生物大分子识别分离和检测

1、生物大分子的生物大分子的识别、分离和检测识别、分离和检测生物大分子生物大分子生物大分子生物大分子: : 指分子量大于10,000，有复杂空间结构，具有生物活性的物质；如多肽、蛋白质、酶等。特性：特性： 具有特定的生化结构（组成，序列和构象） 分子量大，分子极性强 对温度、pH值、剪切力、有机溶剂等非常敏感生物大分子的识别生物大分子的识别 “看清看清”生物大分子生物大分子“是谁是谁”； “看清看清”生物大分子生物大分子“是什么样子是什么样子”。 质谱测定分析质谱测定分析 一种识别生物大分子的方法一种识别生物大分子的方法 质谱测定分析法是通过测定样品中物质的质量来识别物质谱测定分析法是通过测定样品

2、中物质的质量来识别物质的类别。质的类别。 传统的质谱分析方法是：传统的质谱分析方法是： 首先将成团的蛋白质分子拆分成各自独立的单个分子，首先将成团的蛋白质分子拆分成各自独立的单个分子，将其电离并使之悬浮在真空中，然后让它们在电场作用下运将其电离并使之悬浮在真空中，然后让它们在电场作用下运动。动。 这种方法的缺点在于生物大分子比较脆弱，在拆分和电这种方法的缺点在于生物大分子比较脆弱，在拆分和电离成团的生物大分子过程中它们的结构和成分很容易被破坏。离成团的生物大分子过程中它们的结构和成分很容易被破坏。美国科学家约翰美国科学家约翰芬恩，获芬恩，获20022002年年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖日本科学家

3、田中日本科学家田中耕一，获耕一，获20022002年年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖对成团的生物大对成团的生物大分子施加强电场分子施加强电场用软激光轰击成用软激光轰击成团的生物大分子团的生物大分子使生物大分子相互完整地分离，同时也被电离使生物大分子相互完整地分离，同时也被电离。芬恩的电喷雾质谱技术（芬恩的电喷雾质谱技术（ESIESI）原理图）原理图田中耕一的软激光解吸附质谱技术田中耕一的软激光解吸附质谱技术（RLD）原理图）原理图质谱测定方法解决了质谱测定方法解决了“看清看清”生物大分子生物大分子“是谁是谁”的问题的问题电喷雾电喷雾质谱质谱法法electron spray mass spectrom

4、etry ESMSelectron spray mass spectrometry ESMS 样品溶液经很细的进样管进入电喷雾室，在强电场的样品溶液经很细的进样管进入电喷雾室，在强电场的作用下，样品溶液在出口处因电荷的分离和静电引力而破作用下，样品溶液在出口处因电荷的分离和静电引力而破碎成许多细小的带有电荷的液滴，当液滴蒸发到某一程度，碎成许多细小的带有电荷的液滴，当液滴蒸发到某一程度，液滴表面的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续液滴表面的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续此过程。随着液滴的水分子逐渐蒸发，就可获得自由徘徊此过程。随着液滴的水分子逐渐蒸发，就可获得自由徘徊的质子化和

5、去质子化的蛋白分子。的质子化和去质子化的蛋白分子。 电喷雾液相色谱质谱联用仪电喷雾液相色谱质谱联用仪 样品的分子离子和裂片离子经一系列分离器和静电透样品的分子离子和裂片离子经一系列分离器和静电透镜进入质量分析器进行质谱分析。镜进入质量分析器进行质谱分析。 这种电喷雾质谱法具有很高灵敏度，且电离的分子可这种电喷雾质谱法具有很高灵敏度，且电离的分子可以带有多电荷，这种多电荷离子的产生大大扩展了普通质以带有多电荷，这种多电荷离子的产生大大扩展了普通质谱仪能分析的质量范围，使质谱仪可以分析分子量为几十谱仪能分析的质量范围，使质谱仪可以分析分子量为几十万质量单位的蛋白质分子。精确度达到万质量单位的蛋白质

6、分子。精确度达到99.99%99.99%。 激光解吸附电离飞行时间质谱激光解吸附电离飞行时间质谱 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF MS ） MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS的原理是：当用一定强度的激光照射样品的原理是：当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，样品解与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质吸附，基质- -样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离样品之间发生电荷转移使得样

7、品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质量电荷之比（飞行时间不同而被检测，即测定离子的质量电荷之比（M/ZM/Z）与离子的飞行时间成正比来检测离子。与离子的飞行时间成正比来检测离子。 MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS的中心技术就是依据样品的质荷比（的中心技术就是依据样品的质荷比（m/zm/z）的不同来进行检测，并测得样品分子的分子量。的不同来进行检测，并测得样品分子的分子量。 MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS具有灵敏度高、具有灵敏度高、准确度高、分

8、辨率高、图谱简明、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速度快等特点，在操质量范围广及速度快等特点，在操作上制样简便、可微量化、大规模、作上制样简便、可微量化、大规模、并行化和高度自动化处理待检生物并行化和高度自动化处理待检生物样品，而且在测定生物大分子和合样品，而且在测定生物大分子和合成高聚物应用方面有特殊的优越性。成高聚物应用方面有特殊的优越性。近年来已成为检测和鉴定多肽、蛋近年来已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强有力聚物以及多种合成聚合物的强有力工具。工具。 激光解吸附电离质谱仪激光解吸附电离质谱仪 在核磁共

9、振技术出现以前，在核磁共振技术出现以前，X X射线晶体分析技术是惟一射线晶体分析技术是惟一可以研究蛋白质三维结构的方法。该法是根据蛋白质结晶对可以研究蛋白质三维结构的方法。该法是根据蛋白质结晶对X X射线的衍射作用实现的。但该法不能对溶液进行分析。射线的衍射作用实现的。但该法不能对溶液进行分析。 核磁共振技术弥补了核磁共振技术弥补了X X射线晶体分析技术的不足，能够射线晶体分析技术的不足，能够对溶液中的蛋白质进行分析，即在蛋白质最自然的生存环境对溶液中的蛋白质进行分析，即在蛋白质最自然的生存环境下对它们进行研究，进而得到下对它们进行研究，进而得到“活活”蛋白质的结构。蛋白质的结构。核磁共振 一

10、种揭示生物大分子真面目的方法 在结晶状态下蛋白质分子是紧紧地积压在一起的，而在在结晶状态下蛋白质分子是紧紧地积压在一起的，而在溶液中它们则处在最自然的生理状态下。溶液中它们则处在最自然的生理状态下。 朊病毒蛋白质分子朊病毒蛋白质分子中肽链有一半（中肽链有一半（23-12023-120）在水溶液中是呈现无规在水溶液中是呈现无规则的、松散的、灵活多则的、松散的、灵活多变的状态。变的状态。应用核磁共振技术测定的应用核磁共振技术测定的朊病毒蛋白质分子结构图朊病毒蛋白质分子结构图 核磁共振法独到之处是测定溶液中的蛋白质，是在最接近分子自然核磁共振法独到之处是测定溶液中的蛋白质，是在最接近分子自然生理状态

11、的条件下进行测定。生理状态的条件下进行测定。 维特里希设计了一套将核磁共振信号与生物大分子维特里希设计了一套将核磁共振信号与生物大分子中的质子相对应的系统分析方法。中的质子相对应的系统分析方法。他他进一步说明这些质进一步说明这些质子间的距离如何确定，再结合距离几何学的数学方法就子间的距离如何确定，再结合距离几何学的数学方法就可获得大分子清晰的三维结构图。可获得大分子清晰的三维结构图。 瑞士科学家瑞士科学家库尔特库尔特维特里维特里希，获希，获2002年诺年诺贝尔化学奖贝尔化学奖 如果确定了一座建筑物的所有工程数据，就可以快速而如果确定了一座建筑物的所有工程数据，就可以快速而准确地绘出该建筑物的三

12、维结构图。准确地绘出该建筑物的三维结构图。 核磁共振技术方法解决了核磁共振技术方法解决了“看清看清”生物大分子生物大分子“是什是什么样子么样子”的问题。的问题。生物大分子的分离与检测生物大分子的分离与检测 生物大分子通常来自天然产物或发酵液中，并以混生物大分子通常来自天然产物或发酵液中，并以混合物、低浓度的状态存在。合物、低浓度的状态存在。 除了分子量大，还具有结构复杂（具三级或四级结除了分子量大，还具有结构复杂（具三级或四级结构），具有生物活性，一旦条件不适合就丧失活性，因构），具有生物活性，一旦条件不适合就丧失活性，因此在分离技术上与一般的小分子有机物的分离有差别。此在分离技术上与一般的小

13、分子有机物的分离有差别。质谱质谱色谱色谱色谱法色谱法 由液相色谱、气相色谱和毛细管电泳等所组成的色谱学由液相色谱、气相色谱和毛细管电泳等所组成的色谱学是现代分离、分析的主要组成部分。是现代分离、分析的主要组成部分。 液相色谱与毛细管电泳技术是目前已知的两种最有效的分液相色谱与毛细管电泳技术是目前已知的两种最有效的分离生物大分子的方法。离生物大分子的方法。 毛细管电泳处理量小，在分离过程中会破坏生物大分子的毛细管电泳处理量小，在分离过程中会破坏生物大分子的构象、降低其生物活性。构象、降低其生物活性。 液相色谱一般在室温下进行，所用流动相为液体，固定相液相色谱一般在室温下进行，所用流动相为液体，固

14、定相的表面经过各种化学修饰，能为生物大分子的分离提供的表面经过各种化学修饰，能为生物大分子的分离提供“软接软接触触”的温和相互作用，因此成为分离生物大分子强有力的手段。的温和相互作用，因此成为分离生物大分子强有力的手段。膜色谱技术膜色谱技术 膜色谱技术是液相色谱与膜分离相结合的一种新技术，融膜色谱技术是液相色谱与膜分离相结合的一种新技术，融合了二者之长，具有快速、高效、高选择性、易于放大等特点，合了二者之长，具有快速、高效、高选择性、易于放大等特点，能满足生物大分子高效分离与纯化的需要。能满足生物大分子高效分离与纯化的需要。 膜色谱采用具有一定孔径的膜作为介质膜色谱采用具有一定孔径的膜作为介质

15、, ,连接配基连接配基, ,利用膜利用膜配基与生物大分子之间的相互作用进行分离纯化。配基与生物大分子之间的相互作用进行分离纯化。 当料液以一定流速流过膜的时，目标分子与膜介质表面或当料液以一定流速流过膜的时，目标分子与膜介质表面或膜孔内基团特异性结合，而杂质则透过膜孔流出，待处理结束膜孔内基团特异性结合，而杂质则透过膜孔流出，待处理结束后再通过洗脱液将目标分子洗脱下来，其纯化倍数可达数百乃后再通过洗脱液将目标分子洗脱下来，其纯化倍数可达数百乃至上千倍。至上千倍。膜色谱特点为膜色谱特点为: :优点：优点： (1)(1)生物大分子在膜介质中以对流传质为主，分离速度生物大分子在膜介质中以对流传质为主，分离速度快，特别适用于生物大分子的快速分离快，特别适用于生物大分子的快速分离 (2)(2)柱压低柱压低 (3)(3)易于放大，只要简单的增加柱长就可以达到目标易于放大，只要简单的增加柱长就可以达到目标 (4)(4)可直接处理复杂的生物样品，几乎不需要与处理可直接处理复杂的生物样品，几乎不需要与处理 (5)(5)膜基质生物兼容性好膜基质生物兼容性好缺点：缺点： (1)(1)柱效低柱效低 (2)(2)耐压性差耐压性差现代分离制备技术课程论文备选题现代分离制备技术课程论文备选题1 1. .物