与纯化

1、AKPAKP的表达与纯化的表达与纯化20082008年春季学年年春季学年研究生班研究生班佟丽佟丽一、一、AKPAKP简介简介大肠杆菌碱性磷酸酶大肠杆菌碱性磷酸酶( (也称大肠杆菌碱性磷酸酯酶，也称大肠杆菌碱性磷酸酯酶， E. E.colicoli alkaline phosphatase alkaline phosphatase，简称，简称AKP/ALPAKP/ALP，EC.3.1.3.1) EC.3.1.3.1) ，在碱性环境下能水解多种磷酸单酯化，在碱性环境下能水解多种磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。 AKPAKP三维结构模拟图三维结构模拟图碱

2、性磷酸酶的不同分子状态碱性磷酸酶的不同分子状态 碱性磷酸酶的理化性质碱性磷酸酶的理化性质沉降系数沉降系数( (单体单体) )沉降系数沉降系数( (二聚体二聚体) )沉降系数沉降系数( (四聚体四聚体) )固有粘度固有粘度电泳迁移率电泳迁移率等电点等电点等离子点等离子点摩擦比率摩擦比率MWwMWwMWzMWzMWMWZ+1Z+1吸光率吸光率(278nm for 1mg/ml(278nm for 1mg/ml) )激活剂激活剂抑制剂抑制剂热稳定性热稳定性6.0 at pH8.06.0 at pH8.06.26.2S S9.69.6S S3.4cm3.4cm3 3/g/g3.33.31010-5-5

3、cmcm2 2/V sec at pH7.6/V sec at pH7.6pH 4.5pH 4.5pH 6.3pH 6.31.051.05(67-98)(67-98)10103 3 at pH8.0 at pH8.0(88-99)(88-99)10103 3 at pH8.0 at pH8.0(86-110)(86-110)10103 3 at pH8.0 at pH8.00.720.72MgMg2 2+ +，MnMn2+2+，ZnZn2+2+，CaCa2+2+氰化物氰化物, , 焦磷酸盐焦磷酸盐8585加热加热3030分钟仍保留活性，分钟仍保留活性，MgMg2+2+存在时可增加酶的热稳定存在

4、时可增加酶的热稳定性性二、蛋白纯化常用技术二、蛋白纯化常用技术1. 1. 破碎破碎 机械法、溶胀和自溶、化学处理、生物酶降解机械法、溶胀和自溶、化学处理、生物酶降解2. 2. 分分 离离 纯纯 化化 沉淀：盐析、有机溶剂、聚乙二醇、加热沉淀：盐析、有机溶剂、聚乙二醇、加热 层析：层析：离子交换、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析、 金属螯合层析、金属螯合层析、吸附层析、分配层析等吸附层析、分配层析等 离心、超滤等离心、超滤等3. 3. 浓浓 缩缩 的的 方方 法法 沉淀法、吸附法、超滤法、透析法、减压蒸馏法、沉淀法、吸附法、超滤法、透析法、减压蒸馏法、 冷冻干

5、燥法冷冻干燥法4.4. 测测 定定 方方 法法 光谱法：光谱法： 吸收光谱法（直接测定法、比色法）、荧光吸收光谱法（直接测定法、比色法）、荧光法、浊度法、荧光光谱技术、红外光谱技术等法、浊度法、荧光光谱技术、红外光谱技术等 电化学法、生物活性检测法、免疫分析法、生物传感电化学法、生物活性检测法、免疫分析法、生物传感器法器法5. 5. 鉴鉴 定定 方方 法法 电泳：琼脂糖电泳、聚丙烯凝胶电泳电泳：琼脂糖电泳、聚丙烯凝胶电泳 免疫分析：凝集反应、免疫扩散、固相免疫吸附、免疫分析：凝集反应、免疫扩散、固相免疫吸附、 免疫印迹等免疫印迹等 色谱：气相色谱、高压液相色谱、质谱色谱：气相色谱、高压液相色谱

6、、质谱 特定的化学反应、特定的化学反应、PCRPCR、生物芯片、生物芯片、DNADNA测序、测序、 DNADNA重组杂交技术、表型变化等重组杂交技术、表型变化等6.6. 标记技术标记技术7. 7. 实验数据的测量、记录、处理与分析实验数据的测量、记录、处理与分析8. 8. 试剂的配制与保存试剂的配制与保存9. 9. 样品的保存与处理样品的保存与处理三、三、AKPAKP表达纯化表达纯化实验设计实验设计表达菌体超声破碎表达菌体超声破碎高速离心去沉淀高速离心去沉淀离子交换层析粗分离离子交换层析粗分离加热除杂加热除杂, ,高速离心高速离心硫铵沉淀富集硫铵沉淀富集分子筛层析进一步分离分子筛层析进一步分离

7、透析浓缩透析浓缩培养表达，收集菌体培养表达，收集菌体纯化监测纯化监测OD280OD280比活力比活力SDS-PAGESDS-PAGE紫外监测紫外监测浓度测定浓度测定纯化方案的评估纯化方案的评估组分组分体积体积mLmL蛋白蛋白mg/mLmg/mL总蛋总蛋白白 mgmg活力活力U/mLU/mL总活总活力力 U U比活力比活力U/mgU/mg提纯提纯倍数倍数回收回收率率1 1100100留样！体积测定！留样！体积测定！培养、表达与菌体收集培养、表达与菌体收集1. 1.预培养：预培养：挑一单菌落至挑一单菌落至 30mL 30mL LBLB液体培养基液体培养基( (含含50g/mL50g/mL Carb

8、) Carb)，3737、190rpm190rpm振荡培养过夜；振荡培养过夜；2.2.扩大培养：扩大培养： 取取2mL2mL3mL3mL预培养菌液至预培养菌液至300mL TM300mL TM培养基中培养基中( (含含50g/ml 50g/ml Carb)Carb)，3737、250rpm250rpm振荡培养振荡培养3434小时小时3. 3. 诱导表达：诱导表达：加入加入IPTGIPTG（终浓度：（终浓度：50mol/L 50mol/L ），），2525、250rpm250rpm振荡培振荡培养养12121616小时小时4. 4. 收菌：收菌： 44，6000rpm6000rpm10min10m

9、in， 2020保存菌体沉淀保存菌体沉淀注意：平衡！注意：平衡！充分弃上清！充分弃上清！细胞破碎细胞破碎w加入加入30 mL30 mL BufferB BufferB，重悬菌体；，重悬菌体；w超声破碎：超声破碎：输出功率输出功率1200W1200W，超声，超声2 2秒，间隔秒，间隔1010秒，超声秒，超声4040次；次；w12,000rpm 412,000rpm 420min20min，留取上清至一新管。，留取上清至一新管。w取上清取上清200 uL200 uL加入加入200 uL200 uL 甘油（甘油（号样品号样品），），2020保存备用；保存备用；注意冰浴冷却注意冰浴冷却注意配平！注意配

10、平！量量体体积积上样：上样：将离心上清以将离心上清以0.5mL/min0.5mL/min的流速连续地加入已平的流速连续地加入已平 衡好的衡好的DEAE-FFDEAE-FF层析柱中层析柱中, , 每管接收每管接收3 mL3 mL；洗涤：洗涤：用用40 mL40 mL Buffer B Buffer B洗涤杂蛋白洗涤杂蛋白 流速：流速：1 1mLmL/min/min，每管接收，每管接收3 mL3 mL；洗脱：洗脱：用用200 mL200 mL Buffer B Buffer B其中含其中含0 00.3mol/L 0.3mol/L 的连续的连续 NaClNaCl梯度洗脱梯度洗脱AKPAKP 流速：流

11、速：1 1mLmL/min/min，每管接收，每管接收3 mL3 mL收集：收集：收集有活性的收集有活性的AKPAKP， 取取200 uL200 uL加入加入200 uL200 uL 甘油甘油 （号样品号样品），）， 2020保存备用保存备用DEAE-FF离子交换层析离子交换层析？量量体体积积热变性：热变性：8080，水浴，水浴30min30min 4 4 ， 12000rpm 12000rpm20min20min 留留上清上清硫铵沉淀：每硫铵沉淀：每100mL100mL AKPAKP溶液溶液 + + 加入加入6060克固体硫酸铵克固体硫酸铵 溶解后静置溶解后静置1010分钟，分钟，10000

12、rpm10000rpm10min10min 充分充分弃弃上清上清，沉淀，沉淀-20 -20 保存，备用。保存，备用。浓缩浓缩IIIIII号样品号样品的制备：取此步上清的制备：取此步上清200L200L，加入，加入200L200L甘甘油，混匀，油，混匀，-20 -20 保存保存量量体体积积沉淀溶解：沉淀用沉淀溶解：沉淀用0.5mL0.5mL左右左右Buffer ABuffer A充分溶解充分溶解， 10000rpm10000rpm10min10min，留留上清上清 分子筛层析：分子筛层析： 将上述离心上清上样、洗脱（将上述离心上清上样、洗脱（Buffer ABuffer A） 洗脱流速为洗脱流速

13、为15 mL15 mL/ /小时，每管接收小时，每管接收2 mL2 mL透析浓缩：合并光吸收及酶活高峰管透析浓缩：合并光吸收及酶活高峰管 Buffer CBuffer C透析浓缩透析浓缩4 4小时小时 分装分装-20-20保存备用保存备用( (号样品号样品) )Sephacyl S-200 HR分子筛层析分子筛层析IVIV号样品号样品制备：制备：取取50uL50uL离心上清离心上清+ +150150uL BufferBuL BufferB+200uL+200uL甘油甘油 混匀，混匀，-20-20保存备用保存备用量量体体积积量量体体积积pNPpNP （对硝基酚）（对硝基酚）pNPPpNPP（对硝

14、基酚磷酸）（对硝基酚磷酸）410nm410nm测定测定ODOD值值无色无色PiPi黄色黄色Na3PO4A = （）C LpNP的摩尔消光系数的摩尔消光系数（）：）： 17500 mol-1Lcm-11. 1. LB LB培养基培养基( (预培养用培养基预培养用培养基) 30mL/) 30mL/班班 胰蛋白胨胰蛋白胨 0.3 g0.3 g 酵母提取物酵母提取物 0.15 g0.15 g 氯化钠氯化钠 0.3 g0.3 g5mol/L NaOH5mol/L NaOH调调pHpH至至7 78 8（经验值：（经验值：200ul200ulL L） 蒸馏水定容至蒸馏水定容至30mL30mL 2.2. TM

15、 TM培养基培养基( (表达培养基表达培养基) 300mL/) 300mL/组组 胰蛋白胨胰蛋白胨 3.6 g3.6 g 酵母提取物酵母提取物 7.2 g7.2 g 氯化钠氯化钠 3.0 g3.0 g 甘油甘油 1.8mL 1.8mL 用用1mol/L Tris1mol/L Tris调调pHpH至至7 78 8（经验值：（经验值： 9.3mL9.3mLL L） 蒸馏水定容至蒸馏水定容至300mL300mL溶液配制溶液配制3.3. Buffer A pH 8.5 1000mL/ Buffer A pH 8.5 1000mL/组组 Tris-HCl 50 mmol/LTris-HCl 50 mmo

16、l/L NaClNaCl 0.2mol/L0.2mol/L EDTA 0.5mmol/L EDTA 0.5mmol/L4.4. Buffer B pH 8.5 1000 Buffer B pH 8.5 1000mL /mL /组组 Tris-HCL 50mmol/L Tris-HCL 50mmol/L EDTA 1mmol/L EDTA 1mmol/L MgAcMgAc2 2 2mmol/L 2mmol/L 5.5. NaOH 0.5mol/L (NaOH 0.5mol/L (4040mL/mL/组组) ) 降低蛋白与介质降低蛋白与介质的非特异性结合的非特异性结合溶液配制溶液配制6.6.考马斯

17、亮蓝溶液考马斯亮蓝溶液 500mL 500mL 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250 50mgG-250 50mg溶于溶于 25mL95%25mL95%乙醇中，乙醇中， 加入加入 50mL85%50mL85%磷酸磷酸, , 加水至加水至500mL500mL，滤纸过滤（，滤纸过滤（棕色瓶棕色瓶）7.7. 1mg/mL BSA 10 mL 1mg/mL BSA 10 mL（全班）（全班） 10 mg BSA10 mg BSA用用Buffer ABuffer A溶解，溶解，10 mL 10 mL 容量瓶定容容量瓶定容溶液配制溶液配制溶液配制溶液配制8.8. 测活液测活液pH 8.5pH 8.5 100mL

18、100mL 50 mmol/L Tris-HCl 50 mmol/L Tris-HCl 0.2mg/mL BSA 0.2mg/mL BSA 10mmol/L pNPP 10mmol/L pNPP 2mmol/L 2mmol/L MgAc MgAc2 29.9. 终止液终止液 500mL500mL10.10. Buffer C 600 Buffer C 600 mLmL11.11. 30% 30%胶贮液胶贮液 300mL300mL （棕色瓶，棕色瓶，44室温保存室温保存) ) 每每100mL100mL中含丙烯酰胺中含丙烯酰胺29.2g29.2g，亚甲基双丙烯酰胺，亚甲基双丙烯酰胺0.8g0.8g

19、， 溶解后溶解后过滤过滤12.12. 分离胶缓冲液分离胶缓冲液200mL200mL ： 1.5mol/L Tris-HCL pH 8.8 1.5mol/L Tris-HCL pH 8.8 （44室温保存）室温保存）13.13. 浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液100mL100mL ： 0.5mol/L Tris-HCL pH 6.8 0.5mol/L Tris-HCL pH 6.8 （ 44室温保存）室温保存）14.14. 10% 10%（m/Vm/V）过硫酸铵）过硫酸铵 10mL10mL （ 分装，分装， 2020室温保存室温保存）15.15. SDS SDS电泳缓冲液电泳缓冲液 500mL500m

20、L （ （全班（全班, , 室温保存室温保存） 25mmol/L Tris 25mmol/L Tris，0.192mol/L Gly0.192mol/L Gly，0.1%(W/V)SDS0.1%(W/V)SDS溶液配制溶液配制下周实验内容下周实验内容分子筛层析分子筛层析浓缩保存浓缩保存纯化参数测定纯化参数测定纯化方案的评估纯化方案的评估组分组分体积体积mLmL蛋白蛋白mg/mLmg/mL总蛋总蛋白白 mgmg活力活力U/mLU/mL总活总活力力 U U比活力比活力U/mgU/mg提纯提纯倍数倍数回收回收率率1 1100100管号管号测活液测活液（uLuL）酶稀释酶稀释液（液（uLuL）AKPA

21、KP（uLuL）30300 0C C反应反应10min10min终止液终止液（mLmL）1 136036040400 03.63.62 23603600 040403.63.6组份组份稀释倍数稀释倍数A A410410A A410410平均值平均值活力活力U UmLmL样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品酶活测定酶活测定组份组份稀释倍数稀释倍数A A595nm595nmA A595nm595nm平均值平均值蛋白浓度蛋白浓度mg/mLmg/mL样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品管号管号1 12 23 34 45 56 67 7标准蛋白溶液标准蛋白溶液uLuL0 010102020303

22、0404050506060H H2 2O uLO uL100100909080807070606050504040考马斯亮兰考马斯亮兰G-G-2502505mL5mL摇匀摇匀,1h,1h内以内以1 1号试管为空白对照号试管为空白对照, ,在在595nm595nm处比色处比色A A5955950 00 0平均值平均值0 0 蛋白浓度的测定蛋白浓度的测定未完，待续未完，待续预习碱性磷酸酶分离纯化实验内容预习碱性磷酸酶分离纯化实验内容实实 验验 误误 差差准确度：准确度：准确度表示实验分析测定值与真实值相接近的程度。准确度表示实验分析测定值与真实值相接近的程度。误差：误差：测定值与真实值之间的差值为

23、误差。包括绝对误差和相对误差。测定值与真实值之间的差值为误差。包括绝对误差和相对误差。 误差愈小，测定值愈准确，即准确度愈高。误差愈小，测定值愈准确，即准确度愈高。绝对误差：绝对误差：测定值与真实值之差。测定值与真实值之差。相对误差：相对误差：绝对误差在真实值中所占的百分率。绝对误差在真实值中所占的百分率。精确度和偏差：精确度和偏差：精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近的程度。一般用偏差来衡量分析结果的精确度。的程度。一般用偏差来衡量分析结果的精确度。偏差：偏差：绝对偏差、相对偏差。绝对偏差、相对偏差。误误 差差 来来 源源 1 1、系统误差（、系统误差（可测误差可测误差）：）：测定过程中，某些经常发生的原因所造成的，它对测定结果的影响比较稳定，测定过程中，某些经常发生的原因所造成的，它对测定结果的影响比较稳定，在同一条件下重复测定中常重复出现，使测定结果不是偏高，就是偏低，而在同一条件下重复测定中常重复出现，使测定结果不是偏高，就是偏低，而且大小有一定规律，它的大小与正